Name: Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer Fbio CLIP-seq voor transcriptoom-brede profilering van eiwit-RNA-interacties in zoogdiercellen. Deze methode detecteert direct gebonden RNA's efficiënt zonder SDS-PAGE en is isotoopvrij.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Subsidie steun is van de National Basic Research Program van China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), de National Natural Science Foundation van China (31630095), en het Center for Life Sciences aan de Tsinghua University.

1. Cellijnconstructie
<ol><li>Kloon het gen van belang in een PiggyBac vector pPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA van belang]-(Hygromycin-resistente) plasmide die een VLAG-biotine epitoop13draagt ,21 om een VLAG-biotine tag gesmolten RBP(FBRBP) uit te drukken.</li>
	<li>Cotransfecteer de FBRBP expressing vector met de pBase vector in een cellijn die het BirA enzym22uitdrukt. OPMERKING: In deze studie werd het FBRBP-gen omgezet in embryonale stamcellen (mESCs) met een geïntegreerde BirA-expressievector21. Als alternatief kan de FBRBP expressing vector samen worden omgezet in cellen met pBase en pPiggyBac-BirA-V5.</li>
	<li>Kweek de cellen in mESC op gelatineiseerde gerechten en onderhoud in mES cultuurmedium (Tabel van materialen) in 5% CO2 bij 37 °C. Selecteer de transfected cellen met hygromycine b (100 μg/mL) gedurende 1 week.</li>
	<li>Na de selectie van geneesmiddelen, oogst cellen door SDS laadbuffer (Tabel 1) en gebruik een westerse vlek23 om de tagging en expressie van het gen te bevestigen met respectievelijk een FLAG-antilichaam en streptavidin-HRP.</li>
</ol>2. Cross-linking
<ol><li>Plaat ~3 x 106 mES cellen in een 10 cm plaat 1 dag voor het experiment, zodat de cellen zullen groeien tot 70−90% samenvloeiing wanneer geoogst (~ 5−10 miljoen cellen per monster).</li>
	<li>Verwijder het medium met een vacuüm. Behandel de cellen met 2 mL van 0,25% trypsin-EDTA gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur (RT) en blus de trypsine met 4 mL vers mESC-medium. Breng de cellen over op een centrifugebuis van 15 mL. Draai de cellen naar beneden door centrifugeren op 300 x g gedurende 3 min bij 4 °C en verwijder de supernatant.</li>
	<li>Hang de cellen met 4 mL koude PBS en plaat de cellen terug naar de 10 cm plaat voor cross-linking. Kruisverbond de cellen door straling met 254 nm UV-licht (stel de UV-dwars-linker in met een parameter van 400 mJ/cm2). OPMERKING: Voor celmonolagen kunnen de cellen direct op de plaat worden gekoppeld met UV-licht voordat ze worden behandeld.</li>
	<li>Breng de gekoppelde cellen over naar een buis van 15 mL. Spin naar beneden door centrifugatie op 300 x g gedurende 3 min bij 4 °C en verwijder de supernatant. LET OP: De gekoppelde celpellet kan tot gebruik bij -80 °C worden opgeslagen.</li>
</ol>3. Cellysaatvoorbereiding
<ol><li>Lyse de cellen met 500 μL wasbuffer A (Tabel 1) vers aangevuld met 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 proteaseremmer cocktail, en 400 U /mL RNase remmer. Breng de cellen over op een RNase-vrije 1,5 mL buis. Incubeer de cellen gedurende 30−60 min op een rotor met zachte rotatie bij 4 °C.</li>
	<li>Behandel het lysaat met 30 μL DNase I op 37 °C gedurende 10 minuten. Stop de reactie door 4 μL 0,5 M EDTA toe te voegen. Draai de onoplosbare pellet 20 minuten bij 4 °C met 12.000 x g naar beneden en breng de supernatant over op een nieuwe voorgekeerde 1,5 mL buis. LET OP: Voor direct gebruik, houd op ijs. Als de supernatant niet onmiddellijk wordt gebruikt, bewaar het dan bij -80 °C tot gebruik.</li>
</ol>4. VOORBEREIDING VAN VLAGkralen
<ol><li>Voeg 40 μL drijfmest VLAG kralen per monster toe aan een verse buis van 1,5 mL.</li>
	<li>Was de kralen snel met 0,5 mL ijskoude wasbuffer A en draai 3.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C naar beneden.</li>
	<li>Herhaal stap 4.2 eenmaal. Draai de kralen naar beneden met 3.000 x g gedurende 2 min bij 4 °C. Verwijder de buffer voorzichtig met een narrow-end pipetpunt. Vermijd het verwijderen van de kralen.</li>
</ol>5.
<ol><li>Breng het cellysaat over van stap 3.2 naar de vooraf geëquilibreerde FLAG-kralen. Draai alle monsters op een rolshaker voorzichtig op 4 °C. Incubeer de VLAG kralen met lysate voor 2−4 uur of 's nachts.</li>
	<li>Centrifuge de kralen gedurende 2 min op 3.000 x g en verwijder de supernatant.</li>
	<li>Was de kralen met 0,5 mL voorbestemde wasbuffer A door incubatie gedurende 5 minuten in een rotator bij 4 °C, draai de kralen met 3.000 x g gedurende 2 minuten naar beneden en verwijder de supernatant. Herhaal de was 1x.</li>
	<li>Herhaal de was 2x zoals beschreven in stap 5.3 met 0,5 mL voorgekeerde wasbuffer B (Tabel 1).</li>
</ol>6. Elution met 3x FLAG peptide
<ol><li>Bereid 3x FLAG elutieoplossing voor door 1 mg 3x FLAG peptide op te lossen met 5 mL wasbuffer A tot een uiteindelijke concentratie van 200 ng/mL.</li>
	<li>Draai de VLAG kralen van stap 5.4 met 3.000 x g gedurende 2 min. Verwijder de supernatant voorzichtig. Zorg ervoor dat het grootste deel van de supernatant wordt verwijderd met behulp van een smalle einde pipet tip.</li>
	<li>Voeg 200 μL 3x FLAG elution oplossing toe aan elk monster. Broed de monsters met zachte rotatie gedurende 30 minuten bij 4 °C. Draai de VLAG kralen voor 2 min op 3.000 x g. Breng de supernatants over op verse buizen.</li>
	<li>Herhaal de elutie 2x zoals beschreven in de stappen 6.2 en 6.3 en pool de eluents samen. Bespaar 5% van de eluents voor westerse vlekken analyse of zilver vlekken om de efficiëntie van FLAG-IP te controleren.</li>
</ol>7. Streptavidin kralen voorbereiding
<ol><li>Bereid 50 μL van een streptavidin kraal drijfmest voor elk monster. Verzamel de kralen met een magnetische standaard voor 30 s en verwijder de supernatant met een pipetpunt.</li>
	<li>Was de kralen snel met 0,5 mL ijskoude wasbuffer A en verzamel de kralen met een magnetische standaard van 30 s.</li>
	<li>Herhaal de was 1x. Verwijder de supernatant na de wasbeurt.</li>
</ol>8. Biotine affiniteit zuivering
<ol><li>Breng de gepoolde eluents van stap 6.4 naar de streptavidinkralen vanaf stap 7.3 en draai de monsters voorzichtig om bij 4 °C gedurende 1−3 uur of 's nachts.</li>
	<li>Verzamel de kralen met een magnetische standaard voor 30 s en verwijder de supernatant. Was de kralen 2x met 500 μL wasbuffer C (Tabel 1) door zachte rotatie bij RT gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen 2x met 500 μL wasbuffer D (Tabel 1) door 5 minuten op RT te draaien.</li>
	<li>Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer (Tabel 1).</li>
</ol>9. Gedeeltelijke RNA-spijsvertering
<ol><li>Maak een 105-voudigeverdunning van MNase met MNase-reactiebuffer(tabel 1). Voeg aan elk monster 100 μL MNase-oplossing toe. Vortex de kralen op 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) voor 10 min, het verzamelen van de kralen met een magnetische standaard voor 30 s en verwijder de supernatant. OPMERKING: De concentratie van MNase moet worden geoptimaliseerd voor verschillende RNA-bindende eiwitten. De MNase-concentratie die RNAs kan verteren in 30−50 nt-fragmenten (bepaald door de grootte van de insert van de uiteindelijke bibliotheek) is optimaal.</li>
	<li>Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer (Tabel 1). Verzamel de kralen met een magnetische standaard en verwijder de supernatant tussen elke wasstap.</li>
	<li>Was de kralen 2x met 500 μL wasbuffer C door zachte rotatie gedurende 5 minuten bij RT. Was vervolgens snel de kralen 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer.</li>
</ol>10. Dephosphorylation van RNA
<ol><li>Maak een kalfsdarm fosfatase (CIP) reactiemix met 8 μL 10x CIP buffer (Tabel van materialen),3 μL CIP enzym, en 69 μL water. Het totale volume is 80 μL per reactie.</li>
	<li>Verzamel de kralen met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg de CIP-reactiemix toe aan de kralen. Vortex de kralen op 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) gedurende 10 min.</li>
	<li>Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer. Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer.</li>
</ol>11.
<ol><li>Maak een linkermix van 3' met 4 μL van 20 μM 3' linker, 4 μL 10x T4 RNA ligase buffer, 4 μL van 50% PEG8000, 2 μL T4 RNA ligase 2 (afgekapt) en 26 μL water. Het totale volume is 40 μL per reactie.</li>
	<li>Verzamel de kralen van stap 10.3 met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg 40 μL van de 3' linker ligatie mix toe aan de kralen. Vortex de kralen op 16 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) voor 3 uur of 's nachts.</li>
	<li>Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer. Was de kralen snel 2x met 500 μL ijskoude PNK buffer.</li>
</ol>12. PNK-behandeling
<ol><li>Maak een PNK-mix met 4 μL 10x PNK-buffer, 2 μL T4 PNK-enzym, 1 μL atp van 10 m en 33 μL water. Het totale volume is 40 μL per reactie.</li>
	<li>Verzamel de kralen met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg 40 μL PNK-mix toe aan de kralen. Vortex de kralen zachtjes op 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop) gedurende 10 min.</li>
	<li>Was de kralen snel met een 500 μL ijskoude PNK+EGTA buffer.</li>
	<li>Was de kralen snel met een 500 μL ijskoude PNK-buffer. Bespaar 5% van de kralen voor westerse of zilveren vlekken analyse om de efficiëntie van immunoprecipitatie te bevestigen.</li>
</ol>13. RNA-isolatie
<ol><li>Verzamel de kralen van stap 12.4 met een magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg 200 μL eiwitase K digestiebuffer toe(tabel 1). Vortex de kralen voor 30 min bij 37 °C met een thermische mixer ingesteld op 1.200 rpm (5 s run, 30 s stop). Magnetisch isoleren van de kralen en neem de supernatant voor het experiment.</li>
	<li>Voeg vanaf stap 13.1 400 μL RNA isolatiereagens(Tabel van materialen)toe aan de supernatant, meng grondig en broed gedurende 5 minuten op ijs. Voeg 80 μL chloroform toe en meng grondig en broed vervolgens 5 min op het ijs. Spin naar beneden met 12.000 x g gedurende 10 min 4 °C. OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd in een chemische kap.</li>
	<li>Neem de supernatant (~500 μL) en voeg twee volumes isopropanol:ethanolmix (1:1), 1/10 volume van 3 M natriumacetaat (pH = 5,5) en 1 μL glycogeen toe. Vries op -20 °C voor 2 uur. Centrifuge bij 4 °C met 12.000 x g gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Was de pellet 2x met ijskoude 70% ethanol. Draai de pellet naar beneden bij 4 °C met 12.000 x g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en droog de pellet. Los de RNAs op in 5 μL RNase-vrij H2O.</li>
</ol>14. 5' RNA linker ligation
<ol><li>Maak een 5' RNA ligatiemix met 1 μL 10x T4 RNA ligasebuffer, 0,5 μL BSA (1 μg/μL), 1 μL van 10 mM ATP, 1 μL RNase-remmer en 0,5 μL T4L ligase. Het totale volume is 4 μL per reactie.</li>
	<li>Voeg vanaf stap 13.4 1 μL 20 μM RNA linker toe aan het RNA, denatureer het RNA door 2 min 2 min te verwarmen bij 70 °C en ontspan onmiddellijk op ijs.</li>
	<li>Voeg de 5' RNA ligatie mix toe aan het RNA vanaf stap 14.2. Incubeer bij 16 °C 's nachts.</li>
</ol>15. Omgekeerde transcriptie
<ol><li>Zuiver de RNAs zoals beschreven in sectie 13 en los het RNA op met 11,5 μL RNase-vrij water.</li>
	<li>Voeg 1 μL van 10 μM reverse transcriptie primer toe aan het gezuiverde RNA, verwarm 2 min op 70 °C en koel onmiddellijk op ijs.</li>
	<li>Maak een omgekeerde transcriptiemix met 4 μL 5x reverse transcriptiebuffer, 1 μL van 10 mM dPP's, 1 μL van 0,1 M DTT, 1 μL RNase-remmer en 0,5 μL omgekeerde transcriptase (Tabel van materialen). Het totale volume is 7,5 μL per reactie.</li>
	<li>Voeg 7,5 μL omgekeerde transcriptiemix toe aan het RNA, broed gedurende 30 minuten bij 50 °C en stop de reactie bij incubatie bij 70 °C gedurende 10 minuten. Vertrek bij 4 °C.</li>
</ol>16. PCR-versterking
<ol><li>Maak een PCR-versterkingsmix met 15 μL 2x PCR mastermix(Tabel van materialen),5 μL cDNA vanaf stap 15.4; 0,6 μL van 10 μM voorwaartse primer 1 (Tabel 2),0,6 μL van 10 μM reverse primer 1 (Tabel 2), en 8,8 μL van H2O. Het totale volume is 30 μL.</li>
	<li>Versterk de cDNA met de volgende instellingen: 98 °C 30 s, 98 °C 10 s, 60 °C 30 s, 72 °C 30 s (herhaal stappen 2−4 voor 15−20 cycli), 72 °C 2 min, en houd op 4 °C. Voer het PCR-product uit op een 2−3% agarose gel. Knip het DNA van ~100−150 bp uit, haal DNA eruit met gelextractiekit(Tabel van materialen)en ontwijk het DNA met 20 μL water.</li>
	<li>Neem 3 μL van het gezuiverde PCR-product, versterk met voorwaartse primer 2 (Tabel 2) en omgekeerde primer 2 (indexprimer; Tabel 2) zoals beschreven in stap 16.2 voor vijf cycli om indexsequenties in te voeren. Zuiver het PCR-product zoals beschreven in stap 16.2.</li>
	<li>Sequence de bibliotheek met een high-throughput sequencing platform.</li>
</ol>17. Analyse van de bioinformatica
<ol><li>Voer gegevensanalyse uit met behulp van commerciële programma's zoals eerder beschreven8.</li>
</ol>

<ol><li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Guallar, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-dependent+chromatin+targeting+of+TET2+for+endogenous+retrovirus+control+in+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells.</a> Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).</li>
<li>Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Maps+of+ProQ+Binding+In+Vivo+Reveal+Target+Recognition+via+RNA+Structure+and+Stability+Control+at+mRNA+3%27+Ends%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends.</a> Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).</li>
<li>Wei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RBFox2+Binds+Nascent+RNA+to+Globally+Regulate+Polycomb+Complex+2+Targeting+in+Mammalian+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes.</a> Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).</li>
<li>Kim, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PARP-1+by+snoRNAs+Controls+Ribosome+Biogenesis+and+Cell+Growth+via+the+RNA+Helicase+DDX21%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21.</a> Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).</li>
<li>Yao, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+Pre-rRNA+Sorting+via+Phase+Separation+Drives+the+Assembly+of+Dense+Fibrillar+Components+in+the+Human+Nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus.</a> Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Moore, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+Argonaute+and+conventional+RNA-binding+protein+interactions+with+RNA+at+single-nucleotide+resolution+using+HITS-CLIP+and+CIMS+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).</li>
<li>Konig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iCLIP--transcriptome-wide+mapping+of+protein-RNA+interactions+with+individual+nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2638(2011).</li>
<li>Zarnegar, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((irCLIP+platform+for+efficient+characterization+of+protein-RNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions.</a> Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), e2034(2010).</li>
<li>de Boer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+biotinylation+and+single-step+purification+of+tagged+transcription+factors+in+mammalian+cells+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).</li>
<li>Bi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Targets+Ribogenesis+Factor+WDR43+to+Chromatin+for+Transcription+and+Pluripotency+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control.</a> Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).</li>
<li>Heo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TUT4+in+concert+with+Lin28+suppresses+microRNA+biogenesis+through+pre-microRNA+uridylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation.</a> Cell. 138 (4), 696-708 (2009).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+Is+a+Suppressor+of+ER-Associated+Translation+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li>
<li>Zhao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+specific+roles+for+the+ribosome+biogenesis+factor+Wdr43+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development.</a> PLoS Genetics. 10 (1), 1004074(2014).</li>
<li>Wilbert, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28+binds+messenger+RNAs+at+GGAGA+motifs+and+regulates+splicing+factor+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance.</a> Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).</li>
<li>Hunziker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UtpA+and+UtpB+chaperone+nascent+pre-ribosomal+RNA+and+U3+snoRNA+to+initiate+eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly.</a> Nature Communications. 7, 12090(2016).</li>
<li>Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+vivo+biotinylation+to+study+protein-protein+and+protein-DNA+interactions+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).</li>
<li>Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+piggyBac+transposon-based+mammalian+cell+expression+system+for+inducible+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The Western Blot.</a> Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Aktas, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX9+suppresses+RNA+processing+defects+originating+from+the+Alu+invasion+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome.</a> Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Crosslinking+Immunoprecipitation+%28eCLIP%29+Method+for+Efficient+Identification+of+Protein-bound+RNA+in+Mouse+Testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis.</a> Journal of Visualized Experiments. (147), e59681(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier introduceren we een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq, gebruik te maken van de FLAG-biotine dubbele tagging systeem om tandem zuivering van eiwit-RNA complexen uit te voeren. Het FLAG-biotine dubbele tagging systeem is aangetoond dat krachtig zijn in het identificeren van eiwit-eiwit en eiwit-DNA interacties13,21. Hier tonen we de hoge specificiteit en het gemak van dit systeem in het identificeren van de RNAs interactie met eiwitte...

RNAs en RNA-bindende eiwitten (RBPs) controleren diverse cellulaire processen, waaronder splicing, vertaling, ribosoom biogenese, epigenetische regulatie en cellotovergang1,2,3,4,5,6. De delicate mechanismen van deze processen zijn afhankelijk van de unieke ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs. Daarom is een belangrijke stap in de richting van het begrijpen van RNA-regulatie op moleculair niveau het onthullen van de positionele informatie over de bindende sites van RBPs.
Een strategie aangeduid als cross-linking en immunoprecipitatie (CLIP-seq) is ontwikkeld om eiwit-RNA interacties met UV-kruisverband, gevolgd door immunoprecipitatie van het eiwit van belang7vast te leggen. Het belangrijkste kenmerk van de methodologie is de inductie van covalente kruisverbanden tussen een RNA-bindend eiwit en de direct gebonden RNA-moleculen (binnen ~1 Å) door UV-bestraling8. De RBP-voetafdrukken kunnen worden bepaald door cliptagclustering en piekbeling, die meestal een resolutie van 30−60 nt hebben. Als alternatief kan de omgekeerde transcriptiestap van CLIP leiden tot indels (invoegingen of verwijderingen) of vervangingen naar de kruisverkoppelingssites, waardoor eiwitbindende sites op de RNAs kunnen worden geïdentificeerd met een resolutie met één nucleotide. Pijpleidingen zoals Novoalign en CIMS zijn ontwikkeld voor de analyse van de high-throughput sequencing resultaten van CLIP-seq8. Er zijn ook verschillende gewijzigde CLIP-seq-methoden voorgesteld, waaronder cross-linking en immunoprecipitatie (iCLIP), verbeterde CLIP (eCLIP), irCLIP en foto-activiteiten van ribonucleoside-enhanced cross-linking en immunoprecipitatie (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Ondanks het brede gebruik van traditionele CLIP-seq methoden in de studie van RBPs, de CLIP methoden hebben verschillende nadelen. Ten eerste kan de vervelende gedenatureerde gel elektroforese en membraan overdracht procedure leiden tot verlies van informatie, en leiden tot beperkte volgorde complexiteit. Ten tweede kan de op eiwitten gebaseerde CLIP-methode een eiwitcomplex in plaats van één enkel doeleiwit naar beneden trekken, wat kan leiden tot vals-positieve eiwit-RNA-interacties van de copurified RBPs. Ten derde vereist de op antilichamen gebaseerde strategie een grote hoeveelheid hoogwaardige antilichamen, waardoor de toepassing van deze methoden ontoereikend is voor de studie van RBPs zonder beschikbare antilichamen van hoge kwaliteit. Ten vierde vereist de traditionele CLIP-methode radiogelabelde ATP om de eiwitgebonden RNAs te labelen.
De hoge affiniteit van streptavidin aan biotinylated eiwitten maakt het een zeer krachtige benadering om specifieke eiwitten of eiwitcomplexen te zuiveren. De efficiënte biotinylatie van eiwitten die een kunstmatige peptide sequentie door ectopisch uitgedrukt bacteriële BirA biotine ligase in zoogdiercellen maakt het een efficiënte strategie om biotine zuivering uit te voeren in vivo13. We ontwikkelden een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq(FLAG-Biotin-gemedieerde Cross-linkt en ikmmunoprecipitatie gevolgd door high-throughput sequencing) met behulp van FLAG-biotine tag tandem zuivering14 (Figuur 1). Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interagerende RBP's verwijderd(figuur 2). De strenge wasomstandigheden maken het ook mogelijk om de SDS-PAGE en membraanoverdracht te omzeilen, wat arbeidsintensief en technisch uitdagend is. En vergelijkbaar met eCLIP en irCLIP, is de FbioCLIP-seq methode isotoopvrij. Het overslaan van de gel lopen en overdracht stappen vermijdt het verlies van informatie, houdt authentieke eiwit-RNA interacties intact, en verhoogt de complexiteit van de bibliotheek. Bovendien maakt de hoge efficiëntie van het tagging-systeem het een goede keuze voor RBPs zonder hoogwaardige antilichamen beschikbaar.
Hier geven we een stapsgewijze beschrijving van het FbioCLIP-seq protocol voor zoogdiercellen. Kortom, cellen zijn cross-linked door 254 nm UV, gevolgd door cellyse en FLAG immunoprecipitatie (FLAG-IP). Vervolgens worden de eiwit-RNA complexen verder gezuiverd door biotine affiniteit vastleggen en RNAs zijn gefragmenteerd door gedeeltelijke spijsvertering met MNase. Vervolgens wordt het eiwitgebonden RNA gedephosphorylated en met een 3' linker gebonden. Een 5' RNA linker wordt toegevoegd nadat het RNA is fosforylated met PNK en geëuterd door proteinase K spijsvertering. Na omgekeerde transcriptie worden de eiwitgebonden RNA-signalen versterkt door PCR en gezuiverd door agarose gelzuivering. Twee RBPs werden gekozen om de FbioCLIP-seq resultaat te illustreren. LIN28 is een goed gekarakteriseerd RNA-bindend eiwit dat betrokken is bij microRNA-rijping, eiwitvertaling en celherprogrammering15,16,17. WDR43 is een WD40 domein-bevattende eiwit dacht te coördineren ribosoom biogenese, eukaryotische transcriptie, en embryonale stamcel pluripotentie controle14,18. In overeenstemming met eerder gerapporteerde resultaten voor LIN28 met CLIP-seq, FbioCLIP-seq onthult bindende sites van LIN28 op "GGAG" motieven in de microRNA mir-let7g en mRNAs16,19 (Figuur 3). WDR43 FbioCLIP-seq identificeerde ook de bindende voorkeur van WDR43 met 5' externe transcribed spacers (5'-ETS) van pre-rRNAs20 (Figuur 4). Deze resultaten valideren de betrouwbaarheid van de FbioCLIP-seq methode.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker</td><td>UVP</td><td>HL-2000 HybrilLinker</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Affinity Purification Beads</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG beads</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin beads</td><td>Invitrogen</td><td>112.06D</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Gibco</td><td>70013032</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>3 x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>CIP</td><td>NEB</td><td>M0290S</td><td>CIP buffer is in the same package.</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Gel purification kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449172</td><td></td></tr><tr><td>MNase</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amresco</td><td>M158-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Porteinase K</td><td>TAKARA</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Q5 High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>NEB</td><td>0492S</td><td></td></tr><tr><td>reverse trancriptase (SupperScriptIII)</td><td>Invitrogen</td><td>18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNA isolation reagent (Trizol)</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNase Inhibitor</td><td>ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>PNK buffer is in the same package.</td></tr><tr><td>T4 RNA ligaes</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0021</td><td>T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package.</td></tr><tr><td>T4 RNA ligase2, truncated</td><td>NEB</td><td>M0242S</td><td>T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package.</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208884</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mESC culture medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM (80%)</td><td>Gibco</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>FCS (15%)</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (1%)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td></td><td></td><td>purified recombinant protein; 10,000 fold dilution</td></tr><tr><td>NEAA (1%)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Nucleoside mix (1%)</td><td>Millipore</td><td>ES-008-D</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (1%)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA gel extraction kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

transcriptome-wide profilering van protein-rna interacties door cross-linking en immunoprecipitatie gemedieerd door flag-biotine tandem purification

Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification

RNA en RNA-bindende eiwitten (RBPs) beheersen meerdere biologische processen. De ruimtelijke en temporele opstelling van RNAs en RBPs ligt ten grondslag aan de delicate regulering van deze processen. Een strategie genaamd CLIP-seq (cross-linking en immunoprecipitatie) is ontwikkeld om endogene eiwit-RNA interacties met UV cross-linking, gevolgd door immunoprecipitatie vast te leggen. Ondanks het brede gebruik van conventionele CLIP-seq-methode in RBP-studie, wordt de CLIP-methode beperkt door de beschikbaarheid van hoogwaardige antilichamen, potentiële verontreinigingen van de copurified RBPs, de vereiste van isotopenmanipulatie en mogelijk verlies van informatie tijdens een vervelende experimentele procedure. Hier beschrijven we een gewijzigde CLIP-seq methode genaamd FbioCLIP-seq met behulp van de FLAG-biotine tag tandem zuivering. Door middel van tandemzuivering en strenge wasomstandigheden worden bijna alle interactierna-bindende eiwitten verwijderd. Zo worden de RNAs die indirect door deze copurified RBPs worden bemiddeld, ook verminderd. Onze FbioCLIP-seq methode maakt efficiënte detectie van directe eiwitgebonden RNAs zonder SDS-PAGE en membraan overdracht procedures in een isotoop-vrije en eiwit-specifieke antilichaam-vrije manier.

De schematische weergave van de FbioCLIP-seq procedure is weergegeven in figuur 1. Vergeleken met FLAG-gemedieerde of streptavidin-gemedieerde eenstapsaffiniteitszuivering, verwijderde FLAG-biotine tandemzuivering bijna alle copurified eiwitten, waardoor de verontreiniging van indirecte eiwit-RNA-interacties werd vermeden(figuur 2). Representatieve resultaten voor FbioCLIP-seq voor LIN28 en WDR43 zijn afgebeeld in figuu...

Hier presenteren we een gewijzigd CLIP-seq protocol genaamd FbioCLIP-seq met FLAG-biotine tandem zuivering om de RNA doelen van RNA-bindende eiwitten (RBPs) in zoogdiercellen te bepalen.

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

RNA and RNA-binding proteins (RBPs) control multiple biological processes. The spatial and temporal arrangement of RNAs and RBPs underlies the delicate ...

Alleen en alleen bindende eiwitten beheersen meerdere biologische processen. Deze FLAG-Biotine CLIP-seq methode, vandaar om wereldwijd profiel van de speciale en de temporele regeling van RNAs en RBPs in zoogdiercellen. Deze methode maakt een efficiënte detectie van directe eiwitgebonden RNAs mogelijk zonder SDS-PAGE en de membraanoverdrachtsprocedures.In vergelijking met traditionele CLIP-seq isisotoop vrij en het vereist geen eiwitspecifiek antilichaam. Begin met het plating ongeveer 3 miljoen muis embryonale STAM cellen in een 10 centimeter plaat en uitbroeden ze 's nachts. Verwijder de volgende dag het medium met een vacuüm en behandel de cellen met twee milliliter van 0,25% trypsin EDTA gedurende twee minuten bij kamertemperatuur.Blus de trypsine met vier milliliter vers MESC-medium en breng de cellen over op een centrifugebuis van 15 milliliter. Dan, centrifuge ze op 300 keer G gedurende drie minuten op vier graden Celsius en verwijder de supernatant. Hang de cellen in vier milliliter koude PBS en breng ze terug naar de 10 centimeter plaat voor cross-linking.Straal de cellen uit met een 254 nanometer UV-licht en breng de gekoppelde cellen vervolgens over naar een buis van 15 milliliter. Draai deze cellen drie minuten naar beneden op 300 g bij vier graden Celsius, verwijder vervolgens de supernatant en lyse de cellen met 500 microliters van Buffer A bereid volgens manuscriptrichtingen. Breng de cellen naar een RNAse-vrije 1,5 milliliter buis, en uitbroed ze op vier graden Celsius met zachte rotatie gedurende 30 tot 60 minuten.Behandel het lysaat met 30 microliter DNAse 1 bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Stop vervolgens de reactie door vier microliters van 0,5 molaire EDTA toe te voegen. Draai de onoplosbare pellet door centrifugeren op 12,000 keer G gedurende 20 minuten op vier graden Celsius, en breng de supernatant naar een nieuwe voorgekoelde 1,5 milliliter buis.Breng het cellysaat over op vooraf geëquilibreerde FLAG-kralen en broed het monster uit op vier graden Celsius terwijl u twee tot vier uur draait. Na de incubatie, centrifugeren de kralen gedurende twee minuten op 3000 keer G en verwijder de supernatant. Voeg 500 microliters van Buffer A toe aan het monster en broed gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius, draai vervolgens de kralen naar beneden en verwijder de supernatant.Herhaal de was met Buffer A, gevolgd door twee wasbeurten met voorgekoelde Buffer B.To elute met een drie X FLAG-peptide, bereid de elutie oplossing zoals beschreven in de tekst manuscript en spin vaststelling van de FLAG-kralen. Verwijder de supernatant met een smalle eind pipet tip en voeg 200 microliter van de drie X FLAG elution oplossing aan elk monster. Incubeer de monsters gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zachte rotatie.Draai vervolgens twee minuten naar beneden bij 3000 keer G.Breng de supernate over naar een verse buis en herhaal de elutie twee keer. Bespaar 5% van de eluents voor westerse vlekkenanalyse of zilvervlekken om de efficiëntie van FLAG immunoprecipitatie te controleren. Breng de getrokken eluents naar voorbereide streptavidin kralen en draai de monsters zachtjes op vier graden Celsius gedurende een tot drie uur of 's nachts.Verzamel vervolgens de kralen op een magnetische standaard en verwijder de supernatant. Was de kralen twee keer met 500 microliter buffer C met zachte rotatie gedurende vijf minuten per wasbeurt. Was vervolgens de kralen twee keer met 500 microliters van Buffer D, en twee keer met 500 microliters ijskoude PNK-buffer, verzamel de kralen op de magnetische standaard en verwijder de supernatant tussen de wasbeurten.Om gedeeltelijke RNA-spijsvertering uit te voeren, voegt u 100 microliters MNA-oplossing toe aan elk monster en vortex die is ingesteld op 37 graden Celsius met een thermische mixer gedurende 10 minuten. Verzamel de kralen met een magnetische standaard gedurende 30 seconden en verwijder de supernatant. Was ze vervolgens met de PNK-EDTA-buffer, buffer C en PNK-buffer volgens de handschriftaanwijzing.Verzamel de kralen met de magnetische standaard en verwijder de buffer. Voeg vervolgens de CIP-reactiemix toe en draaivors de kralen op 37 graden Celsius met een thermische mixer gedurende 10 minuten. Was de kralen snel twee keer met 500 microliters ijskoude PNK EDTA-buffer, gevolgd door twee wasbeurten met 500 microliters ijskoude PNK-buffer.Voeg na de wasbeurten 40 microliters van drie prime linker ligatiemix toe aan de kralen en draai ze drie uur of 's nachts met een thermische mixer. Efficiënte ligatie van de linker aan de bondgenoten is van cruciaal belang voor dit experiment. Controleer af en toe de reactiebuis om ervoor te zorgen dat deze niet neerslaan tijdens ligatie.Herhaal na de incubatie de wasbeurten met PNK EDTA- en PNK-buffers, voeg 40 microliter PNK gemengd toe aan de kralen en draai ze 10 minuten lang met de thermische mixer. Was de kralen met PNK EDTA- en PNK-buffers en ga vervolgens verder met RNA-isolatie zoals beschreven in het tekstmanuscript. Vergeleken met VLAG-gemedieerde of streptavidin bemiddelde een stap affiniteit zuivering, FLAG-Biotine tandemzuivering verwijderd bijna alle kern gezuiverde eiwitten, het vermijden van de verontreiniging van indirecte eiwit RNA interacties.LIN28 en WDR43, Fbio CLIP-seq werd uitgevoerd met behulp van muis embryonale STEM cellen. In totaal werden ongeveer 7,7 miljoen en 2,2 miljoen unieke reads opgehaald voor respectievelijk LIN28 en WDR43. Vergelijking van de track views tonen verschillende bindingspatronen in de RN45 pre-rRNA locus.De cross-linked sites op de GGA G motief van pre-let7-g RNA door LIN28, Fbio CLIP-seq of geïdentificeerd. Bovendien werden verrijkte RNA-motieven in de bindingsplaatsen en het percentage gemuteerde nucleotiden in verschillende soorten mutaties bepaald. Laten zien dat LIN28 zich liever bindt aan de gen nucleotide.Om 22:00 uur, dit protocol, is het belangrijk om de efficiëntie van de immunoprecipitatie te bevestigen om ervoor te zorgen dat de eiwitcomplexen met succes werden gezuiverd.

transcriptome-wide-profiling-protein-rna-interactions-cross-linking

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

De ruimtelijke ordening van RNA-bindende eiwitten op een transcript is een belangrijke determinant van post-transcriptionele regulatie. Daarom ontwikkelden we de individuele-nucleotide resolutie van UV-crosslinking en immunoprecipitatie (iClip) dat precieze genoom-brede kartering van de bindingsplaatsen van een RNA-bindend eiwit maakt.

iClip - Transcriptome-breed in kaart brengen van eiwit-RNA Interacties met Individual Nucleotide resolutie

We hebben een werkwijze voor het zuiveren van eiwitten mederegulerende interactie met de LC-MS / MS systeem.

Een eiwit Bereidingswijze voor de High-throughput identificatie van eiwitten Interactie met een nucleair Cofactor Met behulp van LC-MS / MS Analysis

Hier worden we gedetailleerd beschreven over de methode van S- vergelijking van P- soralen verknoopt, L igated en S gekozen H ybrids (SPLASH), die genoom-wide mapping van intramoleculaire en intermoleculaire RNA-RNA interacties in vivo mogelijk maakt . SPLASH kan toegepast worden om RNA-interacties van organismen te bestuderen, waaronder gist, bacteriën en mensen.

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

Een gedetailleerd protocol voor de toepassing van de klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vastleggen (CARIC) strategie ter identificatie van eiwitten bindende naar beide taalcode-instellingen en noncoding RNAs wordt gepresenteerd.

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

Hier presenteren we een protocol om endogene RNA binding sites of "Footprints" van RNA: proteïne (RNP) complexen uit zoogdiercellen te verrijken. Deze aanpak omvat twee immunoprecipitaties van RNP-subeenheden en wordt daarom nagesynchroniseerde RNA-immunoprecipitatie in tandem (RIPiT).

Identificatie van voetafdrukken van RNA: eiwitcomplexen via RNA-immunoprecipitatie in tandem gevolgd door sequencing (RIPiT-SEQ)

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Co-translationele interacties spelen een cruciale rol bij ontluikende ketenaanpassingen, targeting-, vouw- en assemblagepaden. Hier beschrijven we Selective Ribosome Profiling, een methode voor in vivo, directe analyse van deze interacties in het model eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

Wereldwijde identificatie van co-translationele interactienetwerken door selectieve ribosoomprofilering

Hier presenteren we een geoptimaliseerde in vitro methode om eiwitinteractoren van specifieke RNA-sequenties te ontdekken, kwantificeren en valideren, met behulp van totaal eiwitextract uit menselijke cellen, streptavidineparels bedekt met gebiotinyleerd RNA en massaspectrometrie-analyse.

Een geoptimaliseerde kwantitatieve pull-down analyse van RNA-bindende eiwitten met behulp van kort gebiotinyleerd RNA

Leer Fbio CLIP-seq voor transcriptoom-brede profilering van eiwit-RNA-interacties in zoogdiercellen. Deze methode detecteert direct gebonden RNA's efficiënt zonder SDS-PAGE en is isotoopvrij.

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification (Video) | JoVE Journal

Transcriptome-Wide Profilering van Protein-RNA Interacties door Cross-Linking en Immunoprecipitatie Gemedieerd door FLAG-Biotine Tandem Purification

Meer video's verkennen