Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam

Dit protocol toont de expressie en zuivering van antilichamen en real-time monitoring van de distributie van antilichamen in tumor en weefsel. Screening antilichamen met beschreven protocol zal helpen bij het selecteren van antilichamen die een beperkte niet-specifieke weefselverdeling hebben, en verrijken tumorlokalisaties. De beschreven techniek is snel en kosteneffectief.

Andere technieken, zoals single-photon emissie computertomografie en positron emissie tomografie, zijn erg duur en vereisen radioactieve en andere geavanceerde tracers. De techniek is niet beperkt tot kanker gericht op antilichamen. Het kan worden toegepast op een andere ziekte, zoals long- of hartziekten, voor de analyse van de distributie van antilichamen in het lichaam.

Het aantonen van de procedure, zal Jeremy Gatesman, een dierenarts technicus van mijn universiteit. Ruwe CHO cellen in 200 milliliter media, in Delong, Erlenmeyer verbijsterd kolven. Combineer vijf milliliter CHO freestyle media met 50 microgram variabele zware kloon DNA, en 75 microgram een variabele licht kloon DNA in een 15 milliliter buis.

Dan, draai de buis. Laat het mengsel vijf minuten op kamertemperatuur. Voeg 750 microliter van een milligram per milliliter polyethyleen voorraad aan de DNA-oplossing, en agressief vortex gedurende 30 seconden.

Laat het mengsel op kamertemperatuur gedurende een extra vijf minuten. Voeg het hele mengsel toe aan de CHO-cellen terwijl u de kolf handmatig schudt. Onmiddellijk incubeer de cellen op 37 graden Celsius tijdens het schudden op 130 RPM.

Op de volgende dag, voeg twee milliliter van 100 X anti-klonterend middel, en twee milliliter van 100 X antibacteriële antimycotische oplossing aan de cellen. Incubeer de kolven op 32 tot 34 graden Celsius, met schudden bij 130 RPM. Doorgaan met het kweken van de cellen gedurende 10 tot 11 dagen, het toevoegen van 10 milliliter tryptone N1 diervoeder, en twee milliliter van 100 X glutamine supplement op elke vijfde dag.

Tel de cellen op elke derde dag om ervoor te zorgen dat de levensvatbaarheid van de cel boven de 80% blijft Op dag 10 of 11, oogst het medium voor antilichaamzuivering door de cultuur te centrifugeren op 3000 keer G en vier graden Celsius gedurende 40 tot 60 minuten. Vervolgens filter je de heldere media met een flesfilter van 0,22 micrometer. Om de antilichamen te zuiveren, equilibrate het eiwit A kolom met twee kolomvolumes van bindende buffer.

Geef de gefilterde media door de kolom met een stroomsnelheid van één milliliter per minuut. Was vervolgens de kolom met twee kolomvolumes van bindende buffer. Gebruik vijf milliliter elutiebuffer om het antilichaam in 500 microliterfracties te ontwijken.

En neutraliseer de pH van het gezinspeelde antilichaam door 10 microliter neutralisatiebuffer voor breuk toe te voegen. Meet de concentratie van het gezuiverde antilichaam met een spectrofotometer met behulp van het standaardprotocol voor IgG. Dialyse 0,5 milliliter van het antilichaam met behulp van een dialysecassette in een liter vervoegingsbuffer.

Na vier uur zet u de dialysecassette over naar een verse buffer en dialyseren 's nachts. Om een vervoegingsreactie op te zetten, voeg 0,03 microgram IRR-kleurstof 800 CWU per één milligram antilichaam toe in een totaal volume van 500 microliter. Broed het mengsel twee uur bij 20 graden Celsius en zuiver vervolgens de gelabelde vervoeging door uitgebreide dialyse tegen PBS.

Schat de mate van etikettering door het meten van de absorptie van de kleurstof 780 nanometer, en absorptie van het eiwit op 280 nanometer. Om muis xenografen te ontwikkelen, til je voorzichtig de huid van het dier op en scheid het van de onderliggende spierlaag. Injecteer langzaam 100 microliter celsuspensie onder de huid met een naald van 26 meter.

Wacht een paar seconden voordat u de naald eruit haalt, zodat het medium keldermatrix de semi-solide gelachtige structuur informeert, samen met cellen onder de huid, die voorkomen dat het mengsel uit de injectieplaats komt. Om in vivo beeldvorming uit te voeren, injecteer de kleurstof gelabeld antilichaam via de staart ader. Controleer na het verdoven van de muis op het gebrek aan respons op pedaalreflexen en verwijd de ader door warm water aan te brengen.

Gebruik een 1cc insulinespuit met een 26-meterige naald om 25 microgram van het gelabelde antilichaam in een volume van 100 microliters te injecteren. Als een negatieve controle, label en injecteer het niet-specifieke IgG isotype antilichaam dat niet gericht is op kankercellen. Voer in vivo beeldvorming uit acht, 24 en 48 uur na antilichaaminjecties.

Klik in de beeldsoftware op initialiseren. Bevestig dat de temperatuur 37 graden Celsius is. In het bedieningspaneel, het opzetten van fluorescentie beeldvorming door de imaging wizard, en zet de excitatie op 773 nanometer, emissie op 792 nanometer.

Breng de verdoofde muis over naar de beeldkamer. Plaats het op het beeldvormingsveld met behulp van de neuskegel. Klik als u klaar bent op acquire op het configuratiescherm voor de afbeeldingsverwerving en klik op automatisch bloot.

Het gegenereerde beeld is de overlay van de fluorescentie op het fotografische beeld met optische fluorescentie en dichtheid weergegeven in eenheden van tellingen of fotonen. Positieve cDNA klonen met variabele zware en variabele lichtdomeinen werden bevestigd met kolonie PCR. Representatieve resultaten van gezuiverde farletuzumab draaien op niet-reducerende en verminderende SDS-pagina worden hier weergegeven.

Zware en lichte kettingen produceerden 50 en 25 kilodalton banden na reductie. Ook werd het binden van antilichamen aan inheemse eiwitten in het celoppervlak bevestigd. Fluorescerend gelabelde antilichamen waren staartader geïnjecteerd, in muizen geënt met volledige R1 uitdrukken tumoren.

Dieren waren geleefd beeld op meerdere tijdstippen met behulp van IVIS. de gegevens confirs selectieve verrijking van volledige R1 en BaCa antilichamen in de tumoren. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat het onderhoud van CHO-cellen van cruciaal belang is voor de opbrengst van antilichamen.

En het is belangrijk om een vergelijkbare mate van fluorescerende kleurstof vervoeging voor concurrerende tumor lokalisatie. Na deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals weefselimmunochemische stoffen en weefsel- of tumorspecifieke ELISA om de live muizenbeeldvormingsgegevens te ondersteunen.