Name: Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Leer hoe u levergrootte kwantificeert bij larvale zebravissen met helderveldmicroscopie. Deze methode maakt snelle, nauwkeurige meting van leverontwikkeling mogelijk en ondersteunt onderzoek naar genetische en farmacologische effecten op orgaangroei.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen maurine Hobbs en de Gecentraliseerde Zebrafish Animal Resource (CZAR) aan de Universiteit van Utah erkennen voor het verstrekken van zebravishouderij, laboratoriumruimte en apparatuur om delen van dit onderzoek uit te voeren. Uitbreiding van de CZAR wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH grant # 1G20OD018369-01. We willen ook Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum en het Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility bedanken voor de opvang van zebravissen. We willen Kenneth Kompass bedanken voor hulp bij r-programmering. Dit werk werd mede gefinancierd door subsidies van de Huntsman Cancer Foundation (in combinatie met subsidie P30 CA042014 toegekend aan Huntsman Cancer Institute) (KJE) en NIH/NCI R01CA22570 (KJE).

Dierstudies worden uitgevoerd volgens procedures die zijn goedgekeurd door het Institutioneel Comité voor dierenverzorging en -gebruik (IACUC) van de Universiteit van Utah.
1. Vaststelling van larven
<ol><li>Op 3-7 dagen na de bevruchting (dpf), euthanaseren larven met tricaine methaansulfonaat (0,03%) en verzamel tot 15 larven in een buis van 2 mL met behulp van een glazen pipet- en pipetpomp.</li>
	<li>Was larven twee maal met 1 mL koude (4 °C) 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. Verwijder voor elke wasbeurt zoveel mogelijk vloeistof uit de buis met een glazen pipet- en pipetpomp en voeg vervolgens 1 mL koude PBS toe aan de buis.</li>
	<li>Verwijder zoveel PBS mogelijk met behulp van een glazen pipet en pipet pomp, en voeg 1 mL koud (4 °C) 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. LET OP: PFA is een irriterende en vermoedelijke kankerverwekkende stof. Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van PFA, en geconcentreerde oplossingen moeten worden behandeld in een chemische rookkap.</li>
	<li>Incubeer op 4 °C ten minste 's nachts (maar tot enkele maanden) met zacht schommelen.</li>
</ol>2. Ontleden weefsels rond lever
<ol><li>Verwijder larven uit PFA door 3x te spoelen met 1 mL koude (4 °C) PBS en schommel gedurende 5 min tussen spoelingen door. LET OP: Het is goed om de gespoelde larven in PBS een dag of twee bij 4 °C te houden.</li>
	<li>Pipeter verschillende larven in PBS in een put van een 9-goed ronde-bodem glazen schotel.</li>
	<li>Verwijder de huid omringende lever.<ol>
<li>Gebruik fijne tangen om larve op zijn rug te houden (buik omhoog), grijpen aan weerszijden van het hoofd zo voorzichtig mogelijk. Gebruik dan zeer fijne tangen in je andere hand om de huid te grijpen net boven het hart.</li>
		<li>Trek de huid diagonaal naar beneden naar de staart van de vis en de onderkant van de schotel aan de linker- of rechterkant van de vis. Herhaal dit voor de andere kant (rechts of linkerkant).</li>
		<li>Doorgaan grijpen flappen van de huid en trekken naar beneden / terug totdat alle van de huid en melanophores bovenliggendof in de buurt van de lever zijn verwijderd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder dooier, indien aanwezig.<ol>
<li>Voor 5-6 dpf larven, til dooier af in een stuk door het houden van de vis met fijne tangen op zijn rug en met behulp van de zeer fijne tangen om de dooier zachtjes prik.</li>
		<li>Voor 3-4 dpf larven, schraap de dooier af in stukken. Houd de vis met fijne tangen op zijn rug en gebruik de zeer fijne tangen om de dooier aaien, vanaf de ventrale kant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats ontleedlarven in verse koude PBS met behulp van een glazen pipet en pipet pomp.</li>
</ol>3. Beeldvorming
<ol><li>Om larven te monteren, giet een paar mL van 3% methylcellulose op het deksel van een schone plastic petrischaal.</li>
	<li>Gebruik een glazen pipet en pipetpomp om larven toe te voegen aan de methylcellulose, en voeg zo weinig MOGELIJK PBS toe met de larven.</li>
	<li>Onder een ontledende microscoop bij lage vergroting, gebruik fijne tangen om de vissen te oriënteren, zodat ze tot aan hun rechterkant, naar links. LET OP: Zorg ervoor dat de vissen perfect zijn gericht op hun kant of de lever metingen kunnen niet nauwkeurig zijn.</li>
	<li>Maak een foto van elke vis.<ol>
<li>Bevestig dat de te fotograferen vis perfect is uitgelijnd, met het ene oog direct op het andere oog. Gebruik indien nodig fijne tangen om licht op kop of staart van vissen te tikken om de oriëntatie aan te passen. Als de staart van vissen is gebogen, verwijder de staart door het krachtig met kracht te knijpen om het te verwijderen zodat de vissen plat legt.</li>
		<li>Zoom in op hoge vergroting en focus op de lever, ervoor te zorgen dat de lever omtrek is duidelijk zichtbaar.</li>
		<li>Maak een afbeelding vast en sla het bestand op.</li>
		<li>Herhaal voor alle vissen, ervoor te zorgen dat de vergroting is hetzelfde voor elke foto.</li>
		<li>Maak een foto van een micrometer met dezelfde vergroting (zie figuur 2H).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Beeldanalyse
<ol><li>Meet het gebied van de lever van elke vis met behulp van beeldverwerkingssoftware.<ol>
<li>Blind alle lever foto's om potentiële onderzoeker bias te voorkomen en wetenschappelijke strengheid te bevorderen15. Deze stap kan handmatig worden gedaan door een ander lablid of met behulp van een computerprogramma(Aanvullend Materiaal). Wijzig de naam van bestanden willekeurig en maak een "randomisatiebestand" met een lijst met de oorspronkelijke bestandsnamen en bijbehorende geblindeerde bestandsnamen.</li>
		<li>Open gerandomiseerde bestanden in volgorde, te beginnen met bestand 1.</li>
		<li>Kies de vrije hand selecties tool en schets elke lever.</li>
		<li>Druk op Ctrl-M om het gebied van elke lever te meten.</li>
		<li>Voor levers die niet nauwkeurig kunnen worden gemeten, voegt u een tijdelijke aanduidingmeting in (zeer klein of zeer groot, zodat deze later gemakkelijk kan worden uitgesloten).</li>
		<li>Sla de metingen op in een tekstbestand ('meetbestand').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blind en analyseren van gegevens<ol>
<li>Open "meetbestand" en "randomisatiebestand" in een spreadsheetprogramma.</li>
		<li>Voeg een nieuwe kolom in het "meetbestand" in en voeg de oorspronkelijke bestandsnamen voor de geblindeerde bestanden toe met behulp van het "randomisatiebestand". Sla dit bestand op als 'ongeblindeerd meetbestand'.</li>
		<li>Sorteer gegevens op oorspronkelijke bestandsnaam.</li>
		<li>Zorg ervoor dat u levermetingen uitsluit waarvoor foto's ontoereikend waren (zie figuur 2A–G).</li>
		<li>Zet indien nodig meetwaarden om in gewenste schaal (mm2, bijvoorbeeld).<ol>
<li>Open de schaalbalk in de beeldverwerkingssoftware.</li>
			<li>Gebruik het rechte lijngereedschap om 1 mm te meten op de schaalbalk. De beeldverwerkingssoftware meet in dezelfde eenheden als de levers (pixels), waardoor een conversiefactor wordt gegeven.</li>
			<li>Gebruik de conversiefactor om metingen om te zetten in het "ongeblindeerde meetbestand".</li>
		</ol>
</li>
		<li>Met behulp van het spreadsheetprogramma of het plakken van gegevens in een wetenschappelijke grafiek- en statistieksoftware, bepaal je gemiddelde en standaarddeviatie en bereken je p-waarde(s).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Kwantificering van levergrootte is cruciaal in studies gericht op het begrijpen van leverontwikkeling, regeneratie en oncogenese. Het hier beschreven protocol is een relatief snelle, gemakkelijke en goedkope techniek voor levergroottekwantificering bij larve zebravissen. Het uitoefenen van de nodige voorzichtigheid tijdens het uitvoeren van bepaalde aspecten van het protocol kan helpen bij een grotere nauwkeurigheid van de resultaten en verminderde frustratie.
Een goede fixatie van de larven i...

Hepatocellulair carcinoma (HCC) is de meest voorkomende primaire maligniteit van de lever1 en de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfte2. Om mechanismen van hepatocarcinogenese beter te begrijpen en potentiële HCC-therapieën te identificeren, hebben wij en anderen transgene zebravis ontwikkeld waarin hepatocyte-specifieke expressie van oncogenes zoals β-catenine3,4, Kras(V12)5,6, Myc7of Yap18 leidt tot HCC bij volwassen dieren. Bij deze zebravis wordt leververgroting al op 6 dagen na de bevruchting (dpf) opgemerkt, waardoor een facile-platform wordt geboden voor het testen van de effecten van geneesmiddelen en genetische veranderingen op oncogene aangedreven leverbegroeiing. Nauwkeurige en nauwkeurige meting van de grootte van de larvelever is essentieel voor het bepalen van de effecten van deze manipulaties.
Levergrootte en -vorm kunnen semi-kwantitatief worden beoordeeld in vaste zebravislarven door CY3-SAlabeling 9 of in levende zebravislarven met behulp van hepatocyte-specifieke fluorescerende verslaggevers en fluorescentie ontledenmicroscopie5,6. Deze laatste methode is relatief snel en het gebrek aan precisie kan worden aangepakt door het gebied van elke lever te fotograferen en te meten met behulp van beeldverwerkingssoftware7,10. Het kan echter technisch uitdagend zijn om alle levende larven uniform te positioneren in een experiment zodanig dat tweedimensionaal levergebied een nauwkeurige weergave is van levergrootte. Een soortgelijke techniek voor het kwantificeren van de levergrootte omvat het gebruik van lichtplaatfluorescentiemicroscopie om larve levervolume8te kwantificeren, die nauwkeuriger kan zijn voor het detecteren van grootteverschillen wanneer de lever niet-uniform in verschillende dimensies wordt uitgebreid. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) kan worden gebruikt om het aantal fluorescerende gelabelde hepatocyten en andere leverceltypes in larvelevers8,11te tellen. Bij deze methode worden larvelevers samengevoegd en gescheiden, zodat informatie over individuele levergrootte en -vorm verloren gaat. In combinatie met een andere levergroottebepalingsmethode maakt FACS differentiatie mogelijk tussen verhoogd celgetal (hyperplasie) en verhoogde celgrootte (hypertrofie). Al deze methoden maken gebruik van dure fluorescentietechnologie (microscoop of celsorteerder) en, met uitzondering van CY3-SA-etikettering, vereisen etikettering van hepatocyten met een fluorescerende verslaggever.
Hier beschrijven we in detail een methode voor het kwantificeren van zebravissen larve lever gebied met behulp van bright-field microscopie en beeldverwerking software3,12,13,14. Dit protocol maakt nauwkeurige kwantificering van het gebied van individuele levers ter plaatse mogelijk zonder het gebruik van fluorescentiemicroscopie. Tijdens het analyseren van levergrootte, verblinden we de beeldidentiteit om de vooringenomenheid van onderzoekers te verminderen en wetenschappelijke strengheid te verbeteren15.

<table><tbody><tr><td>Camera voor dissectiemicroscoop</td><td>Leica, bijvoorbeeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Leica, bijvoorbeeld</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fijne (Dumont #5) pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pipetten</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Beeldanalysesoftware</td><td>Image J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ/FIJI kan gratis worden gedownload: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd zoutoplossing</td><td>Verschillende leveranciers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetpompen</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof petrischalen</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9-well glasbakje met ronde bodem</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>Software voor het verblinden van bestanden</td><td>R project</td><td></td><td>R kan gratis worden gedownload: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td></tr><tr><td>Wetenschappelijke grafiek- en statistieksoftware</td><td>GraphPad Prism</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spreadsheetprogramma</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tricaine methaansulfonaat (Tricaine-S)</td><td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>Zeer fijne (Dumont #55) pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van brightfield microscopie

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In verschillende transgene zebravismodellen van hepatocellulair carcinoma (HCC) kunnen hepatomegaly worden waargenomen tijdens vroege larvestadia. Het kwantificeren van de larve levergrootte bij zebravis HCC-modellen biedt een middel om snel de effecten van geneesmiddelen en andere manipulaties op een oncogene-gerelateerd fenotype te beoordelen. Hier laten we zien hoe ze zebravislarven kunnen fixeren, de weefsels rond de lever ontleden, levers fotograferen met behulp van heldere microscopie, levergebied meten en resultaten analyseren. Dit protocol maakt een snelle, nauwkeurige kwantificering van de levergrootte mogelijk. Aangezien deze methode het meten van levergebied omvat, kan het verschillen in levervolume onderschatten, en de aanvullende methodologieën zijn vereist om tussen veranderingen in celgrootte en veranderingen in celaantal te onderscheiden. De dissectie techniek hierbeschreven is een uitstekend hulpmiddel om de lever, darm en alvleesklier te visualiseren in hun natuurlijke posities voor talloze downstream toepassingen, waaronder immunofluorescentie kleuring en in situ hybridisatie. De beschreven strategie voor het kwantificeren van de grootte van de larvelever is van toepassing op vele aspecten van leverontwikkeling en regeneratie.

Transgene zebravissen die hepatocyte-specifieke geactiveerde β-catenine uitdrukken (Tg (fabp10a:pt-β-cat) zebravis)3 en niet-transgene controle broers en zussen werden geëuthanaseerd op 6 dpf en lever gebied werd gekwantificeerd met behulp van brightfield microscopie en beeldverwerking software. Transgene zebravissen hebben de levergrootte aanzienlijk vergroot (0,0006 cm2)in vergelijking met hun niet-transgene broers en zussen (0,0004 cm2, p < 0,000...

Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Deze methode biedt een manier om levergrootte in larve zebravissen te kwantificeren. Het maakt het ook mogelijk voor de beoordeling van de effecten van genetische en farmacologische manipulatie op de groei van de lever en ontwikkeling. Deze techniek biedt een snelle en nauwkeurige manier om de lever en de darm en alvleesklier te visualiseren en te meten.Naast het kwantificeren van levergrootte, deze dissectie methode kan nuttig zijn voor de voorbereiding van de lever, darm, en alvleesklier voor in situ hybridisatie of confocale beeldvorming. Voordat u probeert te deskinning op experimentele larven, zorg ervoor dat u hebt besteed voldoende tijd oefenen op niet-experimentele monsters en hebben een aanzienlijk slagingspercentage. Het is van cruciaal belang om de juiste oriëntatie en beweging van zebravissen larven en tangen te visualiseren om de huid te verwijderen zonder de omliggende organen te storen.Gebruik na drie tot zeven dagen na de bevruchting, na euthanaseren van larven, een glazen pipet- en pipetpomp om tot 15 larven in een twee milliliterbuis te verzamelen. Was larven twee keer met een milliliter koude 1X PBS op ijs. Verwijder zoveel mogelijk PBS met behulp van een glazen pipet en pipet pomp en voeg een milliliter koude vier procent PFA in PBS.Incubeer op vier graden Celsius ten minste 's nachts met zachte schommelen. Verwijder met behulp van een glazen pipet- en pipetpomp de PFA uit de buis en spoel drie keer af met één milliliter koude PBS. Rock gedurende vijf minuten tussen spoelt.Pipette verschillende larven in PBS in een put van negen-goed ronde bodem glazen schotel. Onder een microscoop, verwijder de huid rond de lever met behulp van fijne tangen om een larve op zijn rug te houden, aan beide zijden van het hoofd zo voorzichtig mogelijk vast te grijpen. Gebruik dan zeer fijne tangen in de andere hand om de huid te grijpen net boven het hart.Trek de huid diagonaal naar beneden naar de staart van de vis in de bodem van de schotel aan de linker- of rechterkant van de vis. Herhaal dit voor de andere kant. Blijf flappen van de huid grijpen en naar beneden trekken totdat alle huid en melanoforen boven of in de buurt van de lever zijn verwijderd.Als dooier aanwezig is voor vijf tot zes dagen na de bevruchting larven, til de dooier af in een stuk door het houden van de vis met fijne tangen op zijn rug en met behulp van de zeer fijne tangen om zachtjes prik de dooier. Voor drie tot vier DPF larven, houd de vis met fijne tangen op zijn rug en gebruik de zeer fijne tangen om de dooier te aaien vanaf de ventrale kant. Schraap de dooier in stukken.Plaats de ontleed larven in verse, koude PBS in een twee milliliter buis met behulp van een glazen pipet en pipetpomp. Om de larven te monteren, giet een paar milliliter van drie procent methylcellulose op het deksel van schone, plastic petrischaal. Gebruik een glazen pipet- en pipetpomp om larven toe te voegen aan de methylcellulose, waarbij zo weinig PBS met de larven wordt toegevoegd.Gebruik onder een ontledende microscoop bij lage vergroting fijne tangen om de vis te oriënteren, zodat ze aan hun rechterkant naar links liggen. Bevestig dat de te fotograferen vis perfect is uitgelijnd met het ene oog direct op het andere oog. Als de staart van de vis is gebogen, verwijder de staart door het krachtig te knijpen met tangen om het te verwijderen, zodat de vis plat ligt.Zoom in op hoge vergroting en focus op de lever, om ervoor te zorgen dat de omtrek van de lever duidelijk zichtbaar is. Druk op de knop Afbeelding vastleggen om een afbeelding vast te maken en het bestand op te slaan. Herhaal dit voor alle vissen, ervoor te zorgen dat de vergroting is hetzelfde voor elke foto.Maak een foto van een micrometer met dezelfde vergroting. Om het programma R te gebruiken om alle leverfoto's te verblinden om potentiële onderzoekerbias te vermijden en wetenschappelijke strengheid te bevorderen, anders bestanden willekeurig te wijzigen en een randomisatiebestand te maken dat een lijst van de originele dossiernamen en overeenkomstige geblindeerde dossiernamen bevat. Open gerandomiseerde bestanden in volgorde, te beginnen met bestand één.Kies het gereedschap Selecties uit de vrije hand en schets elke lever. Druk op Control-M om het gebied van elke lever te meten. Voor alle levers die niet nauwkeurig kunnen worden gemeten omdat ze een resthuid, dooier hebben, onscherp zijn of niet intact zijn, plaats een tijdelijke aanduidingsmeting.Sla de metingen op in een tekstbestand. Als u gegevens wilt onblinden en analyseren, opent u het bestand met metingen en randomisatie in een spreadsheetprogramma. Voeg een nieuwe kolom in het metingenbestand in en voeg de oorspronkelijke bestandsnamen voor de geblindeerde bestanden toe met behulp van het bestand Randomization.Sla dit bestand op als het bestand Niet-geblindeerde metingen. Sorteer de gegevens op de oorspronkelijke bestandsnaam. Sluit levermetingen uit waarvoor foto's niet voldoende waren.Zet indien nodig meetwaarden om in de gewenste schaal in vierkante millimeters. Open de balk Schalen in de software voor beeldverwerking. Gebruik het gereedschap Rechte lijn om een millimeter op de schaalbalk te meten.De beeldverwerkingssoftware meet vervolgens in dezelfde eenheden als de levers, wat een conversiefactor geeft. Gebruik de conversiefactor om metingen om te zetten in het bestand Niet-geblindeerde metingen. Bepaal de gemiddelde en standaarddeviatie en bereken P-waarden.Na zes dagen na de bevruchting vertoonden niet-transgene zebravislarven een natuurlijke positie en vorm van lever die de darm te veel aanvoerde. Transgene zebravissen hebben aanzienlijk toegenomen levergrootte in vergelijking met hun niet-transgene broers en zussen. Enkele voorbeelden van onvoldoende beelden en micrometer worden hier getoond.Larve met huid die de lever bedekt, larve met dooier die de lever verduistert, larve met delen van de lever afgeknepen, en larve met lever ontwricht en vallend, larve met ontbrekende lever, larve met levercontour die moeilijk te identificeren is, en larve met onjuiste positionering. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om kleine en gecontroleerde bewegingen te gebruiken om schade aan de lever te voorkomen. Naast helder-veld microscopie, kunnen we ook gebruik maken van larven ontleed op deze manier, voor confocale microscopie, om fluorescerende reporter eiwitten of immuno-fluorescerende vlekken te visualiseren, en voor in situ hybridisatie.De formaldehyde of PFA is een irriterend en verdacht kankerverwekkend. Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van PFA en geconcentreerde oplossingen moeten worden behandeld in een chemische rookkap.

quantifying-liver-size-larval-zebrafish-using-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

We presenteren een protocol voor het vastleggen van de dynamica van regeneratie van de staartvin van zebravislarven op een volledige weefselschaal met behulp van stereomicroscopie op basis van helder veld. Deze techniek maakt het mogelijk om de regeneratiedynamica met een enkele celresolutie vast te leggen. Deze methodologie kan worden aangepast aan elke stereomicroscoop uitgerust met een CCD-camera en time-lapse software.

Vastleggen van Tissue Repair in zebravis Larven met Time-lapse Helderveld stereomicroscopie

Lichtbladfluorescentiemicroscopie is een uitstekend hulpmiddel voor het beeldvormen van embryonale ontwikkeling. Het maakt het mogelijk om lange time-lapse films van levende embryo's op te nemen in bijna fysiologische omstandigheden. We demonstreren de toepassing ervan voor het beeldvormen van de oogontwikkeling van zebravissen over brede ruimtelijk-temporele schalen en presenteren een pijplijn voor het samenvoegen en deconvolutie van multiview datasets.

Met behulp van Light Sheet fluorescentiemicroscopie met Afbeelding zebravis Eye Development

Zebravissen ontwikkelen zich tot een waardevol model voor de verwerking van voedingslipiden en metabole ziekten. Beschreven worden protocollen van lipide-rijke larvale voeders, live beeldvorming van voedingsfluorescente lipide-analoga en kwantificering van voedselinname. Deze technieken kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan screenings-, beeldvormings- en hypothesegestuurde onderzoekstechnieken.

Vetrijke Feeding Paradigm voor larvale zebravis: Voeden, Live Imaging, en kwantificering van voedselinname

Hier beschrijven we een methode om de grootte van zebravis embryo's te verkleinen zonder de normale ontwikkelingsprocessen te verstoren. Deze techniek maakt de studie van het patroon schalen en ontwikkelingsstoornissen robuustheid tegen grootte te veranderen.

Chirurgische grootte vermindering van zebravis voor de studie van het embryonale patroon schrapen

Dit protocol beschrijft de procedure voor het verwijderen van de ventrale kwab van de lever bij volwassen zebravissen om de studie van leverregeneratie mogelijk te maken.

Gedeeltelijke hepatectomie bij volwassen zebravissen

Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.

Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse

Hier presenteren we hoe we een niet-alcoholische leververvetting (NAFLD) -geassocieerd Hepatocellulair Carcinoom (HCC) zebravismodel kunnen genereren om de impact van cholesteroloverschot op de micro-omgeving van de lever en het immuuncellandschap te bestuderen.

Analyse van levermicro-omgeving tijdens vroege progressie van niet-alcoholische leververvetting-geassocieerd hepatocellulair carcinoom bij zebravissen

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

Dit protocol maakt gebruik van light-sheet beeldvorming om de contractiele functie van het hart bij zebravislarven te onderzoeken en inzicht te krijgen in de hartmechanica door middel van celtracking en interactieve analyse.

4D Light-sheet beeldvorming van hartcontractie van zebravissen

Leer hoe u levergrootte kwantificeert bij larvale zebravissen met helderveldmicroscopie. Deze methode maakt snelle, nauwkeurige meting van leverontwikkeling mogelijk en ondersteunt onderzoek naar genetische en farmacologische effecten op orgaangroei.

Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie

Meer video's verkennen