Lokalisatie en kwantificering van Begomovirussen in Whitefly Weefsels door immunofluorescentie en kwantitatieve PCR

Het verduidelijken van de ruimtelijkheid en de hoeveelheid virus in wittevliegvectoren kan helpen bij het begrijpen van begomovirus-wittevlieginteracties en bij de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor het beheersen van ernstige begomovirale ziekten. De voordelen van deze techniek zijn dat we snel wittevliegweefsels kunnen isoleren, virale en wittevliegeiwitten kunnen colokaliseren en virussen kunnen kwantificeren in wittevliegn en met virussen geïnfecteerde planten. Op het juiste experimentele tijdstip, na virusverwerving, plaats ijsverdoofde vrouwelijke wittevliegen in een druppel PBS op een microscoopdia en gebruik een fijne acupunctuurnaald om de buik van de wittevlieg onder een stereomicroscoop te openen.

Gebruik de naald om de midgut te extraheren en plaats de midgut in een collectie schotel van PBS. Om de PSG's te verzamelen, splits het lichaam aan de thorax van de rugzijde in de buurt van het hoofd en bevestig de wittevlieg met een naald door de thorax. Gebruik een tweede naald om de wittevlieg te schudden totdat de twee speekselklieren zijn gescheiden van het lichaam en breng de klieren naar een nieuwe schotel van PBS.

Om de eierstokken te verzamelen, open de buik volledig en gebruik een naald om de eierstokken van de andere weefsels te scheiden. Gebruik een pipet om het overtollige weefsel te verwijderen en de eierstokken over te brengen in een nieuwe schotel van PBS. Om een hemolymph monster te verzamelen, voeg 10 microliter PBS op een nieuwe microscoop dia en plaats een nieuwe wittevlieg in de druppel.

Gebruik een fijne acupunctuur naald om voorzichtig een gat in de buik te maken. Breng vervolgens lichte druk op de buik om de hemolymph los te laten in de buffer en het verzamelen van een acht microliter monster van de vloeistof. Om TYLCV lokalisatie in geoogste wittevlieg PSG, midgut, of eierstokweefsels te visualiseren, breng 15 tot 20 exemplaren in een glas 3.5 centimeter Petri schotel en aspirate de overtollige buffer.

Bevestig de weefsels in een milliliter van 4%paraformaldehyde gedurende twee uur bij kamertemperatuur voordat u de monsters drie keer gedurende twee minuten zorgvuldig wast in één milliliter verse tbs per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, permeabilize de monsters met een milliliter van 0,5%Triton X-100 gedurende 30 minuten voor het wassen drie keer zoals net aangetoond met een milliliter tbs per wasbeurt. Blokkeer na de laatste wasbeurt elke niet-specifieke binding met één milliliter van 1%runderserum albumine gedurende twee uur bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten in tbst zoals aangetoond.

Na de laatste wasbeurt, label de cellen met de primaire antilichamen van belang 's nachts op vier graden Celsius beschermd tegen licht. De volgende ochtend, was de monsters drie keer met TBST voor het toevoegen van de juiste secundaire antilichamen gedurende twee uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de midguts drie keer en breng de exemplaren naar een schone microscoop dia.

Verwijder zoveel mogelijk buffer en bevlek de kernen met een druppel DAPI voordat u met een coverslip wordt gemonteerd en de gelabelde weefsels door confocale microscopie onderzoekt. Voor tylcv kwantificering, was de geoogste wittevlieg weefsel monsters twee tot drie keer in verse PBS en breng 20 midguts, 20 PSGs, of een eierstok in vijf microliter PBS in individuele PCR buizen met 25 microliter lyse oplossing. Voeg vijf tot zeven twee millimeter diameter keramische kralen aan elke buis en maal de monsters in een homogenisator.

Voeg een acht microliter monster van hemolymph in een nieuwe PCR buis en voeg 10 microliter lyse aan de buis met grondig mengen. Broed alle monsters op 65 graden Celsius gedurende een uur, gevolgd door een 10-minuten incubatie bij 100 graden Celsius en een korte centrifugatie. Voeg vervolgens 18 microliters van master mix in de flacons van kwantitatieve PCR strip buizen en voeg twee microliters van elk DNA monster aan ten minste drie flesjes.

Wanneer alle monsters zijn geladen, sluit u de buizen en centrifuge de oplossing op de bodem van elke flacon. Laad de flacons op een real-time thermische cycler voor kwantitatieve PCR, het selecteren van cyber als de fluorofophore kleurstof en onbekend als het monster type. Exporteer vervolgens de kwantitatieve gegevens naar een spreadsheet voor analyse van de relatieve hoeveelheid viraal DNA in elk monster.

Hier worden representatieve afbeeldingen van TYLCV in DAPI-vlekken in wittevlieg-PSG's, midguts en eierstokken getoond. Zoals waargenomen, tvLCV toont een grotere accumulatie binnen de PSG's en midguts dan in de eierstokken. Kwantificering van het virus in wittevliegSgs, midguts, hemolymph en eierstokken na het voeden met met TYLCV geïnfecteerde tomaat gedurende 24, 48 en 72 uur geeft aan dat de hoeveelheid virus toeneemt in verschillende wittevliegweefsels in directe correlatie met de toename van de toegang tot de verwerving.

Het is het beste om verse wittevliegen te gebruiken, omdat dode insecten de moeilijkheidsgraad van dissectie zullen verhogen. Na deze procedure kunnen andere analyses, zoals westerse blotting en co-immunoprecipitatie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen over virale eiwitexpressie en virale en vectoreiwitinteracties te beantwoorden.