Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

De bereiding van fluorescerende antibiotica maakt het mogelijk om de lokalisatie van deze therapeutische reagentia binnen bacteriën te beoordelen door middel van handige analytische technieken zoals spectrofotometrie en microscopie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is het gemak waarmee de antibioticalokalisatie kan worden bepaald. Deze lokalisatie is relevant voor een aantal verschijnselen, waaronder efflux.

Om de klik uit te voeren Een reactieprocedure, plaats het azide antibioticum van belang in een ronde bodemkolf en voeg 25 milliliter tert-butanol en 25 milliliter water per millimole azide toe aan de kolf. Voeg de bereide fluorofofokoe kyne toe aan de oplossing en verwarm de reactie op 50 graden Celsius. Voeg vervolgens 0,6 equivalenten van kopersulfaat en 2,4 equivalenten ascorbinezuur toe aan de kolf.

Roer de reactie gedurende een uur of totdat de analyse door LCMS geeft reactie voltooiing. Dan afkoelen en zuiveren van de reactie indien van toepassing voor het antibioticum steiger. Hier wordt de belangrijkste kliktrichemiereactie voor de bereiding van fluorescerende antibiotica met voorbeelden van de structuur gesynthetiseerd van de overeenkomstige antibiotica via een azide intermediate op basis van ciprofloxatine, linezolid en trimethoprim getoond.

In deze vloeibare chromatografie massaspectrometrie sporen van een ciprofloxatine azide en een NBD alkyne klikreactie, werd de azide op 3,2 minuten geëlueerd en het product werd op 3,8 minuten geëutteerd. De voortgang van de klikreactie kan worden gevolgd door het verdwijnen van de azidepiek. In deze spectra kan de impact van de zuivering worden gevisualiseerd met foutieve pieken die verdwijnen.

Om de antimicrobiële activiteit van het gesynthetiseerde antibioticum te beoordelen, streep glycerol voorraden van bacteriële stammen geschikt voor het antibioticum steiger op LB agar platen en groeien de culturen 's nachts op 37 graden Celsius. De volgende ochtend, kies een enkele kolonie uit elke plaat en cultuur de kolonies 's nachts in vijf milliliter CAMHB per cultuur op 37 graden Celsius. De volgende dag, verdun de culturen ongeveer 40-voudig in verse CAMHB en groeien de bacteriën tot halverwege log fase met een optische dichtheid op 600 nanometer tussen 0,4 en 0,8.

Bereid vervolgens voorraadoplossingen voor van elk fluorescerend antibioticum met 1,28 milligram per milliliter in 20%dimethylsulfoxide in steriel water en voeg 10 microliter antibiotica toe aan elke put van de eerste kolom van een 96-putplaat. Voeg 90 microliter CAMHB toe aan elke put van de eerste kolom en 50 microliter aan alle andere putten. Voer vervolgens een seriële tweevoudige verdunning over de plaat uit.

Verdun na het grondig mengen de mid log fase culturen tot ongeveer één keer 10 tot de zesde kolonie vormende eenheden per milliliter en voeg 50 microliter van elke cultuur toe aan de verdunningsputten om een definitieve concentratie van ongeveer vijf keer 10 aan de vijfde kolonievormende eenheden per milliliter te verkrijgen. Wanneer alle bacteriën zijn verguld, plaats deksels op de platen en broeden de culturen voor 18 tot 24 uur op 37 graden Celsius zonder te schudden. De volgende dag, visueel inspecteren van de platen.

De minimale remmingsconcentratie is de laagste concentratie goed zonder zichtbare groei. Voor sonde accumulatie analyse, streep glycerol voorraden van de bacteriële stammen op LB agar platen voor een nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius. De volgende ochtend, kies een enkele kolonie van de plaat voor 's nachts cultuur in lysogeny bouillon op 37 graden Celsius.

De volgende ochtend, verdun de nachtelijke cultuur ongeveer 50-voudig in vers medium. Wanneer de cultuur halverwege de logfase bereikt, pellet de bacteriën door centrifugatie en decanteren het medium. Resuspend de bacteriën in een milliliter PBS en centrifugeren de bacteriën weer.

Decanteer de supernatant en resuspend de gewassen pellet in PBS tot een optische dichtheid op 600 nanometer van twee. Voeg 10,1 microliter van 10 millimolar CCCP in PBS toe aan een milliliter bacteriën en incubeer de bacteriën gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Verzamel aan het einde van de incubatie de bacteriën door centrifugatie en verdaag de pellet in één milliliter van 10 tot 100 micromolar fluorescerende antibioticaoplossing in PBS.

Na een incubatie van 30 minuten bij 37 graden Celsius, was de cellen door centrifugatie vier keer in een milliliter koude PBS per wasbeurt. Na de was, lyse de bacteriën met 180 microliters van lyse buffer en 70 microliter van lysozyme. Na 30 minuten bij 37 graden Celsius, vries-dooi de bacteriën drie keer bij min 78 graden Celsius gedurende vijf minuten en 34 graden Celsius gedurende 15 minuten respectievelijk.

Na de laatste ronde van vriesdooien, sonicate het monster gedurende 20 minuten, gevolgd door een 30 minuten incubatie op 65 graden Celsius. Verzamel aan het einde van de incubatie het gelyseerde monster door centrifugatie en zeef de buisinhoud door een filtermembraan van 10 kilodalton. Was het filter vier keer met 100 microliters water per wasbeurt en aliquot elk wassen in individuele putten van een zwarte platte bodem 96-put plaat.

Meet vervolgens de fluorescentieintensiteit op een plaatlezer met excitatie en emissiegolflengten die geschikt zijn voor de fluorofofoër. Deze typische resultaten van de beoordeling van intracellulaire accumulatie door fluorescentiespectroscopie in aanwezigheid en afwezigheid van efflux tonen aan dat de intracellulaire fluorescentie van de bacteriën aanzienlijk hoger is na de voorbehandeling met CCCP, wat aangeeft dat efflux de accumulatie in de bacteriën vermindert. In deze representatieve confocale microscopie beelden van Gram positieve en Gram negatieve bacteriën, de lokalisatie van het antibioticum in de bacteriën kan worden gevisualiseerd na CCCP behandeling.

Dit fenomeen wordt niet waargenomen wanneer er geen CCCP wordt toegevoegd. Bij het gebruik van fluorescerende antibiotica, rekening houden met welke informatie u gericht bent te verzamelen en zorg ervoor dat te overwegen welk protocol het meest nuttig zal zijn bij het verkrijgen van deze gegevens. Na hun synthese kunnen fluorescerende antibiotica worden gebruikt om een aantal bacteriële processen te bestuderen, waaronder interacties met geneesmiddelen en resistentiewijzigingen.