Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

De traceringstechniek beschreven in dit protocol helpt ons neuronale morfogenese te bestuderen en de connectiviteit in het motorneuronsysteem van Drosophila te breken. De lipofiele kleurstof kan snel verspreiden naar elk deel van het cellulaire membraan met een extreem hoge dichtheid. Dit is de reden waarom ons protocol efficiënt oplost om structuren van een gelabeld neuron te vinden.

Als een axonterminal toegankelijk is met een injectiemicropipet, kan deze techniek worden toegepast op elk neuron in de larve- en volwassen stadia van vliegen of in andere organismen. Als u geen ervaring hebt met ontleden of het gebruik van een microinjector nauwkeurig de werking op het monster, kan een uitdaging zijn. Inzicht in de anatomie van het embryo, zal helpen met begeleiding om een goede portionering van instrumenten uit te voeren dissectie of een dinjection.

Om alle embryo's te starten, voor te bereiden en in te stellen. Bereid het filtratieapparaat voor door een buis van 50 milliliter te snijden en een gat in de dop open te snijden. Stel vervolgens een meshfilter in met 100 micrometer poriën tussen de buis en de dop.

Bereid de kleurstof injectie micropipet en dissectie naald uit dezelfde capillaire buizen met een binnendiameter van 1,2 millimeter. Trek de slang met een micropipet, trekker op 7%van 170 volt maximale output om een scherpe naald te creëren met een versmaling van ongeveer 0,4 centimeter in lengte. Ter voorbereiding van de kleurstof injectie micropipet, weken de molen met een bevochtigingsmiddel en plaats de naald op de micropipet klem op 25 tot 30 graden.

Laat vervolgens de punt op twee derde van de straal uit het midden van het afschuindeoppervlak zakken. Maal de naald terwijl een spuit met slang duwt lucht in. Markeer de micropipet met een fijne punt permanente marker om de positie van de opening aan te geven aan de tip na het afschuinen, omdat het een uitdaging kan zijn om de smalle opening die wordt gevormd onder een hoek te lokaliseren.

Laat de vliegen 's nachts eieren leggen op kamertemperatuur en verzamel de pijp met de eieren in de ochtend. Om de embryo's te verzamelen, dechlorinate de eieren op het bord met 50% bleekmiddel gedurende vijf minuten. Zodra de chlorions zijn gewist, giet de inhoud van de plaat door het filtratieapparaat of de celzeef om de embryo's te isoleren.

Gebruik een knijpfles water om het bleekmiddel op de plaat te verdunnen en verzamel zoveel mogelijk embryo's door het mengsel in het filter te decanteren. Was de embryo's drie tot vier keer met water totdat de bleekmiddelgeur verdwijnt. Haal het filter uit het apparaat en was ze met water op een andere schone plaat.

Decanteer vervolgens het water van de nieuwe plaat waarop de embryo's staan. Gebruik fijne tangen om vijf tot 10 embryo's te selecteren op 15 uur na het leggen van eieren en leg ze op dubbelzijdige tape met de rugzijde naar boven gericht. Voeg insectenring zou zout aan de dissectiepool om de embryo's te beschermen tegen uitdroging.

Gebruik een glazen naald onder een dissectiemicroscoop om het embryo uit het middenmembraan van de tape op het glas te slepen, waarbij u ervoor zorgt dat de binnenweefsels van het embryo niet worden beschadigd. Snijd vervolgens door de middellijn van een enkel embryo op het oppervlak van het achterste naar het voorste uiteinde. Draai de epitheelweefsels vanuit het midden om en bevestig de opperhuidrand op het oppervlak van de glazen schuif.

Gebruik een buis verbonden naald met een tip opening van ongeveer 300 micrometer aan te trekken of blazen lucht om de dorsale lengtetradine boomstammen evenals eventuele resterende ingewanden te verwijderen. Gebruik 4%PFA en PBS om de embryo's vijf minuten op kamertemperatuur te fixeren op een orbitale shaker. Was ze dan drie keer met PBS.

Bevlek de embryo's met één microliter anti mierikswortelperoxidaseantilichaam geconjugeerd met Cyanine3 kleurstof en 200 microliter PBS gedurende een uur op de orbitale shaker. En herhaal de wasbeurten in PBS. Om de injectiemicropipet te vullen, plaats deze in de capillaire houder.

Plaats vervolgens de kleurstof schuiven op het podium en gebruik de micromanipulator om het te plaatsen over de dia. Pas vervolgens het podium aan om de micropipet op de kleurstof te plaatsen. Verzamel de kleurstof in de micropipet door de injectiedruk in te stellen op tussen de 200 en 500 hectopascal, de injectietijd tussen 0,1 en 0,5 seconden en de compensatiedruk op nul gedurende vijf minuten.

Zodra de kleurstof is verzameld, verwijder de kleurstof dia en plaats het monster op de microscoop stadium. Verhoog vervolgens de compensatiedruk tot een bereik van 30 tot 60 hectopascal en verlaag de micropipet in het monster. Gebruik de 10 keer objectieve lens om het embryo te lokaliseren en de micropipet uit te lijnen met het embryo.

Verander de objectieve lens in een wateronderdompeling 40 keer lens. En dompel de lens onder in de PBS. Gebruik fluorescentiemicroscopie om de neuronale morfologie te controleren die wordt gekenmerkt door anti-HRP Cy3 en de injectieplaats te bepalen.

Wanneer het embryo scherp is, verandert de positie van de micropipet om voorzichtig contact te maken met de punt van de axon van belang. Gebruik vervolgens heldere veldmicroscopie tijdens de injectie om de kleurstofdruppel te zien. Laat de kleurstof in het rechter buikhemisegment vallen op de neuromusculaire kruising van aCC of RP3 met DiD of DiO.

Gebruik de handbediening om de kleurstof los te laten en de micropipet te verwijderen. Ga dan naar de volgende injectieplaats. Broed het monster een uur lang bij kamertemperatuur op een orbitale shaker voorafgaand aan de beeldvorming.

Verwijder met behulp van fijne tangen de banden van de glazen schuif. Om het monster te monteren, bereid een deklip met een kleine hoeveelheid vacuümvet op de vier hoeken. Zorgvuldig geplaatst op het monster, zorg ervoor dat luchtbellen te voorkomen.

Druk de afdekslip naar beneden om de ruimte van het monster aan te passen voor het toestaan van werkafstand tussen de objectieve lens en de dia. Verwijder overtollige PBS met taakdoekjes. Sluit de randen van de afdek slip volledig af met nagellak.

Beeld bij 10 keer en 100 keer vergroting met een confocale microscoop en de beelden verwerken, met de imageJ-software. Dit protocol werd gebruikt om retrograde label van de aCC motorneuron innervating spier een en de RP3 motorneuron innervating spieren zes en zeven. Dendritische takken van de ACC en RP3 motorneuronen vertonen een grote overlap.

Beide neuronen zijn bipolair, tot oprichting van twee verschillende populaties van dendrieten. Om de kwantitatieve mogelijkheden van deze methode aan te tonen, werd het totale aantal dendriettips geteld in wilde typen en Dscam1-mutanten. De ipsilaterale dendrieten van aCC worden getoond voor het wilde type, maar weinig ipsilaterale dendrieten werden waargenomen voor de Dscam1 mutant.

Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden dat de grootte van de kleurstof druppel is van cruciaal belang, dat is ongeveer 10 tot 20 micrometer. Test de grootte op de dubbelzijdige tape en breng deze vervolgens aan op de injectieplaats. Met behulp van deze procedure kunnen we profiteren van de foto schakelbare eigenschap van DiD-sonde om superresolutiebeelden van het plasmamembraan te verkrijgen.

Op deze manier kunnen we de ultra structurele karakterisering van de synaptische membranen op de neuromusculaire verbinding bestuderen. We hebben de klik. We voerden fenotypische analyse uit van de aCC-dendrieten in mutantenstam, en ontdekten dat een Dscam1-Dock-Pak-injectie de plaats van de dendrietextgroei in aCC definieert.