Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

Candida albicans biofilms zoals veel biologische exemplaren zijn zwaar doorschijnend tot ondoorzichtig in hun eigen staat. In deze protocollen tonen we aan dat met behulp van verduidelijkingsmethoden de interne structuur van vaste intacte biofilms kan worden afgebeeld door optische sectioning microscopie. Met eenvoudige, goedkope en relatief snelle verwerkingsstappen kunnen vaste intacte biofilms transparant worden gemaakt voor 3D-beeldvorming door confocale scanning fluorescentiemicroscopie.

Het aantonen van deze procedure vandaag zal Katie Lagree, een post-doctorale onderzoeker hier, en ikzelf. Om te beginnen biofilm groei in een 12-well plaat, bereid de plaat zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats de plaat op een 60 RPM orbitale mixer in een bevochtigde 37 graden Celsius lucht incubator gedurende 90 minuten om tijd voor celhechting mogelijk te maken.

Verwijder na 90 minuten de medium en ongebonden cellen en was met steriel medium of PBS. Breng de ingeënte substrata over in een andere multi-well plaat met voorverwarmd filamentatiemedium. Breng de plaat terug naar de 37 graden Celsius bevochtigde omgevingslucht incubator en laat de biofilms tot 48 uur groeien met 60 RPM orbitale menging voor beluchting.

Haal de 48-uurs plaat uit de couveuse en verwijder het kweekmedium uit elk exemplaar. Vervang het medium door PBS en incubeer gedurende enkele minuten om serumeiwitten weg te verdunnen. Na het verwijderen van de PBS, vul de putten met fixatieve.

Aan elk gerecht moet voldoende fixatief volume worden toegevoegd om alle biofilmgroei onder te dompelen, inclusief eventuele aan de binnenzijde van de schotel. Zet de overdekte schotel op een langzame orbitale mixer voor 20 minuten. Na het verwijderen van de fixatieve zoals beschreven in het tekstprotocol, voor te bereiden op vlekken door het afvoeren van de PBS en snel bijvullen van de putten met een oplossing met PBS en de vereiste vlek.

Laat de biofilm niet langer dan een paar seconden uitlekken of drogen. Voeg de vlek toe aan de schotel. De benodigde hoeveelheid vlek is afhankelijk van de biofilmmassa.

Stel vervolgens de overdekte schotel op een langzame orbitale mixer 's nachts en beschermen tegen licht met folie of een stuk zwart papier. Breng met behulp van een pincet de vaste stained biofilm over van PBS naar vijf milliliter 50/50 PBS-methanol in een glasfolie van 20 milliliter met de biofilm naar boven gericht. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van één minuut gedurende vijf minuten.

Verwijder het oplosmiddel naar een afvalfles die voorzichtig is om contact tussen de pipet en biofilm of de biofilm en flacon te voorkomen. Voorzichtig bijvullen met drie milliliter nette methanol. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van één minuut gedurende drie minuten.

Verwijder nu het oplosmiddel in een afvalfles en vul onmiddellijk met vijf milliliter methanol. Na het handmatig mengen met orbitale beweging met intervallen van een minuut gedurende vijf tot 10 minuten, verwijder het oplosmiddel naar de afvalfles. Onmiddellijk bijvullen met drie milliliter methanol.

Biofilms zien er op dit moment vaak ondoorzichtiger uit dan hun eerste verschijning. Verwijder het oplosmiddel in de afvalfles en vul de flacon onmiddellijk bij met vijf milliliter 50/50 methanol-methylbylsalicylaat. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van één minuut gedurende vijf tot tien minuten.

De biofilm moet semi-transparant zijn in dit gemengde oplosmiddel. Na het verwijderen van het oplosmiddel in een afvalfles, vul de flacon voorzichtig met drie milliliter nette methylbylsalicylaat. Meng handmatig met orbitale beweging met intervallen van één minuut gedurende drie minuten.

Herhaal het proces opnieuw met vijf milliliter nette methylzilcylaat, handmatig mengen met een minuut intervallen gedurende vijf tot 10 minuten. Op dit punt moet de biofilm transparant zijn. Verwijder het oplosmiddel in de afvalfles en vul de flacon onmiddellijk bij met drie milliliter keurig methylfcylaat.

De verwerkte biofilm is stabiel in dit oplosmiddel. Gebruik bij gebruik van een omgekeerde microscoop een oplosmiddelbestendige schotel met een coverglass bodem en bereid spacers voor op ondersteuning van het omgekeerde monster. Hier, afstandhouders zijn 13 millimeter siliconen ringen die zijn voorgeweekt in methyyl salicylaat voor een uur om focus drift als gevolg van zwelling te minimaliseren.

Voor een biofilm op een medisch graad siliconen vierkant, omkeren het vierkant en zet het op een spacer in een zwembad van methyyl salicylaat in de schotel. Zorg ervoor dat u bubbels onder het monster vermijdt. Monteer de schotel stevig op het podium van de microscoop en maak olie ondergedompeld contact met het doel.

Pas de hoeveelheid methyylsalicylaat in de schotel aan, zodat de meniscus het monster stevig op de afstandsspanne houdt door oppervlaktespanning. Plaats een druppel methyylsalicylaat bovenop het omgekeerde vierkante substratum om lichtverstrooiing van de matte afwerking te verminderen. Bedek vervolgens de schotel met een glazen plaat om verdamping te beperken.

Wacht enkele minuten tot het monster zich op de afstandshouders nestelt voordat het beeldvorming wordt gemaakt. Voer nu confocale microscopie uit om het monster in beeld te brengen zoals beschreven in het tekstprotocol. Open ImageJ of Fiji om de afbeeldingen te verwerken.

Controleer of het programma voldoende toegewezen geheugen heeft om de gegevens te verwerken. Voor het verwerken van een dataset van twee gigabyte is ten minste acht gigabyte aan speciaal RAM-geheugen vereist voor een soepele werking. Open het te verwerken seriële vlakafbeeldingsbestand.

Als de computer onvoldoende RAM heeft om de hele stapel te verwerken, kunnen substacks worden verwerkt en vervolgens opnieuw worden samengevoegd tot één stapel. Converteer de gegevens naar 32-bits indeling om zwevende puntrekenkundige bewerkingen mogelijk te maken met behulp van het afbeeldingsmenu, het type, 32-bits. Dit verdubbelt de bestandsgrootte.

Trek de vloeiende achtergrond af om het contrast van in-focusfuncties te vergroten. Verwerk de hele stapel door te navigeren naar het procesmenu, trek de achtergrond af. Pas indien nodig de straal van de rollende bal aan.

De balradius moet aanzienlijk groter zijn dan de grootste dimensie van de in-focus functies die behouden moeten blijven. Als u alle negatieve pixels op nul wilt instellen, voegt u elke afbeelding toe aan de absolute waarde. Verdubbel eerst de stapel met behulp van het afbeeldingsmenu, dupliceren, dubbele stapel.

Neem vervolgens de absolute waarde van de gedupliceerde gegevens met behulp van procesmenu, wiskunde, absolute waarde. Voeg de twee stapels toe door te navigeren naar het procesmenu, afbeeldingscalculator, toevoegen. Als u de afbeeldingsstapel axiaal opnieuw in licentie wilt geven, gebruikt u het afbeeldingsmenu, stapels, reliskwie.

Selecteer vervolgens uitvoerafstand 1.0, begin bovenaan en vermijd interpolatie. De focusas is nu de verticale as in de stapel. De Y-dimensie van de reliskwed stack is gelijk aan het aantal focusvlakken.

Als u een zijaanzichtprojectie van een deel of het geheel van de stapel wilt maken, gaat u naar het afbeeldingsmenu, stapels, Z-project. Stel startsegment en stop segment in om enkele of alle zijaanzichtvlakken op te nemen. Selecteer maximale intensiteit voor de beste resultaten.

Corrigeer de axiale schaling van de zijaanzichtprojectie door te navigeren naar het afbeeldingsmenu, schaal. De projectie moet worden gecorrigeerd voor de ongelijke pixelatie van het beeldvlak en de toename van de scherpstelling met behulp van de axiale schaalfactor. Stel de X-schaal in op één en stel de Y-schaal in op de axiale schaalfactor.

Selecteer bicubic interpolatie. Selecteer nieuw venster maken. Pas de helderheid en het contrast aan.

Vervolgens converteren naar acht-bits formaat voor weergave. U ook een kleuropzoektabel toepassen en opslaan als RGB- of acht-bits kleur. Met behulp van serieel miscible oplosmiddelen van toenemende brekingsindex, kan het maximum in helderheid snel worden geschat.

Dit wordt verfijnd door conventionele fase contrastmicroscopie om het punt van minimumcontrast te vinden. Eén biofilm werd in serie uitgewisseld tussen xyleen en een smalle set referentievloeistoffen in dat bereik. Na elke uitwisseling werd hetzelfde veld verplaatst en bekeken via een coverglass.

Met toenemende index wordt contrastomkering voor het eerst gezien wanneer n gelijk is aan 1.530 voor de celwand, gevolgd door cytoplasma wanneer n gelijk is aan 1.535. Diepe beeldvorming van mutant en wild type C.albicans biofilms wordt hier getoond. Het wilde type biofilm groeide tot een dikte van 502 micron zoals te zien in de zijaanzicht projectie van de 538 vliegtuig confocale beeldstapel.

Axiale projecties van top tot basis tonen de variatie in celtypen en verschillende lagen van de biofilm. Dit voorbeeld toont karakteristieke wilde typestructuur. De gemuteerde biofilm groeide tot een dikte van 500 micron zoals te zien in de zijaanzichtprojectie van de 556 vliegtuigbeeldstack.

Deze mutant waarvan bekend is dat filamenteuze groei ondergaan in de afwezigheid van inducerende stressoren produceerde een dramatisch andere architectuur. Zoals te zien in zowel de zijaanzicht en axiale projecties, veel vertakkende cellen aanleiding geven tot radiale uitwassen. Dit is een hoge brekingsindex deep imaging protocol.

Idealiter moeten de brekingsindex van het monster en de brekingsindex van de onderdompelingsolie overeenkomen. Daarom gebruiken we in dit geval een doelstelling voor olieonderdompeling. De meeste van onze studies zijn structurele beeldvorming van biofilms met behulp van celwand markers, maar elke fluorescentie methode die wordt gebruikt met vaste exemplaren moet werken met inbegrip van immunofluorescentie, fluorescentie in situ hybridisatie, en verslaggever genexpressie.

Dit specifieke organisme, Candida albicans, is commensal bij gezonde mensen, maar is ook een opportunistische ziekteverwekker die mucosale of systemische schimmelinfecties kan veroorzaken. Bij sommige instellingen zijn BSL II-containmentmethoden en -protocollen vereist. Bovendien zijn formaldehyde- en glutaraldehydefixatiemiddelen vluchtig en gevaarlijk.

Het zijn bekende kankerverwekkende stoffen. Make-up verdunningen van fixatiemiddelen in een rookkap. Bewaar borden met verdunde fixatiemiddelen bedekt en plaats geen containers met deze fixatiemiddelen in een bioveiligheidskast of in een couveuse van de celcultuur.