Kwantificerende levergrootte bij larvale zebravissen met behulp van Brightfield Microscopie
2 februari 2020
Hier demonstreren we een methode voor het kwantificeren van levergrootte bij larve zebravissen, die een manier bieden om de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op levergroei en ontwikkeling te beoordelen.
Deze methode biedt een manier om levergrootte in larve zebravissen te kwantificeren. Het maakt het ook mogelijk voor de beoordeling van de effecten van genetische en farmacologische manipulatie op de groei van de lever en ontwikkeling. Deze techniek biedt een snelle en nauwkeurige manier om de lever en de darm en alvleesklier te visualiseren en te meten.
Naast het kwantificeren van levergrootte, deze dissectie methode kan nuttig zijn voor de voorbereiding van de lever, darm, en alvleesklier voor in situ hybridisatie of confocale beeldvorming. Voordat u probeert te deskinning op experimentele larven, zorg ervoor dat u hebt besteed voldoende tijd oefenen op niet-experimentele monsters en hebben een aanzienlijk slagingspercentage. Het is van cruciaal belang om de juiste oriëntatie en beweging van zebravissen larven en tangen te visualiseren om de huid te verwijderen zonder de omliggende organen te storen.
Gebruik na drie tot zeven dagen na de bevruchting, na euthanaseren van larven, een glazen pipet- en pipetpomp om tot 15 larven in een twee milliliterbuis te verzamelen. Was larven twee keer met een milliliter koude 1X PBS op ijs. Verwijder zoveel mogelijk PBS met behulp van een glazen pipet en pipet pomp en voeg een milliliter koude vier procent PFA in PBS.
Incubeer op vier graden Celsius ten minste 's nachts met zachte schommelen. Verwijder met behulp van een glazen pipet- en pipetpomp de PFA uit de buis en spoel drie keer af met één milliliter koude PBS. Rock gedurende vijf minuten tussen spoelt.
Pipette verschillende larven in PBS in een put van negen-goed ronde bodem glazen schotel. Onder een microscoop, verwijder de huid rond de lever met behulp van fijne tangen om een larve op zijn rug te houden, aan beide zijden van het hoofd zo voorzichtig mogelijk vast te grijpen. Gebruik dan zeer fijne tangen in de andere hand om de huid te grijpen net boven het hart.
Trek de huid diagonaal naar beneden naar de staart van de vis in de bodem van de schotel aan de linker- of rechterkant van de vis. Herhaal dit voor de andere kant. Blijf flappen van de huid grijpen en naar beneden trekken totdat alle huid en melanoforen boven of in de buurt van de lever zijn verwijderd.
Als dooier aanwezig is voor vijf tot zes dagen na de bevruchting larven, til de dooier af in een stuk door het houden van de vis met fijne tangen op zijn rug en met behulp van de zeer fijne tangen om zachtjes prik de dooier. Voor drie tot vier DPF larven, houd de vis met fijne tangen op zijn rug en gebruik de zeer fijne tangen om de dooier te aaien vanaf de ventrale kant. Schraap de dooier in stukken.
Plaats de ontleed larven in verse, koude PBS in een twee milliliter buis met behulp van een glazen pipet en pipetpomp. Om de larven te monteren, giet een paar milliliter van drie procent methylcellulose op het deksel van schone, plastic petrischaal. Gebruik een glazen pipet- en pipetpomp om larven toe te voegen aan de methylcellulose, waarbij zo weinig PBS met de larven wordt toegevoegd.
Gebruik onder een ontledende microscoop bij lage vergroting fijne tangen om de vis te oriënteren, zodat ze aan hun rechterkant naar links liggen. Bevestig dat de te fotograferen vis perfect is uitgelijnd met het ene oog direct op het andere oog. Als de staart van de vis is gebogen, verwijder de staart door het krachtig te knijpen met tangen om het te verwijderen, zodat de vis plat ligt.
Zoom in op hoge vergroting en focus op de lever, om ervoor te zorgen dat de omtrek van de lever duidelijk zichtbaar is. Druk op de knop Afbeelding vastleggen om een afbeelding vast te maken en het bestand op te slaan. Herhaal dit voor alle vissen, ervoor te zorgen dat de vergroting is hetzelfde voor elke foto.
Maak een foto van een micrometer met dezelfde vergroting. Om het programma R te gebruiken om alle leverfoto's te verblinden om potentiële onderzoekerbias te vermijden en wetenschappelijke strengheid te bevorderen, anders bestanden willekeurig te wijzigen en een randomisatiebestand te maken dat een lijst van de originele dossiernamen en overeenkomstige geblindeerde dossiernamen bevat. Open gerandomiseerde bestanden in volgorde, te beginnen met bestand één.
Kies het gereedschap Selecties uit de vrije hand en schets elke lever. Druk op Control-M om het gebied van elke lever te meten. Voor alle levers die niet nauwkeurig kunnen worden gemeten omdat ze een resthuid, dooier hebben, onscherp zijn of niet intact zijn, plaats een tijdelijke aanduidingsmeting.
Sla de metingen op in een tekstbestand. Als u gegevens wilt onblinden en analyseren, opent u het bestand met metingen en randomisatie in een spreadsheetprogramma. Voeg een nieuwe kolom in het metingenbestand in en voeg de oorspronkelijke bestandsnamen voor de geblindeerde bestanden toe met behulp van het bestand Randomization.
Sla dit bestand op als het bestand Niet-geblindeerde metingen. Sorteer de gegevens op de oorspronkelijke bestandsnaam. Sluit levermetingen uit waarvoor foto's niet voldoende waren.
Zet indien nodig meetwaarden om in de gewenste schaal in vierkante millimeters. Open de balk Schalen in de software voor beeldverwerking. Gebruik het gereedschap Rechte lijn om een millimeter op de schaalbalk te meten.
De beeldverwerkingssoftware meet vervolgens in dezelfde eenheden als de levers, wat een conversiefactor geeft. Gebruik de conversiefactor om metingen om te zetten in het bestand Niet-geblindeerde metingen. Bepaal de gemiddelde en standaarddeviatie en bereken P-waarden.
Na zes dagen na de bevruchting vertoonden niet-transgene zebravislarven een natuurlijke positie en vorm van lever die de darm te veel aanvoerde. Transgene zebravissen hebben aanzienlijk toegenomen levergrootte in vergelijking met hun niet-transgene broers en zussen. Enkele voorbeelden van onvoldoende beelden en micrometer worden hier getoond.
Larve met huid die de lever bedekt, larve met dooier die de lever verduistert, larve met delen van de lever afgeknepen, en larve met lever ontwricht en vallend, larve met ontbrekende lever, larve met levercontour die moeilijk te identificeren is, en larve met onjuiste positionering. Bij het proberen van deze procedure is het belangrijk om kleine en gecontroleerde bewegingen te gebruiken om schade aan de lever te voorkomen. Naast helder-veld microscopie, kunnen we ook gebruik maken van larven ontleed op deze manier, voor confocale microscopie, om fluorescerende reporter eiwitten of immuno-fluorescerende vlekken te visualiseren, en voor in situ hybridisatie.
De formaldehyde of PFA is een irriterend en verdacht kankerverwekkend. Handschoenen moeten worden gedragen bij het hanteren van PFA en geconcentreerde oplossingen moeten worden behandeld in een chemische rookkap.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode biedt een manier om de levergrootte bij zebravislarven te kwantificeren, waardoor de effecten van genetische en farmacologische manipulaties op de groei en ontwikkeling van de lever kunnen worden beoordeeld. Daarnaast vergemakkelijkt het de visualisatie en meting van de lever, darm en pancreas.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Ontwikkelingsbiologie
- Genetica
Achtergrond
- Kwantificering van de levergrootte is cruciaal voor het begrijpen van de ontwikkeling van organen.
- Zebravislarven dienen als modelorganisme voor ontwikkelingsstudies.
- Genetische en farmacologische manipulaties kunnen de orgaangroei beïnvloeden.
- Een correcte techniek is essentieel voor een succesvolle dissectie en visualisatie.
Doel van de studie
- Om een methode te ontwikkelen voor het kwantificeren van de levergrootte bij zebrafish-larven.
- Om de impact van genetische en farmacologische interventies op de leverontwikkeling te beoordelen.
- Om organen voor te bereiden voor verdere analysetechnieken, zoals in situ hybridisatie.
Gebruikte methoden
- Dissectie van zebravislarven om de lever, darm en pancreas bloot te leggen.
- Visualisatietechnieken voor het meten van de organgrootte.
- Oefenen op niet-experimentele monsters om de vaardigheid van de techniek te waarborgen.
- Oriëntatie en bewegingscontrole tijdens de dissectie om beschadiging van organen te voorkomen.
Belangrijkste resultaten
- De methode maakt een snelle en nauwkeurige meting van de levergrootte mogelijk.
- Faciliteert de studie naar orgaanontwikkeling als reactie op manipulaties.
- Biedt een basis voor verdere beeldvormende studies.
- Demonstreert het belang van de techniek voor de experimentele resultaten.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het kwantificeren van de levergrootte bij zebravislarven.
- Het ondersteunt de beoordeling van genetische en farmacologische effecten op de organogroei.
- Een correcte dissectietechniek is essentieel voor succesvolle experimentele resultaten.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het kwantificeren van de levergrootte van larven in zebravismodellen maakt een snelle beoordeling van drugseffecten op oncogeen-gerelateerde fenotypes mogelijk, wat vroege validatie van targets in onderzoek naar hepatocellulair carcinoom ondersteunt. Deze methode biedt voorspellende zekerheid door genetische of farmacologische interventies te koppelen aan meetbare veranderingen in de organogroei, wat helpt bij beslissingen over portfoliotriage. De aanpak ondersteunt mechanistische risicoreductie door een kwantitatieve, reproduceerbare uitlezing te bieden voor padmodulatie in preklinische ziektemodellen.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door veranderingen in het leveroppervlak te meten als reactie op oncogenmodulatie.
- Operationele waarde: Biedt een snelle, precieze kwantificeringsmethode die geschikt is voor high-throughput screening van genetische of farmacologische interventies.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt biologische risicoreductie via objectieve, meetbare fenotypes die correleren met ziektegerelateerde hepatomegalie.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Het dissectieprotocol bereidt de lever, darm en pancreas voor op downstream-applicaties zoals immunofluorescentie en in situ hybridisatie.
- Reproduceerbaarheid: Gestandaardiseerde fixatie-, dissectie- en beeldvormingsstappen zorgen voor consistente metingen van het leveroppervlak in verschillende experimentele groepen.
- Schaalbaarheid: De methode maakt de verwerking van maximaal 15 larven per buis mogelijk, wat batchgewijze analyse voor de evaluatie van verbindingen ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziekten: Toepasbaar op transgene zebravismodellen van hepatocellulair carcinoom waarbij hepatomegalie een vroeg larvaal fenotype is.
- Translationele continuïteit: Maakt een naadloze overgang van ontdekking naar preklinische validatie mogelijk door het leveren van kwantificeerbare gegevens over de orgaangrootte.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Metingen van de levergrootte vormen de basis voor go/no-go-beslissingen op basis van dosisafhankelijke of genotypeafhankelijke groeieffecten.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische evaluatie, en biedt een kwantitatieve brug tussen genetische manipulatie en fenotypische uitkomst.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten door de expressie van oncogenen te koppelen aan meetbare veranderingen in het leveroppervlak van zebravislarven.
- Screening: Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve resultaten (leveroppervlak in mm²) die een betrouwbare vergelijking tussen verschillende behandelingscondities mogelijk maken.
- Analytica: Genereert meetbare gegevens (gemiddelde, standaarddeviatie, P-waarden) die geschikt zijn voor statistische analyse en hitbevestiging.
- Translationeel onderzoek: Verbindt vroege fenotypische screening met preklinische continuïteit via ziekterelevante read-outs van leverhypertrofie.
- Hergebruik binnen de organisatie: De workflow voor dissectie en beeldvorming is aanpasbaar voor meerdere orgaansystemen (lever, darm, pancreas) en compatibel met gemultiplexte downstream-assays.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door een directe, kwantificeerbare uitlezing te bieden van levergroei als reactie op modulatie van signaalpaden.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via geblindeerde beeldanalyse en kalibratie van de schaalbalk.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door vroegtijdige fenotypische beoordeling mogelijk te maken, waardoor investeringen in ineffectieve targets worden verminderd.
- Impact op portfolio: Faciliteert risico-gecorrigeerde prioritering door verbindingen of genotypen te identificeren die de levergrootte significant veranderen ten opzichte van de controles.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de hantering, dissectie en brightfield-microscopie van zebravis om weefselbeschadiging te voorkomen.
- Is afhankelijk van instrumentatie, waaronder dissectiemicroscopen, glazen pipetten, pincetten en software voor beeldverwerking (bijv. R, ImageJ).
- Vereist standaardisatie tussen teams van de dissectietechniek, blindering van bestanden en meetprotocollen om onderzoekersbias te minimaliseren.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het aanpassen van het tijdstip van dissectie op basis van de leeftijd van de larve (3–7 dpf) en de aanwezigheid van de dooierzak.
- Praktische beperking: De meting van het leveroppervlak kan volumewijzigingen onderschatten; aanvullende methoden zijn nodig om hypertrofie te onderscheiden van hyperplasie.
