Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification
May 18th, 2020
Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.
Alleen en alleen bindende eiwitten beheersen meerdere biologische processen. Deze FLAG-Biotine CLIP-seq methode, vandaar om wereldwijd profiel van de speciale en de temporele regeling van RNAs en RBPs in zoogdiercellen. Deze methode maakt een efficiënte detectie van directe eiwitgebonden RNAs mogelijk zonder SDS-PAGE en de membraanoverdrachtsprocedures.
In vergelijking met traditionele CLIP-seq isisotoop vrij en het vereist geen eiwitspecifiek antilichaam. Begin met het plating ongeveer 3 miljoen muis embryonale STAM cellen in een 10 centimeter plaat en uitbroeden ze 's nachts. Verwijder de volgende dag het medium met een vacuüm en behandel de cellen met twee milliliter van 0,25% trypsin EDTA gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.
Blus de trypsine met vier milliliter vers MESC-medium en breng de cellen over op een centrifugebuis van 15 milliliter. Dan, centrifuge ze op 300 keer G gedurende drie minuten op vier graden Celsius en verwijder de supernatant. Hang de cellen in vier milliliter koude PBS en breng ze terug naar de 10 centimeter plaat voor cross-linking.
Straal de cellen uit met een 254 nanometer UV-licht en breng de gekoppelde cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter. Draai deze cellen drie minuten naar beneden op 300 g bij vier graden Celsius, verwijder vervolgens de supernatant en lyse de cellen met 500 microliters van Buffer A bereid volgens manuscriptrichtingen. Breng de cellen naar een RNAse-vrije 1,5 milliliter buis, en uitbroed ze op vier graden Celsius met zachte rotatie gedurende 30 tot 60 minuten.
Behandel het lysaat met 30 microliter DNAse 1 bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Stop vervolgens de reactie door vier microliters van 0,5 molaire EDTA toe te voegen. Draai de onoplosbare pellet door centrifugeren op 12,000 keer G gedurende 20 minuten op vier graden Celsius, en breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde 1,5 milliliter buis.
Breng het cellysaat over op vooraf geëquilibreerde FLAG-kralen en broed het monster uit op vier graden Celsius terwijl u twee tot vier uur draait. Na de incubatie, centrifugeren de kralen gedurende twee minuten op 3000 keer G en verwijder de supernatant. Voeg 500 microliters van Buffer A toe aan het monster en broed gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius, draai vervolgens de kralen naar beneden en verwijder de supernatant.
Herhaal de was met Buffer A, gevolgd door twee wasbeurten met voorgekoelde Buffer B.To elute met een drie X FLAG-peptide, bereid de elutie oplossing zoals beschreven in de tekst manuscript en spin vaststelling van de FLAG-kralen. Verwijder de supernatant met een smalle eind pipet tip en voeg 200 microliter van de drie X FLAG elution oplossing aan elk monster. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zachte rotatie.
Draai vervolgens twee minuten naar beneden bij 3000 keer G.Breng de supernate over naar een verse buis en herhaal de elutie twee keer. Bespaar 5% van de eluents voor westerse vlekkenanalyse of zilvervlekken om de efficiëntie van FLAG immunoprecipitatie te controleren. Breng de getrokken eluents naar voorbereide streptavidin kralen en draai de monsters zachtjes op vier graden Celsius gedurende een tot drie uur of 's nachts.
Verzamel vervolgens de kralen op een magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen twee keer met 500 microliter buffer C met zachte rotatie gedurende vijf minuten per wasbeurt. Was vervolgens de kralen twee keer met 500 microliters van Buffer D, en twee keer met 500 microliters ijskoude PNK-buffer, verzamel de kralen op de magnetische standaard en verwijder de supernatant tussen de wasbeurten.
Om gedeeltelijke RNA-spijsvertering uit te voeren, voegt u 100 microliters MNA-oplossing toe aan elk monster en vortex die is ingesteld op 37 graden Celsius met een thermische mixer gedurende 10 minuten. Verzamel de kralen met een magnetische standaard gedurende 30 seconden en verwijder de supernatant. Was ze vervolgens met de PNK-EDTA-buffer, buffer C en PNK-buffer volgens de handschriftaanwijzing.
Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg vervolgens de CIP-reactiemix toe en draaivors de kralen op 37 graden Celsius met een thermische mixer gedurende 10 minuten. Was de kralen snel twee keer met 500 microliters ijskoude PNK EDTA-buffer, gevolgd door twee wasbeurten met 500 microliters ijskoude PNK-buffer.
Voeg na de wasbeurten 40 microliters van drie prime linker ligatiemix toe aan de kralen en draai ze drie uur of 's nachts met een thermische mixer. Efficiënte ligatie van de linker aan de bondgenoten is van cruciaal belang voor dit experiment. Controleer af en toe de reactiebuis om ervoor te zorgen dat deze niet neerslaan tijdens ligatie.
Herhaal na de incubatie de wasbeurten met PNK EDTA- en PNK-buffers, voeg 40 microliter PNK gemengd toe aan de kralen en draai ze 10 minuten lang met de thermische mixer. Was de kralen met PNK EDTA- en PNK-buffers en ga vervolgens verder met RNA-isolatie zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vergeleken met VLAG-gemedieerde of streptavidin bemiddelde een stap affiniteit zuivering, FLAG-Biotine tandemzuivering verwijderd bijna alle kern gezuiverde eiwitten, het vermijden van de verontreiniging van indirecte eiwit RNA interacties.
LIN28 en WDR43, Fbio CLIP-seq werd uitgevoerd met behulp van muis embryonale STEM cellen. In totaal werden ongeveer 7,7 miljoen en 2,2 miljoen unieke reads opgehaald voor respectievelijk LIN28 en WDR43. Vergelijking van de track views tonen verschillende bindingspatronen in de RN45 pre-rRNA locus.
De cross-linked sites op de GGA G motief van pre-let7-g RNA door LIN28, Fbio CLIP-seq of geïdentificeerd. Bovendien werden verrijkte RNA-motieven in de bindingsplaatsen en het percentage gemuteerde nucleotiden in verschillende soorten mutaties bepaald. Laten zien dat LIN28 zich liever bindt aan de gen nucleotide.
Om 22:00 uur, dit protocol, is het belangrijk om de efficiëntie van de immunoprecipitatie te bevestigen om ervoor te zorgen dat de eiwitcomplexen met succes werden gezuiverd.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een gemodificeerd CLIP-seq protocol genaamd Fbio CLIP-seq, dat gebruikmaakt van FLAG-biotine tandem-zuivering om RNA-doelen van RNA-bindende eiwitten (RBP's) in zoogdiercellen te identificeren. De methode maakt een efficiënte detectie van directe, aan eiwitten gebonden RNA's mogelijk zonder de noodzaak van SDS-PAGE en membraanoverdrachtprocedures.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Moleculair biologie
Achtergrond
- RNA-bindende eiwitten (RBP's) spelen cruciale rollen bij het reguleren van verschillende biologische processen.
- Traditionele CLIP-seq-methoden vereisen vaak isotopen en specifieke antilichamen.
- Fbio CLIP-seq wil het proces van het profileren van RBP's en hun RNA-doelen vereenvoudigen.
- Deze methode is bijzonder nuttig voor het bestuderen van zoogdiercellen.
Doel van studie
- Om een efficiëntere methode te ontwikkelen voor het identificeren van RNA-doelen van RBP's.
- Om de noodzaak van complexe procedures zoals SDS-PAGE te elimineren.
- Om een protocol te bieden dat gemakkelijk toepasbaar is in studies met zoogdiercellen.
Gebruikte methoden
- Aanleggen van muis embryonale stamcellen in een 10 cm plaat.
- Incubatie van cellen 's nachts voorafgaand aan behandeling.
- Behandeling met trypsin EDTA om cellen los te maken.
- Gebruik van FLAG-biotine tandem-zuivering voor RNA-isolatie.
Belangrijkste resultaten
- De Fbio CLIP-seq methode profileert succesvol RBP's en hun RNA-doelen.
- Toonde efficiëntie in het detecteren van aan eiwitten gebonden RNA's.
- Toonde aan dat de methode isotoopvrij en antlichaamvrij is.
- Bieden een gestroomlijnde aanpak voor het bestuderen van RNA-eiwitinteracties.
Conclusies
- Fbio CLIP-seq is een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die RBP's in zoogdiercellen bestuderen.
- De methode verbetert de mogelijkheid om RNA-interacties te profileren zonder traditionele beperkingen.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitbreiden naar verschillende biologische contexten en celtypen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Direct mapping of protein-RNA interactions is critical for target validation and mechanistic de-risking in early discovery pipelines. The Fbio CLIP-seq method enables transcriptome-wide identification of direct RNA-binding protein targets without reliance on isotopes or protein-specific antibodies, reducing confounding from indirect interactions. This capability enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions in RNA-targeted drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables transcriptome-wide interrogation of direct protein-RNA interactions for functional target validation.
- Reduces mechanistic ambiguity by eliminating indirect RNA-binding protein contaminants.
- Supports predictive confidence in target engagement and pathway mapping.
- Facilitates triage of RNA-binding proteins based on direct interaction profiles.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, antibody-free workflow for preparing validated protein-RNA complexes.
- Delivers quantitative readouts of direct binding events suitable for downstream screening.
- Improves reproducibility and scalability by removing isotope and antibody dependencies.
- Enables reliable evaluation of compound effects on protein-RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by profiling endogenous interactions in mammalian cells.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by mapping direct RNA targets.
- De-risks translational biomarker selection through high-specificity interaction data.
- Facilitates risk-adjusted advancement of RNA-targeted therapeutic programs.
Pipeline & Workflow Integration
The Fbio CLIP-seq method integrates at the interface of early discovery and lead identification, providing direct evidence of protein-RNA interactions for target validation and assay development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by mapping direct RNA-binding protein targets.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound screening and assay standardization.
- Analytics: Enables transcriptome-wide comparison of binding patterns and motif enrichment.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical models by profiling interactions in disease-relevant cell types.
- Enterprise Reuse: Provides a reusable, antibody-independent platform for diverse RNA-binding protein studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows through antibody-free, isotope-free, and scalable purification steps.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA-protein biochemistry and cross-linking techniques.
- Needs access to UV cross-linking, FLAG and streptavidin bead purification, and high-throughput sequencing infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable to various mammalian cell models with protocol optimization.
- Potential limitations include requirement for tagged protein expression and careful validation of purification efficiency.
