Name: Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Leer de expressie en zuivering van antilichamen voor real-time monitoring van antilichaamverdeling in tumor en weefsel. Deze kosteneffectieve methode helpt bij het selecteren van therapeutische antilichamen met minimale niet-specifieke binding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn de Universiteit van Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomoleculaire Analyse Faciliteit, Advanced Microscopy Facility en de Core Vivarium Facility for Assistance dankbaar. J. T-S is een vroege carrière onderzoeker van Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dit werk werd ondersteund door NCI / NIH subsidie (R01CA233752) aan J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) doorbraak level-1 award aan J. T-S (BC17097) en U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) financiering award (OC180412) aan J. T-S

Alle procedures met betrekking tot dieren behandeling en tumor xenografts studies werden herzien en goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) hier aan de Universiteit van Virginia en voldoen aan de relevante wettelijke normen
1. Expressie en zuivering van antilichamen
<ol><li>Onderhoud van CHO-cellen<ol>
<li>Kweek CHO cellen in FreeStyle CHO Media aangevuld met commercieel verkrijgbare 1x glutamine supplement bij 37 °C schudden bij 130 rpm met 5% CO2 met behulp van delong Erlenmeyer flessen glas of wegwerp. OPMERKING: Het is ten zeerste aan te raden om een verbijsterde kolf met geventileerde dop te gebruiken voor verhoogde agitatie en om de gasoverdracht tijdens de schudtoestand te verbeteren. Aanzienlijk verminderde antilichaam opbrengst is verkregen met regelmatige kolven (niet-verbijsterd) als gevolg van beperkte agitatie van de suspensie cultuur.</li>
		<li>Houd het celnummer tussen 1-5 x 106 cellen/mL met >95% cel levensvatbaarheid. Als het celaantal met meer dan 5 x 106 cellen/mL toeneemt, splitst u de cellen. Laat cho-cellen nooit onder 0,2 x 106 cellen/mL komen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfectie van CHO-cellen<ol>
<li>Kweek CHO-cellen in 200 mL media (2 x10 6 cellen/mL) in delong Erlenmeyer verbijsterde kolven. OPMERKING: Suspensieculturen gekweekt in verbijsterde kolven hebben altijd een hogere eiwitopbrengst geproduceerd vs wanneer ze worden geteeld in niet-verbijsterde kolven.</li>
		<li>Neem in een buis van 15 mL 5 mL CHO FreeStyle-media en voeg 50 μg VH-kloon-DNA en 75 μg VL-kloon-DNA toe. Vortex om goed te mengen.</li>
		<li>Broed het DNA-mengsel 5 min op kamertemperatuur. LET OP: Langere incubatie vermindert de eiwitopbrengst.</li>
		<li>Voeg 750 μL van 1 mg/mL polyethyleenimine (PEI) voorraad toe aan de DNA-oplossing en draai het mengsel agressief voor 30 s. Incubeer bij kamertemperatuur voor extra 5 min. LET OP: PEI moet vers worden gemaakt. Meervoudige vriesdooicyclus van PEI vermindert de totale opbrengst aanzienlijk.</li>
		<li>Voeg het hele mengsel van DNA en PEI op de cellen terwijl handmatig schudden van de kolf. Onmiddellijk incubeer de delong Erlenmeyer verbijsterde kolven met cellen bij 37 °C schudden bij 130 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expressie OPMERKING: Het antilichaam heeft secretoire signaal peptide ontworpen om zijn N-terminal einde, die helpt antilichamen worden afgescheiden in de media.<ol>
<li>Laat de doorgestemde cellen groeien bij 37 °C, met schudden bij 130 tpm op dag 1.</li>
		<li>Voeg op dag 2 2 mL 100x anti-klonterend middel en 2 mL 100x antibacterieel-anti-mycotische oplossing toe. Verleg de kolf naar lagere temperatuur (32-34 °C), met schudden bij 130 tpm.</li>
		<li>Voeg op elke vijfde dag 10 mL Tryptone N1-voer toe en 2 mL 100x glutaminesupplement.</li>
		<li>Houd tellen van de cellen elke derde dag met behulp van hemocytometer na het bevlekken van een aliquot van cellen met trypan blauwe vlek. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cel boven de 80% blijft.</li>
		<li>Oogst op dag 10 of 11 het medium voor antilichaamzuivering. Draai de cultuur op 3000 x g,4 °C gedurende 40-60 min en filter vervolgens de heldere media met behulp van 0,22 μM flesfilters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zuivering OPMERKING: Antilichaamzuivering wordt uitgevoerd met behulp van commercieel verkrijgde Protein-A kolom (zie Tabel van materialen), met behulp van een peristaltische pomp.<ol>
<li>Equilibrate de kolom met twee kolomvolume van bindende buffer (20 mM natriumfosfaat bij pH 7.4).</li>
		<li>Laat de gefilterde media met antilichaam (verkregen in stap 1.3.5) door de kolom met een stroomsnelheid van 1 mL/min.</li>
		<li>Was de kolom met een bindingsbuffer met twee kolommen.</li>
		<li>Elute het antilichaam in 500 μL fracties met behulp van 5 mL elutie buffer (30 mM natriumacetaat bij pH 3.4).</li>
		<li>Neutraliseer de pH van het geëuterde antilichaam door 10 μL neutralisatiebuffer (3 M natriumacetaat bij pH 9) per fractie toe te voegen. LET OP: Fractienummer 3-6 bevat het grootste deel van het antilichaam. Het is raadzaam om alle fracties te houden in het geval het antilichaam in een latere fractie wordt geëutteerd dan verwacht.</li>
		<li>Meet de concentratie gezuiverd antilichaam met behulp van een spectrofotometer door het standaardprotocol voor IgG te selecteren. De uiteindelijke concentratie van het antilichaam wordt verkregen in mg/mL door rekening te houden met het molecuulgewicht en de absorptiecoëfficiënt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fluorescerende etikettering
OPMERKING: Antilichamen worden gelabeld met de infraroodkleurstof die een NHS ester reactieve groep bevat, die paren aan eiwitten en vormen een stabiele conjugaat. Deze reactie is pH gevoelig en werkt het beste bij pH 8.5. Fluorescerende conjugaten gelabeld met de kleurstof display een absorptie maximum van 774 nm, en een emissie maximum van 789 nm. pH 8.5 is de sleutel voor effectieve vervoeging.
<ol><li>Dialyze 0,5 mL van het antilichaam met behulp van een dialysecassette (0,1-0,5 mL) in 1 L vervoegingsbuffer (50 mM fosfaatbuffer bij pH 8,5). Na 4 uur breng je de dialysecassette over op een verse buffer en dialyseren 's nachts.</li>
	<li>Stel een vervoegingsreactie in door 0,03 mg IRDye 800CW per 1 mg antilichaam toe te voegen in een reactievolume van 500 μL. OPMERKING: IRDye 800CW wordt opgelost in DMSO bij een concentratie van 10 mg/mL.</li>
	<li>Voer etiketteringsreacties uit voor 2 uur bij 20 °C. LET OP: Het verhogen van de tijd na 2 uur verbetert de etikettering niet.</li>
	<li>Zuiver gelabelde vervoeging door uitgebreide dialyse tegen 1x PBS.</li>
	<li>Schat de mate van etikettering door de absorptie van de kleurstof te meten op 780 nm en absorptie van het eiwit op 280 nm. De kleurstof bijdrage aan de 280 nm signaal is 3%.</li>
	<li>Bereken de kleurstof/eiwitverhouding met behulp van deze formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> wanneer 0,03 een correctiefactor is voor de absorptie van de kleurstof die bij 280 nm wordt gebruikt (gelijk aan 3,0 % van de absorptie ervan bij 780 nm), εKleurstof en εEiwit molaire extinctiecoëfficiënten zijn voor respectievelijk de kleurstof en het eiwit (antilichaam). LET OP: εKleurstof is 270.000 M-1 cm-1 en εEiwit is 203.000 M-1 cm-1 (voor een typische IgG) in 1:1 mengsel van PBS: methanol. Andere eiwitten dan IgG kunnen zeer verschillende molaire extinctiecoëfficiënten hebben. Het gebruik van de juiste uitstervingscoëfficiënt voor het eiwit van belang is essentieel voor een nauwkeurige bepaling van de D/P-verhouding.</li>
	<li>Bereken de uiteindelijke eiwitconcentratie met behulp van deze formule: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> OPMERKING: Bevestig altijd de antigeenbindende werkzaamheid van gelabeld en niet-gelabeld antilichaam met BEHULP VAN ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay) of flow cytometrie voordat u overgaat tot in vivo studies.</li>
</ol>3. Muis xenograft studies
<ol><li>Bereiding van tumorcellen voor injectie<ol>
<li>Kweek OVCAR-3 cellen in RPMI-1640 Medium, aangevuld met 10% FBS en 1x penicilline-streptomycine.</li>
		<li>De dag voor de injectie, subcultuur cellen in nieuwe 100 mm cultuur gerechten met 10 mL van volledige medium / schotel. Gebruik celnummer van 0,5-1 x 106 cellen/schotel.</li>
		<li>Incubeerculturen bij 37 °C temperatuur, 95% vochtigheid en 5% CO2 voor 20-24 uur.</li>
		<li>Verwijder op de dag van injectie het groeimedium uit cultuurgerechten. Spoel de cellaag grondig af met Ca2+/Mg2+ vrij Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om dode cellen, cellulair puin en alle sporen van serum te verwijderen, wat kan interfereren met trypsine-werking.</li>
		<li>Trypsinize de cellen door het toevoegen van 1,0-1,5 mL trypsin-EDta oplossing aan elke schotel en proberen om de oplossing te verspreiden door het kantelen van de schotel rondom, gevolgd door incubatie op 37 °C gedurende 5-10 min. OPMERKING: Observeer cellen onder een omgekeerde microscoop om de werkelijke trypsinisatiestatus te controleren. Onder trypsinization resulteert in lager aantal celloslating van de oppervlakte van cultuurschotel, over trypsinization veroorzaakt cellulaire spanning. Dus, een goede trypsinization is belangrijk.</li>
		<li>Voeg 1,0-1,5 mL van volledig groeimedium toe aan elk gerecht om de trypsine-actie te stoppen, daarna cellen opnieuw op te schorten door zachtjes te pipetten. OPMERKING: Zachte pipetting is belangrijk om de gezondheid van de cel te behouden.</li>
		<li>Verzamel de celsuspensie in een conische buis van 15 mL en draai 5 minuten op kamertemperatuur op 250 x g.</li>
		<li>Verzamel de celpellet na het verwijderen van de supernatant en was de cellen door de pellet opnieuw op te schorten in 1x DPBS.</li>
		<li>Draai de celsuspensie bij lage snelheid 250 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Voeg 500 μL DPBS toe en hang cellen opnieuw op door zachte pipetting om een celopsuspensie te krijgen.</li>
		<li>Tel cellen met behulp van hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. OPMERKING: Voor een betere nauwkeurigheid, herhaal het tellen voor drie keer en neem een gemiddelde.</li>
		<li>Pas het volume zo aan dat de uiteindelijke celdichtheid 1 x 108 cellen/mL is.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Onderhuidse injectie van cellen om muis xenografts te ontwikkelen LET OP: Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een BSL2-veiligheidskast. Athymic Nude Foxn1nu/ Foxn1+ muizen zijn gebruikt in de huidige studie.<ol>
<li>Neem 50 μL van de celsuspensie in een buis van 1,5 mL en meng met 50 μL keldermembraanmatrijsmedium. OPMERKING: Kelder membraan matrix medium heeft de neiging om een gel achtige toestand te vormen bij kamertemperatuur, dus zorgvuldig onderhouden van de cellen en de matrix medium mengsel op ijs. Het is raadzaam om buizen, tips en spuiten in de koelkast te bewaren en vervolgens over te brengen op ijs voorafgaand aan de injectie van het dier.</li>
		<li>Roer het mengsel om te voorkomen dat een cel klonteren. Neem vervolgens deze 100 μL van het celopeningsmatrix medium mengsel dat 5 x 106 cellen bevat, in een 1 cc spuit.</li>
		<li>Til de huid van het dier voorzichtig op om de huid van de onderliggende spierlaag te scheiden en injecteer langzaam de celsuspensie (100 μL) onder de huid (5 x 106 cellen), met een 26 G naald. Wacht een paar seconden voordat u de naald eruit haalt, zodat het medium van de keldermatrix de semi-solide gelachtige structuur samen met cellen onder de huid kan vormen, waardoor het mengsel uit de injectieplaats wordt voorkomen. OPMERKING: Cellen moeten vóór de injectie worden getest op besmetting die schadelijk kan zijn voor immunodeficiënte muizen. Tijdens het injecteren niet de naald te diep in de huid als dit kan de tumor dieper dan verwacht vormen.</li>
		<li>Bewaar het dier in een steriele kooi en observeer ongeveer 20 minuten.</li>
		<li>Observeer de muizen gedurende 2-3 weken en laat de tumor groeien tot 500 mm3 grootte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Antilichaamlokalisatie met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem
OPMERKING: In vivo imaging equipment (zie Table of Materials)gebruikt in dit experiment maakt gebruik van een set van hoge efficiëntie filters en spectrale un-mengen algoritmen voor niet-invasieve visualisatie en het bijhouden van cellulaire en genetische activiteit binnen een levend organisme in real time. Systeem biedt zowel fluorescentie en bioluminescentie monitoring vermogen.
<ol><li>Injecteer 25 μg kleurstof gelabeld antilichaam via staartader.<ol>
<li>Verdoes tumordragende muizen met 2% isofluram. Controleer op het gebrek aan reactie op pedaalreflexen.</li>
		<li>Zodra muizen stoppen met bewegen, verwijd de laterale staart ader door het toepassen van worm water.</li>
		<li>Injecteer 25 μg (in 100 μL) gelabeld antilichaam met behulp van 1 cc insulinespuit met een naald van 26 G.</li>
		<li>Evenzo, als een negatieve controle, label en injecteren van de niet-specifieke IgG1 Isotype antilichaam dat niet gericht kankercellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer in vivo live beeldvorming uit na 8, 24, 48 uur, enz.<ol>
<li>Klik in de bijbehorende software op Initialiseren in het bedieningspaneel en bevestig dat de temperatuur van het stadium 37 °C is.</li>
		<li>Zet de zuurstoftoevoer, alle pompen op het anesthesiesysteem, isoflurane gastoevoer naar de verdovingskamer en stel de isoflurane vaporizer klep in op 2%.</li>
		<li>Breng de muizen naar de verdovingskamer en wacht tot muizen volledig verdoofd zijn. Breng de ogen smeren zalf om te voorkomen dat het drogen van hun ogen.</li>
		<li>Ga naar het Bedieningspaneel,stel de fluorescentiebeeldvorming in via de optie Imaging Wizard en selecteer de excitatie op 773 nm en emissie op 792 nm. OPMERKING: De standaardinstellingen voor automatische belichting bieden een goede fluorescerende afbeelding. Echter, de automatische belichting voorkeuren kunnen worden gewijzigd volgens de behoeften.</li>
		<li>Breng de verdoofde muizen in de beeldkamer en monteer deze op het beeldvormingsveld met behulp van neuskegel. De beeldfase biedt de mogelijkheid om plaats te bieden aan 5 muizen tegelijk. OPMERKING: Laat controlemuizen samen met de testmuizen een vergelijkbare hoeveelheid belichting en andere instellingen hebben tijdens de analyse.</li>
		<li>Zodra alles klaar is, selecteert u De optie Verwerven op het configuratiescherm voor de afbeeldingsverwerving.</li>
		<li>Met de instellingen voor automatischbelichting genereert het systeem de afbeelding binnen een minuut. Het gegenereerde beeld is de overlay van fluorescentie op fotografisch beeld met optische fluorescentie intensiteit weergegeven in eenheden van tellingen of fotonen, of in termen van efficiëntie.</li>
		<li>Na het verkrijgen van het beeld, breng de muizen van de beeldkamer terug naar hun kooi en observeren voor hun herstel voor 1 tot 2 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stem het beeld verder af met de tools en functies die in de software worden geleverd voor beeldanalyse. Hulpmiddelen voor beeldanalyse bevinden zich in de menubalk en het gereedschapspalet.<ol>
<li>Pas onder Afbeeldingsaanpassingde helderheid, het contrast of de dekking aan en selecteer de kleurschaal.</li>
		<li>Gebruik de ROI-tools om een regio van belang (ROI) op te geven in een optisch beeld en de signaalintensiteit binnen de ROI te meten. Exporteer indien nodig de gekwantificeerde signaalgegevens naar een spreadsheetsoftware en plot de gegevens.</li>
		<li>Voor follow-up studies, analyseren muizen necropsies van verschillende weefsels (bijvoorbeeld, lever, long, hart, nier, milt, hersenen, enz.) side-by-side voor een gedetailleerde niet-specifieke verdeling van fluorescerend gelabeld antilichaam. OPMERKING: Gegevens kunnen verder worden ondersteund met weefselspecifieke ELISA door gebruik te maken van antigeen (FOLR1 in dit geval) in 96 well assays.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muromonab+CD3+%28Orthoclone+OKT3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3).</a> Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).</li>
<li>Tushir-Singh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-siRNA+conjugates%3A+drugging+the+undruggable+for+anti-leukemic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Biological+Therapy%22%5BJournal%5D)">Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy.</a> Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).</li>
<li>Gravitz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cancer immunotherapy.</a> Nature. 504, 1(2013).</li>
<li>Pagel, J. M., West, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+Antigen+Receptor+%28CAR%29+T-Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Oncology%22%5BJournal%5D)">Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy.</a> JAMA Oncology. 3, 1595(2017).</li>
<li>Brinkmann, U., Kontermann, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">The making of bispecific antibodies.</a> MAbs. 9, 182-212 (2017).</li>
<li>Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bi-specific+and+tri-specific+antibodies-+the+next+big+thing+in+solid+tumor+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics.</a> Molecular Medicine. 24, 50(2018).</li>
<li>Shivange, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single-Agent+Dual-Specificity+Targeting+of+FOLR1+and+DR5+as+an+Effective+Strategy+for+Ovarian+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer.</a> Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).</li>
<li>Wajant, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mode+of+Action+of+TRAIL+Receptor+Agonists-Common+Principles+and+Their+Translational+Exploitation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 954(2019).</li>
<li>Necela, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folate+receptor-alpha+%28FOLR1%29+expression+and+function+in+triple+negative+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors.</a> PLoS One. 10, 0122209(2015).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antitumor+activity+of+the+human+FOLR1-specific+monoclonal+antibody%2C+farletuzumab%2C+in+an+ovarian+cancer+mouse+model+is+mediated+by+antibody-dependent+cellular+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+Therapy%22%5BJournal%5D)">The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity.</a> Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).</li>
<li>Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Characterization+of+Cross-Linked+Species+in+Trastuzumab+Emtansine+%28Kadcyla%29%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla).</a> Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).</li>
<li>Bauerschlag, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-idiotypic+antibody+abagovomab+in+advanced+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer.</a> Future Oncology. 4, 769-773 (2008).</li>
<li>Narita, Y., Muro, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+molecular+targeted+therapy+for+gastric+cancer%3A+considerations+for+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety.</a> Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).</li>
<li>Jordan, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HER2+expression+identifies+dynamic+functional+states+within+circulating+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells.</a> Nature. 537, 102-106 (2016).</li>
<li>Fakih, M., Vincent, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adverse+events+associated+with+anti-EGFR+therapies+for+the+treatment+of+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Oncology%22%5BJournal%5D)">Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer.</a> Current Oncology. 17, Suppl 1 18-30 (2010).</li>
<li>Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroPET%2FSPECT%2FCT+imaging+of+small+animal+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease.</a> American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).</li>
<li>van der Wall, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost+analysis+favours+SPECT+over+PET+and+CTA+for+evaluation+of+coronary+artery+disease%3A+the+SPARC+study%5BTitle%5D)+AND+%22Netherland+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study.</a> Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).</li>
<li>Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+and+SPECT+Imaging+of+Tumor+Biology%3A+New+Approaches+towards+Oncology+Drug+Discovery+and+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Computer+Aided+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development.</a> Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).</li>
<li>Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tutorial+on+Target-Mediated+Drug+Disposition+%28TMDD%29+Models%5BTitle%5D)+AND+%22CPT+Pharmacometrics+and+System+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models.</a> CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).</li>
</ol>

Auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Selectieve en tumorweefsel specifieke levering van anti-kanker therapeutisch middel is de sleutel tot het meten van de werkzaamheid en veiligheid van een bepaalde gerichte therapie13. Hier hebben we een snelle en efficiënte aanpak beschreven om de gedetailleerde weefsel- en tumordistributie van klinische, farletuzumab en een niet-klinisch BaCa-antilichaam te onderzoeken. De beschreven aanpak is van toepassing op elk nieuw gegenereerd antilichaam en kan worden gebruikt naast een klinisch effectief ...

FDA keurde het eerste monoklonale antilichaam dat CD3 (OKT3, Muromonab) richt in 1986goed 1,2. Sindsdien voor de komende twintig jaar, is er een snelle explosie op het gebied van antilichaam engineering als gevolg van het overweldigende succes van antilichamen tegen immuun checkpoint remmers3. Naast indirecte activering van het immuunsysteem, antilichamen worden gericht op het direct markeren van kankercellen om precies te betrekken immuun effector cellen, trigger cytotoxiciteit via death receptor agonist, blokkeren tumorcel overleving signalering, obstructie van angiogenese (groei van bloedvaten), beperken immuun regulator checkpoints, leveren radio-isotopen, chemotherapie drugs en siRNA als een geconjugeerde middelen2. Daarnaast is het bestuderen van de variabele fragmenten van de enkele keten (scFv) van verschillende antilichamen op het oppervlak van door de patiënt afgeleide T-cellen en NK-cellen (CAR-T en CAR-NK) een snel groeiend gebied van klinische onderzoeken voor celgebaseerde therapieën4.
De ultrahoge affiniteit van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen die selectiviteit biedt aan antigeenexpressie tumorcellen maakt het een aantrekkelijk middel. Ook de gerichte levering en tumorretentie van een therapeutisch antilichaam (of een chemisch medicijn) is de sleutel tot evenwicht werkzaamheid over toxiciteit. Daarom wordt een groot aantal op eiwitengineering gebaseerde strategieën uitgebuit die geen bispecifieke5- en tri-specifieke antilichamen6 bevatten, om de avidity optimized tumorretentie van intraveneus (IV) geïnjecteerde therapieën5,7aanzienlijk te verbeteren . Hier beschrijven we een eenvoudige fluorescentie gebaseerde methode om de tumor- en weefselverdeling van potentieel effectieve anti-kankerantilichamen aan te pakken.
Omdat dierlijke weefsels autofluorescentie bezitten wanneer ze opgewonden zijn in zichtbaar spectrum, werden de antilichamen aanvankelijk gelabeld met nabij Infrarood kleurstof (bijvoorbeeld IRDye 800CW). Voor proofs of concept investigations, hebben we gebruik gemaakt van foliumzuur receptor alpha-1 (FOLR1) gericht op antilichaam genaamd farletuzumab en de afgeleide genaamd Bispecifieke anker Cytotoxiciteit activator (BaCa)7 antilichaam dat co-doelen FOLR1 en death receptor-5 (DR5)8 in een recombinant antilichaam. FOLR1 is een goed gedefinieerde overexpressed doelreceptor in eierstokkanker- en TNBC-kankercellen, tumor xenografts en patiënttumoren9. Met name zijn er meerdere inspanningen om folr1 klinisch te exploiteren met behulp van op antilichamen gebaseerde benaderingen om immuuneffectorcellen en antilichaammedicatie (ADC) in te schakelen voor eierstokkanker en borstkanker10,11.
In deze methoden papier, we gekloond, uitgedrukt en gezuiverd klinische anti-FOLR1 (farletuzumab) samen met andere controle antilichamen met behulp van CHO expressie systeem. IgG1 isotype en een klinische anti-idiotype mucin-16 antilichaam genaamd abagovomab12 werden gebruikt als negatieve controles. Na eiwit-A zuivering, geïndiceerde antilichamen werden gelabeld met IRDye 800CW en werden toegediend in de staart ader van naakte muizen ofwel met eierstokkanker xenografts of stabiel getransfecteerd menselijke FOLR1 uitdrukken murine dikke darmkanker xenografts. De lokalisatie van antilichamen werd gevolgd door live beeldvorming met behulp van in vivo beeldspectrum op meerdere verschillende tijdstippen7. Deze methode vereist geen genetische modificatie of injectie van het substraat om lichtemissie mogelijk te maken en is aanzienlijk sneller, kosteneffectief en efficiënt. Het hieronder beschreven algemene kloon-, expressie-, zuiverings- en etiketteringsprotocol kan worden toegepast op elk klinisch en niet-klinisch antilichaam als er zware en lichte kettingsequenties beschikbaar zijn.

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO media</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Clumping Agent</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat #329420</td><td></td></tr><tr><td>Caliper IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Cat #124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusion</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane, USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Lubricant Eye Ointment</td><td>Refresh Lacri-Lube</td><td>Cat #4089</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat # 354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI transfection reagent</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat # 66333</td><td></td></tr><tr><td>Steritop Vacuum Filters</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimentele modellen: Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human: OVCAR-3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>Human: CHO-K cellen</td><td>Stabiel getransformeerd in ons lab</td><td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>Muis: 4T1</td><td>Vriendelijk aangeboden door Dr. Chip Landen, UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis: MC38</td><td>Vriendelijk aangeboden door Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC</td><td>Geverifieerd door STR-profilering</td><td></td></tr><tr><td>Muis: MC38 hFOLR1</td><td>Gemaakt in ons laboratorium (Dit artikel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimentele modellen: Dieren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muizen: athymische Nude Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Meerdere bestellingen</td><td></td></tr><tr><td>Muizen: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Meerdere bestellingen</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoklonale antilichamen zijn hoge affiniteit multifunctionele geneesmiddelen die werken door variabele onafhankelijke mechanismen om kankercellen te elimineren. In de afgelopen decennia is het gebied van antilichaam-drug conjugaten, bispecifieke antilichamen, chimerische antigeenreceptoren (CAR) en kankerimmunotherapie naar voren gekomen als het meest veelbelovende gebied van basis- en therapeutische onderzoeken. Met tal van succesvolle menselijke proeven gericht op immuun checkpoint receptoren en CAR-T cellen in leukemie en melanoom in een doorbraak tempo, het is zeer spannende tijden voor oncologische therapieën afgeleid van variaties van antilichaam engineering. Helaas, een aanzienlijk groot aantal antilichamen en CAR gebaseerde therapieën hebben ook bewezen teleurstellend in menselijke proeven van vaste kankers vanwege de beperkte beschikbaarheid van immuun-effector cellen in de tumor bed. Belangrijk is dat niet-specifieke distributie van therapeutische antilichamen in andere weefsels dan tumoren ook bijdraagt aan het gebrek aan klinische werkzaamheid, bijbehorende toxiciteit en klinisch falen. Zoals getrouwe vertaling van preklinische studies in menselijke klinische paden zijn sterk vertrouwd op muizen tumor xenograft werkzaamheid en veiligheid studies, hier wijzen we op een methode om de tumor en de algemene weefseldistributie van therapeutische antilichamen te testen. Dit wordt bereikt door het etiketteren van de eiwit-Een gezuiverd antilichaam met in de buurt infrarood fluorescerende kleurstof gevolgd door live beeldvorming van tumordragende muizen.

In de beschreven methodologie hebben we eerst antilichamen gekloond die zich richten op foliumreceptor alpha-1 (FOLR1) genaamd farletuzumab, en een bispecifiek antilichaam genaamd BaCa bestaande uit farletuzumab en lexatumumab, samen met controleantilichamen zoals abagovomab (sequenties in aanvullend bestand 1). Details van representatieve variabele zware (VH) en variabele licht (VL) domeinen in DNA klonen (pVH, pVL) worden weergegeven in figuur 1A. Om de positieve klonen te...

Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Dit protocol toont de expressie en zuivering van antilichamen en real-time monitoring van de distributie van antilichamen in tumor en weefsel. Screening antilichamen met beschreven protocol zal helpen bij het selecteren van antilichamen die een beperkte niet-specifieke weefselverdeling hebben, en verrijken tumorlokalisaties. De beschreven techniek is snel en kosteneffectief.Andere technieken, zoals single-photon emissie computertomografie en positron emissie tomografie, zijn erg duur en vereisen radioactieve en andere geavanceerde tracers. De techniek is niet beperkt tot kanker gericht op antilichamen. Het kan worden toegepast op een andere ziekte, zoals long- of hartziekten, voor de analyse van de distributie van antilichamen in het lichaam.Het aantonen van de procedure, zal Jeremy Gatesman, een dierenarts technicus van mijn universiteit. Ruwe CHO cellen in 200 milliliter media, in Delong, Erlenmeyer verbijsterd kolven. Combineer vijf milliliter CHO freestyle media met 50 microgram variabele zware kloon DNA, en 75 microgram een variabele licht kloon DNA in een 15 milliliter buis.Dan, draai de buis. Laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 750 microliter van een milligram per milliliter polyethyleen voorraad aan de DNA-oplossing, en agressief vortex gedurende 30 seconden.Laat het mengsel op kamertemperatuur gedurende een extra vijf minuten. Voeg het hele mengsel toe aan de CHO-cellen terwijl u de kolf handmatig schudt. Onmiddellijk incubeer de cellen op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 130 RPM.Op de volgende dag, voeg twee milliliter van 100 X anti-klonterend middel, en twee milliliter van 100 X antibacteriële antimycotische oplossing aan de cellen. Incubeer de kolven op 32 tot 34 graden Celsius, met schudden bij 130 RPM. Doorgaan met het kweken van de cellen gedurende 10 tot 11 dagen, het toevoegen van 10 milliliter tryptone N1 diervoeder, en twee milliliter van 100 X glutamine supplement op elke vijfde dag.Tel de cellen op elke derde dag om ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cel boven de 80% blijft Op dag 10 of 11, oogst het medium voor antilichaamzuivering door de cultuur te centrifugeren op 3000 keer G en vier graden Celsius gedurende 40 tot 60 minuten. Vervolgens filter je de heldere media met een flesfilter van 0,22 micrometer. Om de antilichamen te zuiveren, equilibrate het eiwit A kolom met twee kolomvolumes van bindende buffer.Geef de gefilterde media door de kolom met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Was vervolgens de kolom met twee kolomvolumes van bindende buffer. Gebruik vijf milliliter elutiebuffer om het antilichaam in 500 microliterfracties te ontwijken.En neutraliseer de pH van het gezinspeelde antilichaam door 10 microliter neutralisatiebuffer voor breuk toe te voegen. Meet de concentratie van het gezuiverde antilichaam met een spectrofotometer met behulp van het standaardprotocol voor IgG. Dialyse 0,5 milliliter van het antilichaam met behulp van een dialysecassette in een liter vervoegingsbuffer.Na vier uur zet u de dialysecassette over naar een verse buffer en dialyseren 's nachts. Om een vervoegingsreactie op te zetten, voeg 0,03 microgram IRR-kleurstof 800 CWU per één milligram antilichaam toe in een totaal volume van 500 microliter. Broed het mengsel twee uur bij 20 graden Celsius en zuiver vervolgens de gelabelde vervoeging door uitgebreide dialyse tegen PBS.Schat de mate van etikettering door het meten van de absorptie van de kleurstof 780 nanometer, en absorptie van het eiwit op 280 nanometer. Om muis xenografen te ontwikkelen, til je voorzichtig de huid van het dier op en scheid het van de onderliggende spierlaag. Injecteer langzaam 100 microliter celsuspensie onder de huid met een naald van 26 meter.Wacht een paar seconden voordat u de naald eruit haalt, zodat het medium keldermatrix de semi-solide gelachtige structuur informeert, samen met cellen onder de huid, die voorkomen dat het mengsel uit de injectieplaats komt. Om in vivo beeldvorming uit te voeren, injecteer de kleurstof gelabeld antilichaam via de staart ader. Controleer na het verdoven van de muis op het gebrek aan respons op pedaalreflexen en verwijd de ader door warm water aan te brengen.Gebruik een 1cc insulinespuit met een 26-meterige naald om 25 microgram van het gelabelde antilichaam in een volume van 100 microliters te injecteren. Als een negatieve controle, label en injecteer het niet-specifieke IgG isotype antilichaam dat niet gericht is op kankercellen. Voer in vivo beeldvorming uit acht, 24 en 48 uur na antilichaaminjecties.Klik in de beeldsoftware op initialiseren. Bevestig dat de temperatuur 37 graden Celsius is. In het bedieningspaneel, het opzetten van fluorescentie beeldvorming door de imaging wizard, en zet de excitatie op 773 nanometer, emissie op 792 nanometer.Breng de verdoofde muis over naar de beeldkamer. Plaats het op het beeldvormingsveld met behulp van de neuskegel. Klik als u klaar bent op acquire op het configuratiescherm voor de afbeeldingsverwerving en klik op automatisch bloot.Het gegenereerde beeld is de overlay van de fluorescentie op het fotografische beeld met optische fluorescentie en dichtheid weergegeven in eenheden van tellingen of fotonen. Positieve cDNA klonen met variabele zware en variabele lichtdomeinen werden bevestigd met kolonie PCR. Representatieve resultaten van gezuiverde farletuzumab draaien op niet-reducerende en verminderende SDS-pagina worden hier weergegeven.Zware en lichte kettingen produceerden 50 en 25 kilodalton banden na reductie. Ook werd het binden van antilichamen aan inheemse eiwitten in het celoppervlak bevestigd. Fluorescerend gelabelde antilichamen waren staartader geïnjecteerd, in muizen geënt met volledige R1 uitdrukken tumoren.Dieren waren geleefd beeld op meerdere tijdstippen met behulp van IVIS. de gegevens confirs selectieve verrijking van volledige R1 en BaCa antilichamen in de tumoren. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat het onderhoud van CHO-cellen van cruciaal belang is voor de opbrengst van antilichamen.En het is belangrijk om een vergelijkbare mate van fluorescerende kleurstof vervoeging voor concurrerende tumor lokalisatie. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals weefselimmunochemische stoffen en weefsel- of tumorspecifieke ELISA om de live muizenbeeldvormingsgegevens te ondersteunen.

analyzing-tumor-tissue-distribution-target-antigen-specific

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video describes the technique of pretargeted radioimmunotherapy or PRIT, in which immunoconjugates followed by radioligands are administered for treating tumors. This radioimmunotherapy reduces radiation doses to healthy tissues and utilizes radionuclides with very low half-lives incompatible with antibody-based vectors.

Pretargeted Radioimmunotherapy: A Method for Targeted Delivery of Therapeutic Radionuclides to Tumors

This video demonstrates a technique to study the in vivo localization of tumor-specific antibodies in a mouse tumor xenograft model. Upon subcutaneously injecting cancer cells into mice for tumor formation, fluorescently-labeled antibodies are injected that bind to tumor-specific receptors, enabling in vivo assessment of antibody localization via imaging.

A Technique to Assess the In Vivo Localization of Tumor-Specific Antibodies

De bioorthogonale inverse elektrone-vraag Diels-Alder cycloadditie is gebruikt om een effectieve en modulaire pretargeted PET-beeldvormingsstrategie voor kanker te creëren. In dit protocol worden de stappen van deze methodologie beschreven in de context van een modelsysteem dat gebruikmaakt van het op colorectale kanker gerichte antilichaam huA33 en een 64Cu-gelabelde radioligand.

Het benutten van de Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloadditiereacties voor Pretargeted PET Imaging

Viral afkomstige peptiden gekoppeld aan antilichaam-geconjugeerde (ACs) is een aanpak die wint dynamiek als gevolg van het potentieel van het leveren van moleculaire payloads met verhoogde tumor cel accumulatie. Gebruik makend van gemeenschappelijke methoden voor evaluatie van peptide conjugatie, AC en lading intracellulaire accumulatie en tumor gericht op, helpt dit protocol onderzoekers tijdens de cruciale eerste ontwikkelingsfasen.

Eerste beoordeling van antilichaam-geconjugeerde bewerkt met virale afkomstige peptiden voor verhoging van cellulaire accumulatie en verbetering van de Tumor gericht op

Dit protocol wordt beschreven hoe synergie tussen een antikanker antilichaam en Antineoplastische drugs in preklinische modellen met behulp van de combinatie index vergelijking van Chou en Talalay beoordelen.

Potentiëring van antikanker antilichaam werkzaamheid door Antineoplastische Drugs: detectie van antilichaam-drug synergie met de combinatie Index vergelijking

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde workflow voor de generatie en ex vivo karakterisering van oncolytische virussen voor expressie van immunomodulators, met behulp van mazelen virussen bispecifieke T cel engagers codering als een voorbeeld. Toepassing en aanpassing aan andere vector platforms en transgenen zal de ontwikkeling van nieuwe immunovirotherapeutics voor klinische vertaling versnellen.

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Dit protocol beschrijft de synthese en de karakterisering van een trans- Cycloocteen (TCO)-gemodificeerde antilichaam en een 177Lu-geëtiketteerden tetrazine (Tz) radioligand voor pretargeted radioimmunotherapy (PRIT). Daarnaast geeft het het gebruik van deze twee constructies voor in vivo ook en longitudinale therapie studies in een lymfkliertest model van colorectal kanker.

Pretargeted Radioimmunotherapy op basis van de Inverse Electron vraag Diels-Alder reactie

De in vivo immunofluorescentie lokalisatie (IVIL)-methode kan worden gebruikt om in vivo biodistributie van antilichamen en antilichaam conjugaten voor oncologische doeleinden in levende organismen te onderzoeken met behulp van een combinatie van in vivo tumor targeting en ex vivo-immunokleuring Methoden.

In vivo immunofluorescentie lokalisatie voor de beoordeling van therapeutische en diagnostische antilichamen Biodistribution in kankeronderzoek

Dit protocol beschrijft de chirurgische generatie van orthotopic alvleesklier tumoren en de snelle vertering van vers geïsoleerde lymfatische alvleesklier tumoren. Na de spijsvertering kunnen levensvatbare immuuncelpopulaties worden gebruikt voor verdere downstream-analyse, inclusief ex-vivo stimulatie van T-cellen voor intracellulaire cytokine detectie door Flowcytometrie.

Generatie van Orthotopic alvleesklier tumoren en ex vivo karakterisering van tumor-Infiltrerende T cel cytotoxiciteit

Hier beschrijven we een methode voor het transduceren van menselijke T-cellen met luciferase om in vivo tracking van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel naar tumoren in studies te vergemakkelijken om de anti-tumor werkzaamheid en het mechanisme van T-cel-engaging bispecifieke antilichamen te evalueren.

Het volgen van bispecifieke antilichaam-geïnduceerde T-celhandel met behulp van luciferase-getransduceerde menselijke T-cellen

Hier presenteren we een methode om verbindingen te identificeren die het ADCC-mechanisme moduleren, een belangrijk kankerceldodend mechanisme van antitumorantilichamen. Het cytotoxische effect van NK-cellen wordt gemeten in sferoïden van borstkankercellen in aanwezigheid van Trastuzumab. Beeldanalyse identificeert levende en dode killer- en doelcellen in sferoïden.

Kwantificering van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit in een tumorsferoïde model: aanvraag voor ontdekking van geneesmiddelen

Leer de expressie en zuivering van antilichamen voor real-time monitoring van antilichaamverdeling in tumor en weefsel. Deze kosteneffectieve methode helpt bij het selecteren van therapeutische antilichamen met minimale niet-specifieke binding.

Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Meer video's verkennen