Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

Channelrhodopsine-assisted circuit mapping is een precisietechniek voor functionele mapping van neurale projecties met lange afstand. Hier laten we zien hoe we deze aanpak kunnen gebruiken om circuits in de auditieve hersenstam te onderzoeken. In de hersenen plakjes, axonen uit meerdere bronnen zijn vaak vermengd, waardoor het moeilijk is om individuele ingangen te isoleren met behulp van elektrische stimulatie.

Door cracm te gebruiken, kan deze beperking worden overwonnen. Het vinden van lambda en consequent definiëren van de stereotaxic coördinaat systeem is een uitdaging als is het houden van de duur van de procedure kort. Het hebben van alle stappen zorgvuldig in kaart gebracht zal uw slagingspercentage te verhogen.

Begin met het besproeien van de operatie gebied met 70% ethanol te ontsmetten en plaats steriele handdoek gordijnen om de operatie gebied te dekken. Verwijder kooibedden om het risico op verstikking uit de herstelkooi te beperken. Zet vervolgens een verwarmingskussen onder de kooi en zorg voor een voedsel- en waterbron.

Breng het dier vervolgens over naar een stereotaxic-frame en ga verder met anesthesie. Plaats een rectale temperatuursonde en schakel de homeostatische temperatuurregelaar in. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.

Beheer preventieve pijnstillende. Scheer ten slotte de hoofdhuid met elektrische tondeuse. Desinfecteer de hoofdhuid met drie afwisselende wattenstaafjes povidone jodium en 70% ethanol.

Begin met de operatie door een incisie in de hoofdhuid langs de middellijn te maken, te beginnen tussen de oren en de aanhoudende rostral aan de ogen, waardoor de lambda en bregma hechtingen worden bloot. Duw de huid naar de zijkant en verwijder periosteum van het blootgestelde bot indien nodig. Vervolgens, markeer de lambda hechting met een chirurgische marker, plaats de punt van de nano-injector, zodat het gewoon aanraken lambda en nul de micromanipulator coördinaten.

Gebruik de nano-injector tip en micromanipulator om het verschil in hoogte tussen de lambda en bregma hechtingen te meten. Pas de hoogte van de paletbalk aan om lambda en bregma binnen plus of min hoogteverschil van 100 micrometer te brengen. Breng de injectieplaats in kaart met behulp van de nano-injector tip en micromanipulator coördinaatsysteem en markeer de site met een chirurgische marker.

Gebruik vervolgens een micromotorische boor met een boorbraam van 0,5 millimeter om een craniotomie over de injectieplaats uit te voeren. Om een brede transfectie van neuronen in de doelkern te garanderen, gebruikt u een nano-injector om injecties te maken op verschillende diepten in het weefsel en in het geval van grotere hersengebieden, zoals de inferieure colliculus, injecties te maken in de loop van twee of meer penetraties op verschillende X- en Y-coördinaten. Om de inferieure colliculus te injecteren, deponeren 20 nanoliter van het virus in de intervallen van 250 micrometer langs de Z-as tussen 2, 250 micrometer en 1, 750 micrometer diepte.

Voor injecties in de dorsale cochleaire kern, deponeren 20 nanoliters van het virus op een diepte van 4, 750 micrometer en 4, 550 micrometer respectievelijk. Wacht na het injecteren bij elke Z-coördinaat twee tot drie minuten voordat u de injector naar de volgende Z-coördinaat verplaatst om tijd te geven voor het virus om zich van de injectieplaats te verspreiden, waardoor de kans wordt verkleind dat het virus het injectiekanaal wordt opgezogen wanneer de nano-injector wordt verplaatst. Wacht vervolgens na de laatste injectie drie tot vijf minuten voordat u nano-injector uit de hersenen intrekt.

Wanneer de nano-injector wordt verwijderd uit de hersenen tussen penetraties en tussen dieren, uitwerpen van een klein volume van het virus uit de tip om te controleren of de tip niet is verstopt. Gebruik na injecties steriele PBS om de snijranden van de hoofdhuid nat te maken en beweeg de huid vervolgens voorzichtig terug naar de middellijn. Sluit de wond met eenvoudige onderbroken hechtingen met behulp van 6-0 nylon hechtingen.

Breng vervolgens 0,5 op een milliliter van 2% lidocaïnegelei aan op de wond. Verwijder de oorbalken en temperatuursonde, draai van isoflurane, en verwijder het dier uit de palettebalk en breng het naar de herstelkooi. Tot slot, houd het herstel nauwlettend in de gaten.

Zodra het dier volledig wakker is, bewegen, en het tonen van geen tekenen van pijn of nood, breng het terug in zijn kooi en de kooi terug te keren naar het vivarium. Gebruik standaard patchklemmethoden om opnames te maken. Begin met het plaatsen van de slice in een opnamekamer onder een vaste fase rechtop microscoop en voortdurend overvloedig met kunstmatige hersenvocht op twee milliliter per minuut.

Vervolgens patch neuronen onder visuele controle met behulp van een geschikte patch klem versterker. Ten slotte, tijdens groothandel opnames, activeren Chronos door het leveren van korte pulsen van 470 nanometer licht of ChrimsonR door korte pulsen van 580 nanometer licht door middel van commercieel beschikbare LED's. De resultaten gaven aan dat de injectie chrimsonR tot sterke uitdrukking in DCN met tdTomato fluorescentie zichtbaar in cellen en vezels leidde.

In het contralaterale ICC waren vezels die sterk zijn gelabeld met tdTomato na drie weken duidelijk zichtbaar, wat aantoont dat de chrimsonR-tdTomato-constructie op lange afstand kan worden geïnjecteerd wanneer ze in auditieve hersenstamkerkernen worden geïnjecteerd. Optische activering van ChrimsonR geëtcteerde EPSP's in IC VIP-neuronen, wat aangeeft dat ChrimsonR een nuttig hulpmiddel is voor lange afstand CRACM-experimenten wanneer de experimentele parameters het gebruik van rood licht in plaats van blauw licht vereisen. We vonden echter dat ChrimsonR gemakkelijk werd geactiveerd met blauw licht, met dezelfde drempel voor blauw licht activering als Chronos.

Voor dit protocol is het van het grootste belang om ervoor te zorgen dat de stereotaxic coördinaten correct zijn en om te bevestigen dat het virus alleen werd uitgedrukt in uw beoogde hersengebied. Door de Chronos ChrimsonR viroconstruct uit te wisselen met een ander virus, bijvoorbeeld een celspecifiek Flex-virus, u verschillende anatomische of fysiologische vragen beantwoorden zonder het operatieprotocol te wijzigen.