Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

Alleen en alleen bindende eiwitten beheersen meerdere biologische processen. Deze FLAG-Biotine CLIP-seq methode, vandaar om wereldwijd profiel van de speciale en de temporele regeling van RNAs en RBPs in zoogdiercellen. Deze methode maakt een efficiënte detectie van directe eiwitgebonden RNAs mogelijk zonder SDS-PAGE en de membraanoverdrachtsprocedures.

In vergelijking met traditionele CLIP-seq isisotoop vrij en het vereist geen eiwitspecifiek antilichaam. Begin met het plating ongeveer 3 miljoen muis embryonale STAM cellen in een 10 centimeter plaat en uitbroeden ze 's nachts. Verwijder de volgende dag het medium met een vacuüm en behandel de cellen met twee milliliter van 0,25% trypsin EDTA gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.

Blus de trypsine met vier milliliter vers MESC-medium en breng de cellen over op een centrifugebuis van 15 milliliter. Dan, centrifuge ze op 300 keer G gedurende drie minuten op vier graden Celsius en verwijder de supernatant. Hang de cellen in vier milliliter koude PBS en breng ze terug naar de 10 centimeter plaat voor cross-linking.

Straal de cellen uit met een 254 nanometer UV-licht en breng de gekoppelde cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter. Draai deze cellen drie minuten naar beneden op 300 g bij vier graden Celsius, verwijder vervolgens de supernatant en lyse de cellen met 500 microliters van Buffer A bereid volgens manuscriptrichtingen. Breng de cellen naar een RNAse-vrije 1,5 milliliter buis, en uitbroed ze op vier graden Celsius met zachte rotatie gedurende 30 tot 60 minuten.

Behandel het lysaat met 30 microliter DNAse 1 bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Stop vervolgens de reactie door vier microliters van 0,5 molaire EDTA toe te voegen. Draai de onoplosbare pellet door centrifugeren op 12,000 keer G gedurende 20 minuten op vier graden Celsius, en breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde 1,5 milliliter buis.

Breng het cellysaat over op vooraf geëquilibreerde FLAG-kralen en broed het monster uit op vier graden Celsius terwijl u twee tot vier uur draait. Na de incubatie, centrifugeren de kralen gedurende twee minuten op 3000 keer G en verwijder de supernatant. Voeg 500 microliters van Buffer A toe aan het monster en broed gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius, draai vervolgens de kralen naar beneden en verwijder de supernatant.

Herhaal de was met Buffer A, gevolgd door twee wasbeurten met voorgekoelde Buffer B.To elute met een drie X FLAG-peptide, bereid de elutie oplossing zoals beschreven in de tekst manuscript en spin vaststelling van de FLAG-kralen. Verwijder de supernatant met een smalle eind pipet tip en voeg 200 microliter van de drie X FLAG elution oplossing aan elk monster. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zachte rotatie.

Draai vervolgens twee minuten naar beneden bij 3000 keer G.Breng de supernate over naar een verse buis en herhaal de elutie twee keer. Bespaar 5% van de eluents voor westerse vlekkenanalyse of zilvervlekken om de efficiëntie van FLAG immunoprecipitatie te controleren. Breng de getrokken eluents naar voorbereide streptavidin kralen en draai de monsters zachtjes op vier graden Celsius gedurende een tot drie uur of 's nachts.

Verzamel vervolgens de kralen op een magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen twee keer met 500 microliter buffer C met zachte rotatie gedurende vijf minuten per wasbeurt. Was vervolgens de kralen twee keer met 500 microliters van Buffer D, en twee keer met 500 microliters ijskoude PNK-buffer, verzamel de kralen op de magnetische standaard en verwijder de supernatant tussen de wasbeurten.

Om gedeeltelijke RNA-spijsvertering uit te voeren, voegt u 100 microliters MNA-oplossing toe aan elk monster en vortex die is ingesteld op 37 graden Celsius met een thermische mixer gedurende 10 minuten. Verzamel de kralen met een magnetische standaard gedurende 30 seconden en verwijder de supernatant. Was ze vervolgens met de PNK-EDTA-buffer, buffer C en PNK-buffer volgens de handschriftaanwijzing.

Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg vervolgens de CIP-reactiemix toe en draaivors de kralen op 37 graden Celsius met een thermische mixer gedurende 10 minuten. Was de kralen snel twee keer met 500 microliters ijskoude PNK EDTA-buffer, gevolgd door twee wasbeurten met 500 microliters ijskoude PNK-buffer.

Voeg na de wasbeurten 40 microliters van drie prime linker ligatiemix toe aan de kralen en draai ze drie uur of 's nachts met een thermische mixer. Efficiënte ligatie van de linker aan de bondgenoten is van cruciaal belang voor dit experiment. Controleer af en toe de reactiebuis om ervoor te zorgen dat deze niet neerslaan tijdens ligatie.

Herhaal na de incubatie de wasbeurten met PNK EDTA- en PNK-buffers, voeg 40 microliter PNK gemengd toe aan de kralen en draai ze 10 minuten lang met de thermische mixer. Was de kralen met PNK EDTA- en PNK-buffers en ga vervolgens verder met RNA-isolatie zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vergeleken met VLAG-gemedieerde of streptavidin bemiddelde een stap affiniteit zuivering, FLAG-Biotine tandemzuivering verwijderd bijna alle kern gezuiverde eiwitten, het vermijden van de verontreiniging van indirecte eiwit RNA interacties.

LIN28 en WDR43, Fbio CLIP-seq werd uitgevoerd met behulp van muis embryonale STEM cellen. In totaal werden ongeveer 7,7 miljoen en 2,2 miljoen unieke reads opgehaald voor respectievelijk LIN28 en WDR43. Vergelijking van de track views tonen verschillende bindingspatronen in de RN45 pre-rRNA locus.

De cross-linked sites op de GGA G motief van pre-let7-g RNA door LIN28, Fbio CLIP-seq of geïdentificeerd. Bovendien werden verrijkte RNA-motieven in de bindingsplaatsen en het percentage gemuteerde nucleotiden in verschillende soorten mutaties bepaald. Laten zien dat LIN28 zich liever bindt aan de gen nucleotide.

Om 22:00 uur, dit protocol, is het belangrijk om de efficiëntie van de immunoprecipitatie te bevestigen om ervoor te zorgen dat de eiwitcomplexen met succes werden gezuiverd.