Fluorescerende calciumbeeldvorming en daaropvolgende in situ hybridisatie voor neuronale precursorkarakterisering in Xenopus laevis

Dit protocol kan worden gebruikt om calciumactiviteitspatronen te correleren met genexpressie op het niveau van één cel dat onderzoekers in staat stelt nieuwe vragen over de relaties tussen deze twee kenmerken te onderzoeken. In tegenstelling tot eerdere benaderingen, die doorgaans hele weefsels bestuderen, zoomt onze techniek in op het eencellige niveau, waardoor we celautonoome relaties tussen calciumactiviteit en genexpressie kunnen beoordelen. Begin met UV steriliseren twee 35 millimeter plastic petrischaaltjes en een 35 millimeter cel kweekschotel voor ongeveer 30 minuten.

Werken in de laminaire stroom kap, voeg 10 milliliter van twee millimolar calcium oplossing om elk van twee 50 milliliter plastic conische buizen, een UV-gesteriliseerde petrischaal, en de UV-gesteriliseerde cel cultuur schotel. Voeg twee milliliter calcium- en magnesiumvrije oplossing toe aan de andere UV-gesteriliseerde petrischaal en vul twee 100 millimeter plastic petrischaaltjes en een 35 millimeter plastic petrischaaltje met 0,1X MMR aangevuld met gentamicine. Vul vervolgens een 60 millimeter plastic petrischaaltje met 70% ethanol.

Meng vlak voor de dissectie 0,01 gram collageen B grondig tot één buis calciumoplossing. Voeg de oplossing toe aan een nieuwe 60 millimeter plastic petrischaal en gebruik een ontledende microscoop om embryo's van de gewenste ontwikkelingsfase te identificeren. Gebruik een steriele overdracht pipet om ten minste zes geschikte embryo's te verplaatsen in een 100 millimeter plaat met MMR plus gentamicine.

Beweeg vervolgens een embryo van de houdplaat in de tweede 100 millimeter plaat van MMR plus gentamicine en plaats deze dissectieplaat onder de microscoop. Met behulp van een paar stompe tangen om het embryo te stabiliseren, pel voorzichtig het vitelline membraan rond het embryo met een paar fijne tangen. Wanneer alle van het membraan is verwijderd, gebruik maken van de fijne tangen om het embryo knijpen langs de voorste achterste as om de rug en ventrale gebieden te scheiden.

Gebruik de nieuwe steriele overdrachtpipet om het dorsale gedeelte gedurende één tot twee minuten over te brengen op de 60 millimeter plaat van collageenoplossing voordat u het monster voorzichtig terugzet naar de dissectieplaat. Om de dissectie te voltooien, verwijder voorzichtig alle resterende endodermale en mesodermale verontreiniging van het vermoedelijke neurale weefsel van het ectoderm en breng voorzichtig de explant over naar de 35 millimeter plaat van calciumoplossing. Wanneer er nog drie explants zijn verzameld, gebruikt u een P1000 micropipet om alle vier de explants over te brengen naar de 35 millimeter plaat van calcium- en magnesiumvrije oplossing, waarbij u ervoor zorgt dat elk contact tussen de excentrales en de luchtwaterinterface wordt vermeden.

Dan voorzichtig wervelen de schotel, zodat alle explants cluster in het midden van de plaat en de monsters incuren gedurende een uur bij kamertemperatuur om de weefsels te scheiden. Breng tijdens deze incubatie de laatste twee embryo's over naar het tweede gerecht van MMR met gentamicine en bedek de schotel zodat deze exemplaren zich ongestoord kunnen ontwikkelen. Gebruik aan het einde van de incubatie superlijm om een micro-geregeerde coverslip aan de onderkant van de 35 millimeter celkweekschotel te bevestigen en gebruik een P100 micropipet om de gescheiden explants te verzamelen.

Houd de pipet in een ondiepe hoek dicht bij het oppervlak van de celkweekschotel, plaats de pipetpunt in de hoek van het raster naar binnen gericht en verdrijst de celopening stevig over het gerasterde gebied. Idealiter zullen de cellen zich vestigen in een strakke, dichte cluster. Laat de cellen zich een uur aan de plaat hechten bij kamertemperatuur.

Terwijl de cellen zich vestigen, bepalen en registreren van de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's. Verplaats de monsterschotel aan het einde van de incubatie naar een licht beschermde locatie en 100 microliter oplossing vanaf de rand van de schotel. Meng deze oplossing met zeven microliters van een vers bereide Fluo-4 AM Pluronic F127 zuuroplossing met op en neer pipetting voordat u het volledige volume teruggeeft aan de monsterschotel.

Draai voorzichtig om de plaat te mengen en te bedekken met aluminiumfolie. Na een uur bij kamertemperatuur, vervang een milliliter van de explant cultuur schotel supernatant met drie milliliter verse twee millimolar van calcium oplossing. Vervang dan nog twee milliliter supernatant door drie milliliter verse calciumoplossing.

Voor de beeldvorming van calciumactiviteit in de explants plaatst u de monsterplaat op het stadium van een omgekeerde confocale microscoop die beschermd is tegen blootstelling aan omgevingslicht en gebruikt u een markering om het voorste punt van de plaat te labelen, zodat hetzelfde gezichtsveld bij volgende beeldvormingssessies kan worden gevonden. Gebruik de 10 en 20 keer doelstellingen om een monster te lokaliseren onder de microscoop en selecteer een geschikt gezichtsveld dat is cel dicht, maar niet zo dicht dat de cellen zijn samengeklonterd of moeilijk individueel te onderscheiden. Pas de focus van de microscoop zo aan dat de rasterregelbare coverslip zichtbaar is, waarbij het oorspronkelijke gezichtsveld wordt gewijzigd totdat een identificeerbaar getal indien nodig in beeld is.

Een helder veldafbeelding van het geselecteerde gezichtsveld verkrijgen met de met rasters voor het rechter overheerste coverslip in focus en een helder veldafbeelding van het geselecteerde gezichtsveld met de cellen in focus. Zonder een duidelijk beeld van de rasterded coverslip en het gezichtsveld, zult u niet in staat zijn om mede-registreren van uw cellen met die in de vis beelden die u later zult genereren. Verlicht vervolgens de monsters met een laser van 488 nanometer.

Wijzig voor een afbeelding van twee uur de beeldconfiguratie om 901 frames op te nemen met een scantijd van 3,93 seconden in een interval van acht seconden voordat de configuratie wordt uitgevoerd om de afbeelding te verkrijgen. Zodra de beeldvorming is voltooid, verwijder de plaat uit de microscoop fase en vervang de cultuur supernatant met een milliliter van 1X MEMFA voor een twee uur durende incubatie bij kamertemperatuur het verzorgen van de ontwikkelingsfase van de broer of zus controle embryo's aan het begin van de incubatie te registreren. De visualisatie van een samengesteld plot met sporen voor alle cellen die in een experiment zijn opgenomen, onthult de mate waarin bulk- of bevolkingsmetingen meer genuanceerde patronen van stekelgedrag kunnen verdoezelen.

Wanneer de geregistreerde profielen van individuele cel geïsoleerd zijn, kunnen voorbeelden van de onregelmatige stekelactiviteit die kenmerkend is voor neurale voorlopercellen duidelijk worden geïdentificeerd. Om deze complexiteit te kwantificeren, kunnen verschillende gegevensanalysemethoden worden toegepast, waaronder diverse parameters om een piek te definiëren. Als de platen ruwweg worden behandeld of de wasbeurten te krachtig worden uitgevoerd tijdens fluorescerende in situ hybridisatie, kunnen de cellen van de plaatoppervlakken worden losgemaakt, waardoor het onmogelijk is om de cellen over afbeeldingen te matchen.

Als deze verstoring slechts enkele cellen in het gezichtsveld beïnvloedt, kan het nog steeds mogelijk zijn om een aantal cellen in de afbeelding te detecteren en toe te wijzen. De maximale hoeveelheid gegevens wordt echter verkregen uit een experiment waarbij de hybridisatie zorgvuldig wordt uitgevoerd en er weinig cellen verloren gaan of tussen afbeeldingen worden verplaatst. Resultaten van experimenten die calciumactiviteit verzamelen met de expressie van neurale voorlopermarkergenen kunnen talrijke associaties onthullen tussen specifieke patronen van calciumactiviteit en neurozenderfenotypen.

Met deze gegevens kunnen onderzoekers complexere kenmerken van deze dynamische calciumpatronen en de relaties met genexpressie onderzoeken in plaats van beperkt te zijn tot eenvoudige piektelling.