Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie
16 maart 2020
Dit rapport beschrijft de screening van verschillende detergenten voor de voorbereiding van de visuele GPCR, rododenine, en het complex met mini-Go. Biochemische methoden die de kwaliteit van het complex in verschillende stadia tijdens de zuivering karakteriseren, worden gedemonstreerd. Dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar andere membraan eiwitcomplexen voor hun toekomstige structurele studies.
Signaaltransductie is een van de belangrijkste onderwerpen in biologisch en farmaceutisch onderzoek. Het vereist membraaneiwitten om signalen naar hun intracellulaire signaleringspartnereiwit over te brengen. Dit protocol is ontworpen om een systematische wasmiddelscreening uit te voeren ter voorbereiding van een signaleringscomplex gericht op structuurbepaling.
Dit protocol maakt gebruik van algemeen beschikbare technieken in een gevestigde biologie laboratorium en gemakkelijk worden uitgevoerd door de beginners in het veld. We omvatten deze methoden om de meest kritische parameter te vinden in de voorbereiding van membraan eiwit complex. Om te beginnen ontdooit u 30 gram HEK293 GNT I-deficiënte celpellet tot kamertemperatuur en breng deze over op een beker.
Voeg 120 milliliter PBS-buffer toe met proteaseremmercocktail en homogeen met behulp van een Dounce-homogenisator of een elektrische homogenisator bij 13.000 RPM gedurende 30 seconden. Pas het volume aan op 150 milliliter met PBS-buffer. Voeg voorzichtig 10%DDM toe aan de gehomogeniseerde cellen om een laatste concentratie van 1,25% een uur lang op ijs te roeren.
Na oplossing, centrifugeren de cel lysaat op vier graden Celsius en 150,000 keer G gedurende 45 minuten om de onoplosbare puin te verwijderen. Breng de supernatant over op een fles van 500 milliliter en voeg 10 milliliter van de 50%1D4 immuno-affinity agarose hars toe. Meng het oplosbaar cellysaat en hars vier uur of 's nachts bij vier graden Celsius voorzichtig om eiwitbinding mogelijk te maken.
Laad het lysaat harsmengsel in een open kolom om de hars te verzamelen. Was de hars met 10 kolomvolumes wasbuffer A om de eiwitverontreiniging te verwijderen. Sluit de klep en resuspend de hars met twee kolomvolumes van buffer A.Next, onder schemerarm rood licht, voeg 9-cis Retinal aan de geresuspendeerde hars aan een definitieve concentratie van 50 micromolar.
Meng zachtjes op vier graden Celsius gedurende vier tot 16 uur in het donker voor Retinale binding. Open daarna de waarde en verwijder de buffer uit de kolom. Was hars met 20 kolomvolumes van buffer A, gevolgd door 15 kolomvolumes van buffer B om niet-gebonden Retinal te verwijderen.
Resuspend de hars in twee kolomvolumes van buffer B en verdeel de harssusopening evengoed tot 10 10 milliliter verwijderingskolommen. Verwijder de buffer uit de 10 kolommen en vervolgens resuspend de hars elk in een milliliter buffer C voor detergent change. Een uur lang incuberen op ijs.
Herhaal de was en de incubatie in buffer C nog een keer. Verwijder de buffer uit de kolommen en zet de hars opnieuw op in 0,8 milliliter elutiebuffer voor elke kolom. Meng zachtjes gedurende twee uur.
Verzamel de elutie van elke kolom in een buis. Resuspend de hars in 0,7 milliliter elutie buffer voor elke kolom. Meng voorzichtig gedurende een uur.
Verzamel de elutie van elke kolom in dezelfde buizen. Laad in het donker het ontweken eiwit op de kwartsvvette. Meet het spectrum van het eiwitmonster.
Verlicht het eiwit direct in de cuvette gedurende twee minuten met licht passeren van 495 nanometer long pass filter. Meet het spectrum van het verlichte monster. Voer dezelfde meting uit voor alle eiwitmonsters gezuiverd in de andere negen detergenten.
Zowel donkere als verlichte toestanden. Bij normaal licht, voor elke wasmiddel voorwaarde bereiden 100 microliter rhodopsine op 0,7 milligram per milliliter. Onder zwak rood licht, bereiden 100 microliter mengsel van rhodopsine op 0,7 milligram per milliliter en mini-GO op 0,2 milligram per milliliter.
Vul het mengsel aan met één millimolar magnesiumchloride. Verlicht het mengsel met licht van een 495 nanometer long pass filter en incubeer gedurende 30 minuten. Breng de monsters over op de flacons van de automonsternemers en plaats ze in de monsterlade.
Programmeer een methodebestand om sequentiële SEC-runs voor elk monster te automatiseren, waarbij de automatische sampler 77 microliter van het monster laadt naar de kolom en de reiniger 25 milliliter SEC-buffer per run ontwijkt. Noteer de absorptie op 280 nanometer en 380 nanometer. Verzamel de piekfracties van rhodopsine en rhodopsin-mini-GO complex bij het retentievolume rond 12,9 milliliter.
Analyseer de linker rhodopsine monsters en de piekfracties van rhodopsin-mini-GO complex op vier tot 12% SDS denatureren gradiënt gels met Coomassie blauwe vlekken. Bereid een 200 microliter mengsel van rhodopsine op een milligram per milliliter en PNGase F op 0,01 milligram per milliliter. Meng goed en broeden op ijs 's nachts.
Bereid een 200 microliter mengsel van rhodopsine op een milligram per milliliter en Endo F1-13 op 0,01 milligram per milliliter. Meng goed en broeden op ijs 's nachts. Analyseer het spijsverteringsresultaat door SDS-Page en Coomassie blauwe vlekken.
In deze studie leverde kleinschalige zuiveringsopstelling voldoende eiwitten op voor verdere analyses. Ultraviolet zichtbare spectra van rhodopsine tonen de donkere toestand 9-cis Retinale gebonden rhodopsine in blauwe rondingen. Na verlichting wordt 9-cis Retinal gedeproteineerd en wordt het in alle trans-Retinale gedeproereerd.
De verhoudingen van absorptiemiddelen op 280 nanometer over absorptiets 488 nanometer en absorptiemiddelen op 280 nanometer over absorptiemiddelen op 380 nanometer tonen de stabiliteit van rhodopsine gezuiverd in elk wasmiddel. Grootte uitsluiting chromatografie profielen van rhodopsine en rhodopsin-mini-GO complex gezuiverd in 10 verschillende detergenten worden hier weergegeven. Het profiel van de standaard marker eiwitten wordt samen met het DDM monster als overlay weergegeven.
De interpretatie van de piekprofielen wordt getoond voor DMNG met het ideale scenario voor DDM, DM, Cymal-6, Cymal-5 en OGNG. Het vergroot profiel van het OGNG-monster toont zowel rhodopsine als rhodopsine-mini-GO-complex ontgaan rond hetzelfde retentievolume. De SDS-Page analyse van rhodopsine en SEC gezuiverde monsters van rhodopsin-mini-GO complex wordt hier getoond.
Deze figuur toont de SDS-Page analyse van rhodopsine deglycosylation met Endo F1 en PNGase F enzymen. Het is van cruciaal belang om wasmiddelscreening op een systematische manier uit te voeren, zodat de impact van elk individueel wasmiddel duidelijk kan worden vergeleken zonder dubbelzinnigheid. Voor eiwitten van verschillende hoeveelheden kan thermische verschuivingstest ook worden gebruikt om de impact van wasmiddel op de eiwitstabiliteit te bestuderen.
Dankzij deze methode zijn we in staat om stabiel eiwitcomplex te bereiden en uiteindelijk de kristalstructuur op te lossen die verloren gaat in geo-assemblage. Het gaf belangrijke inzichten in GPCR-G eiwit interactie specificiteit.
Overzicht
Dit verslag beschrijft een systematisch protocol voor detergent-screening ter voorbereiding van de visuele GPCR, rhodopsine, en het complex daarvan met mini-G o. De gehanteerde biochemische methoden karakteriseren de kwaliteit van het complex in verschillende zuiveringsfasen, waardoor een kader wordt geboden dat toepasbaar is op andere membraaneiwitcomplexen.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Biochemie
- Structurele biologie
- Membraaneiwitonderzoek
Achtergrond
- Signaaltransductie is cruciaal voor cellulaire communicatie.
- Membraaneiwitten zijn essentieel voor het overbrengen van signalen naar intracellulaire partners.
- Detergent-screening is vitaal voor het optimaliseren van de preparatie van membraaneiwitcomplexen.
- Deze studie richt zich op rhodopsine, een belangrijke visuele GPCR.
Doel van de studie
- Om een protocol op te stellen voor systematische screening van detergentia.
- Om rhodopsine en het complex daarvan met mini-G o voor te bereiden voor structurele studies.
- Om kritieke parameters te identificeren die de preparatie van membraaneiwitcomplexen beïnvloeden.
Gebruikte methoden
- Het ontdooien en homogeniseren van HEK293-celpellets.
- Het toevoegen van detergentia en het uitvoeren van centrifugatie om eiwitten te solubiliseren.
- Het gebruik van immuno-affiniteitschromatografie voor eiwitzuivering.
- Het meten van eiwitspectra en het analyseren van monsters via SDS-PAGE.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van rhodopsine en het rhodopsine-mini-G proteïnecomplex.
- Detergent-screening bracht de optimale condities voor eiwitstabiliteit in kaart.
- UV-visuele spectra toonden de binding en isomerisatie van retinal aan.
- SDS-PAGE-analyse bevestigde de integriteit van de gezuiverde eiwitten.
Conclusies
- Systematische detergent-screening is essentieel voor studies naar membraaneiwitten.
- Optimale detergentcondities hebben een aanzienlijke invloed op de stabiliteit en kwaliteit van het eiwit.
- Dit protocol kan worden aangepast voor andere membraaneiwitcomplexen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Systematische screening van detergentia en karakterisering van complexen zijn cruciaal voor het mogelijk maken van structurele studies met hoge resolutie van GPCR-signaleringscomplexen, wat direct bijdraagt aan targetvalidatie in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling. Deze aanpak vermindert mechanische ambiguïteit door stabiele, monodisperse eiwitmonsters te definiëren, waardoor het voorspellend vertrouwen in downstream screening en leadidentificatie wordt vergroot. De methodologie biedt een herbruikbaar kader voor het verminderen van risico's bij membraaneiwittargets in verschillende therapeutische gebieden.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de specificiteit van de interactie tussen GPCR en G-eiwit te onderzoeken via de vorming van gestabiliseerde complexen.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve UV-Vis- en SEC-metrieken om de stabiliteit en monodispersiteit van het complex te beoordelen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het testen van hypothesen door detergentcondities te correleren met de functionele integriteit van het complex.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, monodisperse complexpreparaten die geschikt zijn voor biofysische en biochemische assays.
- Operationele waarde: Geautomatiseerde SEC en SDS-PAGE maken reproduceerbare kwaliteitscontrole mogelijk onder verschillende detergentcondities.
- Schaalbaarheid: Geoptimaliseerde condities uit kleinschalige screening dienen als basis voor grootschalige productie voor kristallisatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: De deglycosyleringsstrategie (EndoF1) resulteert in een homogene N-glycosylering, waardoor de heterogeniteit die crystallogenese belemmert, wordt verminderd.
- Mechanische risicoreductie: Valideert de complexvorming onder bijna-fysiologische omstandigheden met een gedefinieerde stoichiometrie (1:1 rhodopsine:mini-Go).
- Preklinische relevantie: Het gestabiliseerde complex in de actieve toestand ondersteunt het structuurgestuurde ontwerp van biased liganden of allosterische modulatoren.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot lead-optimalisatie door structureel gekarakteriseerde, functionele GPCR-complexen te leveren.
- Discovery Biology: UV-Vis-spectroscopie volgt ligandbinding en isomerisatie, wat functionele read-outs biedt voor de activatie-toestand van de receptor.
- Screening: SEC-profielen maken vergelijking van complexstabiliteit en monodispersiteit over verschillende detergent-screens mogelijk.
- Analytics: SDS-PAGE bevestigt de 1:1-stoichiometrie en beoordeelt de zuiverheid, wat go/no-go-beslissingen bij de preparatie van complexen ondersteunt.
- Translationeel onderzoek: Homogene glycosylering via EndoF1-behandeling verbetert de structurele gereedheid voor preklinische studies naar target engagement.
- Enterprise Reuse: De pijplijn voor detergent-screening en karakterisering is aanpasbaar voor andere GPCR's en membraaneiwitcomplexen.
Operationele en bedrijfsmatige impact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellend vertrouwen in doelwitvalidatie door middel van de preparatie van gestabiliseerde complexen in actieve toestand.
- Operationele waarde: Een gestandaardiseerde workflow met geautomatiseerde SEC en kwantitatieve spectroscopie waarborgt de reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert de identificatie van lead-verbindingen door structurele inzichten te verschaffen in de specificiteit van GPCR-effectoren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten mogelijk op basis van de hanteerbaarheid van complexen en structurele haalbaarheid.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in membraaneiwitbiochemie, fluorescentiespectroscopie en chromatografische technieken.
- Afhankelijk van toegang tot ultracentrifuges, HPLC-systemen met automatische monsterafnemers en kwartscuvetten voor UV-Vis-metingen.
- Necessiteert cross-team standaardisatie voor detergent-screening, complexvorming en deglycosyleringsprotocollen.
- Aanpassing aan andere modellen vereist optimalisatie van de ligandconcentratie (bijv. retinal) en de blootstellingscondities aan licht.
- Praktische beperking: Heterogene glycosylering kan empirische screening van deglycosyleringsenzymen (bijv. EndoF1 vs. PNGase F) vereisen om homogeniteit te bereiken.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Cell Membrane Solubilization and Protein Extraction
3:53
UV-VIS Spectroscopy
4:33
Automated Size-Exclusion Chromatography of Rhodopsin and Rhodopsin Mini-Go Complex
6:44
Results: UV-VIS Spectroscopy, SEC, and SDS-PAGE
8:34
Conclusion
6:04
Deglycosylation
