Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie
February 2nd, 2020
Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.
Deze methode biedt een manier om levergrootte in larve zebravissen te kwantificeren. Het maakt het ook mogelijk voor de beoordeling van de effecten van genetische en farmacologische manipulatie op de groei van de lever en ontwikkeling. Deze techniek biedt een snelle en nauwkeurige manier om de lever en de darm en alvleesklier te visualiseren en te meten.
Naast het kwantificeren van levergrootte, deze dissectie methode kan nuttig zijn voor de voorbereiding van de lever, darm, en alvleesklier voor in situ hybridisatie of confocale beeldvorming. Voordat u probeert te deskinning op experimentele larven, zorg ervoor dat u hebt besteed voldoende tijd oefenen op niet-experimentele monsters en hebben een aanzienlijk slagingspercentage. Het is van cruciaal belang om de juiste oriëntatie en beweging van zebravissen larven en tangen te visualiseren om de huid te verwijderen zonder de omliggende organen te storen.
Gebruik na drie tot zeven dagen na de bevruchting, na euthanaseren van larven, een glazen pipet- en pipetpomp om tot 15 larven in een twee milliliterbuis te verzamelen. Was larven twee keer met een milliliter koude 1X PBS op ijs. Verwijder zoveel mogelijk PBS met behulp van een glazen pipet en pipet pomp en voeg een milliliter koude vier procent PFA in PBS.
Incubeer op vier graden Celsius ten minste 's nachts met zachte schommelen. Verwijder met behulp van een glazen pipet- en pipetpomp de PFA uit de buis en spoel drie keer af met één milliliter koude PBS. Rock gedurende vijf minuten tussen spoelt.
Pipette verschillende larven in PBS in een put van negen-goed ronde bodem glazen schotel. Onder een microscoop, verwijder de huid rond de lever met behulp van fijne tangen om een larve op zijn rug te houden, aan beide zijden van het hoofd zo voorzichtig mogelijk vast te grijpen. Gebruik dan zeer fijne tangen in de andere hand om de huid te grijpen net boven het hart.
Trek de huid diagonaal naar beneden naar de staart van de vis in de bodem van de schotel aan de linker- of rechterkant van de vis. Herhaal dit voor de andere kant. Blijf flappen van de huid grijpen en naar beneden trekken totdat alle huid en melanoforen boven of in de buurt van de lever zijn verwijderd.
Als dooier aanwezig is voor vijf tot zes dagen na de bevruchting larven, til de dooier af in een stuk door het houden van de vis met fijne tangen op zijn rug en met behulp van de zeer fijne tangen om zachtjes prik de dooier. Voor drie tot vier DPF larven, houd de vis met fijne tangen op zijn rug en gebruik de zeer fijne tangen om de dooier te aaien vanaf de ventrale kant. Schraap de dooier in stukken.
Plaats de ontleed larven in verse, koude PBS in een twee milliliter buis met behulp van een glazen pipet en pipetpomp. Om de larven te monteren, giet een paar milliliter van drie procent methylcellulose op het deksel van schone, plastic petrischaal. Gebruik een glazen pipet- en pipetpomp om larven toe te voegen aan de methylcellulose, waarbij zo weinig PBS met de larven wordt toegevoegd.
Gebruik onder een ontledende microscoop bij lage vergroting fijne tangen om de vis te oriënteren, zodat ze aan hun rechterkant naar links liggen. Bevestig dat de te fotograferen vis perfect is uitgelijnd met het ene oog direct op het andere oog. Als de staart van de vis is gebogen, verwijder de staart door het krachtig te knijpen met tangen om het te verwijderen, zodat de vis plat ligt.
Zoom in op hoge vergroting en focus op de lever, om ervoor te zorgen dat de omtrek van de lever duidelijk zichtbaar is. Druk op de knop Afbeelding vastleggen om een afbeelding vast te maken en het bestand op te slaan. Herhaal dit voor alle vissen, ervoor te zorgen dat de vergroting is hetzelfde voor elke foto.
Maak een foto van een micrometer met dezelfde vergroting. Om het programma R te gebruiken om alle leverfoto's te verblinden om potentiële onderzoekerbias te vermijden en wetenschappelijke strengheid te bevorderen, anders bestanden willekeurig te wijzigen en een randomisatiebestand te maken dat een lijst van de originele dossiernamen en overeenkomstige geblindeerde dossiernamen bevat. Open gerandomiseerde bestanden in volgorde, te beginnen met bestand één.
Kies het gereedschap Selecties uit de vrije hand en schets elke lever. Druk op Control-M om het gebied van elke lever te meten. Voor alle levers die niet nauwkeurig kunnen worden gemeten omdat ze een resthuid, dooier hebben, onscherp zijn of niet intact zijn, plaats een tijdelijke aanduidingsmeting.
Sla de metingen op in een tekstbestand. Als u gegevens wilt onblinden en analyseren, opent u het bestand met metingen en randomisatie in een spreadsheetprogramma. Voeg een nieuwe kolom in het metingenbestand in en voeg de oorspronkelijke bestandsnamen voor de geblindeerde bestanden toe met behulp van het bestand Randomization.
Sla dit bestand op als het bestand Niet-geblindeerde metingen. Sorteer de gegevens op de oorspronkelijke bestandsnaam. Sluit levermetingen uit waarvoor foto's niet voldoende waren.
Zet indien nodig meetwaarden om in de gewenste schaal in vierkante millimeters. Open de balk Schalen in de software voor beeldverwerking. Gebruik het gereedschap Rechte lijn om een millimeter op de schaalbalk te meten.
De beeldverwerkingssoftware meet vervolgens in dezelfde eenheden als de levers, wat een conversiefactor geeft. Gebruik de conversiefactor om metingen om te zetten in het bestand Niet-geblindeerde metingen. Bepaal de gemiddelde en standaarddeviatie en bereken P-waarden.
Na zes dagen na de bevruchting vertoonden niet-transgene zebravislarven een natuurlijke positie en vorm van lever die de darm te veel aanvoerde. Transgene zebravissen hebben aanzienlijk toegenomen levergrootte in vergelijking met hun niet-transgene broers en zussen. Enkele voorbeelden van onvoldoende beelden en micrometer worden hier getoond.
Larve met huid die de lever bedekt, larve met dooier die de lever verduistert, larve met delen van de lever afgeknepen, en larve met lever ontwricht en vallend, larve met ontbrekende lever, larve met levercontour die moeilijk te identificeren is, en larve met onjuiste positionering. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om kleine en gecontroleerde bewegingen te gebruiken om schade aan de lever te voorkomen. Naast helder-veld microscopie, kunnen we ook gebruik maken van larven ontleed op deze manier, voor confocale microscopie, om fluorescerende reporter eiwitten of immuno-fluorescerende vlekken te visualiseren, en voor in situ hybridisatie.
De formaldehyde of PFA is een irriterend en verdacht kankerverwekkend. Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van PFA en geconcentreerde oplossingen moeten worden behandeld in een chemische rookkap.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze methode biedt een manier om de levergrootte bij larven van zebravissen te kwantificeren, waardoor de beoordeling van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en -ontwikkeling mogelijk wordt. Het vergemakkelijkt ook de visualisatie en meting van de lever, darm en pancreas.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Kwantificering van de levergrootte is cruciaal voor het begrijpen van orgaanontwikkeling.
- Larven van zebravissen dienen als modelorganisme voor ontwikkelingsstudies.
- Genetische en farmacologische manipulaties kunnen de orgaangroei beïnvloeden.
- Juiste techniek is essentieel voor succesvolle dissectie en visualisatie.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van de levergrootte bij larven van zebravissen.
- Om de impact van genetische en farmacologische interventies op de leverontwikkeling te beoordelen.
- Om organen voor te bereiden op verdere analysetechnieken zoals in situ hybridisatie.
Gebruikte methoden
- Dissectie van larven van zebravissen om de lever, darm en pancreas bloot te leggen.
- Visualisatietechnieken voor het meten van orgaangrootte.
- Oefening op niet-experimentele monsters om techniekbekwaamheid te garanderen.
- Oriëntatie en bewegingscontrole tijdens dissectie om orgaanschade te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt snelle en nauwkeurige meting van de levergrootte mogelijk.
- Vergemakkelijkt de studie van orgaanontwikkeling als reactie op manipulaties.
- Biedt een basis voor verdere beeldvormingsstudies.
- Toont de belangrijkheid van techniek in experimentele resultaten.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het kwantificeren van de levergrootte bij larven van zebravissen.
- Het ondersteunt de beoordeling van genetische en farmacologische effecten op orgaangroei.
- Juiste dissectietechniek is cruciaal voor succesvolle experimentele resultaten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying larval liver size in zebrafish models enables rapid assessment of drug effects on oncogene-related phenotypes, supporting early-stage target validation in hepatocellular carcinoma research. This method provides predictive confidence by linking genetic or pharmacologic interventions to measurable organ growth changes, informing portfolio triage decisions. The approach supports mechanistic de-risking by offering a quantitative, reproducible readout for pathway modulation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring liver area changes in response to oncogene modulation.
- Operational Value: Provides a rapid, precise quantification method suitable for high-throughput screening of genetic or pharmacologic interventions.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through objective, measurable phenotypes that correlate with disease-related hepatomegaly.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Dissection protocol prepares liver, gut, and pancreas for downstream applications like immunofluorescence and in situ hybridization.
- Reproducibility: Standardized fixation, dissection, and imaging steps ensure consistent liver area measurements across experimental groups.
- Scalability: Method allows processing of up to 15 larvae per tube, supporting batch-wise analysis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma where hepatomegaly is an early larval phenotype.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by providing quantifiable organ size data.
- Risk-Adjusted Decisions: Liver size measurements inform go/no-go decisions based on dose-dependent or genotype-dependent growth effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a quantitative bridge between genetic manipulation and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking oncogene expression to measurable liver area changes in larval zebrafish.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (liver area in mm²) that enable reliable comparison across treatment conditions.
- Analytics: Generates measurable data (mean, standard deviation, P-values) suitable for statistical analysis and hit confirmation.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to preclinical continuity through disease-relevant liver hypertrophy readouts.
- Enterprise Reuse: Dissection and imaging workflow is adaptable across multiple organ systems (liver, gut, pancreas) and compatible with multiplexed downstream assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing a direct, quantifiable readout of liver growth in response to pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through blinded image analysis and scale-bar calibration.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early phenotypic assessment, reducing investment in ineffective targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genotypes that significantly alter liver size relative to controls.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, dissection, and brightfield microscopy to avoid tissue damage.
- Depends on instrumentation including dissecting microscopes, glass pipettes, forceps, and image processing software (e.g., R, ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of dissection technique, file blinding, and measurement protocols to minimize investigator bias.
- Adaptation considerations include adjusting dissection timing based on larval age (3–7 dpf) and yolk presence.
- Practical limitation: Liver area measurement may underestimate volume changes; complementary methods needed to distinguish hypertrophy from hyperplasia.
