Name: Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Leer hoe u hoornvlies endotheliale cellen van mens en schaap kweekt op biomateriële membranen. Dit protocol voorkomt epitheliale tot mesenchymale transitie tijdens isolatie en subcultuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Met dank aan Noémie Gallorini voor haar hulp bij de voorbereiding van figuur 7. Dit werk werd ondersteund door een project subsidie toegekend aan DH door de National Health and Medical Research Council of Australia (Project Grant 1099922), en door aanvullende financiering ontvangen van de Queensland Eye Institute Foundation.

Menselijke hoornvliezen met donortoestemming voor onderzoek werden verkregen van de Queensland Eye Bank en gebruikt met ethische goedkeuring van de Metro South Hospital en Health Service's Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Schapen hoornvliezen werden verkregen uit geëuthanaseerde dieren op de Herston Medical Research Facility van de Universiteit van Queensland onder een weefsel delen overeenkomst.
1. Bereiding van hulpmiddelen voor ontleding
<ol><li>Steriliseren twee paar van nummer 4 horlogemaker forceps door ofwel weken ze in een oplossing van 70% ethanol voor 5 min of door autoclaving hen.</li>
</ol>2. Bereiding van kweekmedium- en weefselkweekplaten
<ol><li>Bereid 100 mL kweekmedium met Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1, 5% foetaal runderserum en 100 U/mL Pen/Strep. Dit kweekmedium is voldoende voor schapenhoornvliescelculturen, maar voor menselijke hoornvliesendotheliale celculturen moet het medium worden aangevuld met 50 μg/mL runderpituitary extract, 0,08% chondroitinsulfaat, 200 μg/mL calciumchloride en 0,3 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat. Kweekmedium kan twee weken lang in het donker bij 4 °C worden opgeslagen.</li>
	<li>Bestrijk de putten van een 6-goed weefsel kweekplaat met Attachment Factor met behulp van de instructies van de fabrikant en voeg vervolgens 1 mL kweekmedium toe aan elke goed gecoate gecoate. Bereid een goed voor elk hoornvlies.</li>
</ol>3. Explant dissectie en celkweekprocedure
<ol><li>Plaats het hoornvlies, endotheel kant omhoog, in een steriele petrischaal op het podium van een ontledende microscoop. Pas de verlichting zo aan dat het hoornvliesoppervlak goed verlicht is met voldoende contrast om de endotheellaag te markeren. Pas de zoom zo in dat de rand en een centraal hoornvliesendotheel in zicht is.</li>
	<li>Gebruik gesteriliseerde horlogemaker forceps om voorzichtig lift en scheur Descemet's membraan uit de buurt van de onderliggende stroma (Figuur 1). Het membraan zal loskomen van de stroma als een strip die onmiddellijk opgerold. Plaats de strip in een put van een 6-goed weefsel kweekplaat die is bekleed met Attachment Factor en bevat 1 mL van cultuur medium. Het deksel van de weefselkweekplaat moet te allen tijde worden ingeschakeld, behalve wanneer er explanten aan worden toegevoegd, om het risico op besmetting te verminderen.</li>
	<li>Verwijder strips van Het membraan van Descemet uit de extreme periferie van het endotheel eerst en vervolgens uit centrale gebieden later. Plaats alle stroken van één hoornvlies in één enkele put binnen de 6-put plaat.</li>
	<li>Bebroed de explants in een bevochtigde celkweekincubator op 5% CO2 en 37 °C. Laat de cultuur 2 dagen ongestoord staan om de explants te laten verzinken en aan het plaatoppervlak te bevestigen. Meestal, tot een derde van de explants niet te hechten aan de plaat.</li>
	<li>Verwijder het medium en eventuele niet-aangesloten explants na 4 dagen uit de cultuur en voeg voorzichtig 2 mL vers kweekmedium toe, waarbij ervoor wordt gezorgd dat de bijgevoegde explants niet worden verstoord. Cultuurmedium moet twee keer per week worden gewijzigd.</li>
</ol>4. Continue productie van hoornvliesendotheelcellen door seriële explantcultuur
OPMERKING: Explants kunnen na 10 dagen worden overgebracht naar verse weefselkweekplaten om extra hoornvliescelculturen vast te stellen.
<ol><li>Plaats de explantcultuur op het podium van een ontledende microscoop en pas de verlichting aan en zoom zodat de explants zichtbaar zijn.</li>
	<li>Met behulp van gesteriliseerde horlogemaker forceps, voorzichtig plukken elke explant uit zijn cultuur plaat en breng het naar een frisse put van een 6-goed weefsel cultuur plaat die is bekleed met Attachment Factor en bevat 1 mL van cultuur medium.</li>
	<li>Laat de explants zich 4 dagen op het oppervlak van hun nieuwe plaat nestelen voordat ze het kweekmedium vervangen door 2 mL vers kweekmedium. Verandering cultuur medium veranderd twee keer per week.</li>
</ol>5. Teelt hoornvliesendotheliale cellen op glashoezen voor immunofluorescentieanalyses
OPMERKING: Celculturen die bestemd zijn om te worden geanalyseerd met behulp van immunofluorescentie moeten worden vastgesteld op glazen afdekkingen die na de kleuringsprocedure op glazen microscoopdia's kunnen worden gemonteerd.
<ol><li>Steriliseren van een pak ronde glazen afdekkingen met een diameter van 13 mm in een autoclave of door gedurende 15 minuten 70% ethanol te weken, gevolgd door drie spoelingen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Plaats individuele coverslips in de putten van een 24-put weefsel cultuur plaat, coat ze met Attachment Factor, en voeg dan 0,5 mL van de cultuur medium aan elke put.</li>
	<li>Met behulp van gesteriliseerde horlogemaker forceps verwijderen explants uit hun weefsel cultuur platen en breng ze naar putten met coverslips. Laat de explants zich 4 dagen op de coverslips nestelen voordat ze het medium veranderen.</li>
	<li>Na de vereiste incubatietijd, vast te stellen en vlekken op de coverslip culturen binnen hun cultuur putten. Monteer de gekleurde coverslips op glazen microscoopdia's voor analyse onder een fluorescentiemicroscoop.</li>
</ol>6. Subcultuur van hoornvliesendotheliale cellen met Dispase II
OPMERKING: Grote fibroblastische cellen kunnen selectief worden verwijderd uit explant culturen in 6-goed platen voordat subculturing met behulp van deze procedure. Als alle cellen moeten worden subcultuurd, voer dan geen stappen 6.2 tot 6.4 uit. Het doel van deze procedure is om de cellen over te brengen naar verse platen met behoud van hun cel-naar-cel contacten zoveel mogelijk. De cellen moeten voorzichtig worden behandeld. Volledig confluent putten moeten worden doorgepassaged op een verhouding van 1:2, terwijl subconfluent putten moeten worden doorgepassaged bij een verhouding van 1:1 of minder.
<ol><li>Haal het medium uit de cultuur en spoel kort af met DPBS.</li>
	<li>Voeg 1 mL Versene toe. Incubeer bij kamertemperatuur voor 30 s.</li>
	<li>Verwijder de Versene en voeg 1 mL TrypLE toe. Incubeer bij 37 °C in de weefselkweekincubator gedurende 3 min.</li>
	<li>Observeer de cultuur met behulp van een fase contrast microscoop. Tik voorzichtig op de cultuur om cellen van de plaat los te maken. Zodra de grote fibroblastische cellen hebben losgemaakt van de plaat verwijder ze en de TrypLE met behulp van een 1 mL pipet. Was de resterende TrypLE van de resterende cellen door twee maal te spoelen met 2 mL DPBS.</li>
	<li>Voeg 1 mL van 1 mg/mL Dispase II toe aan de kweek en incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 1 tot 2 uur of totdat alle cellen van de plaat zijn losgemaakt. De cellen moeten geleidelijk wegdrijven van de plaat in klonten.</li>
	<li>Verzamel de cellen met behulp van een 1 mL pipet en breng over op 20 mL DPBS in een centrifugebuis van 50 mL. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de supernatant en voorzichtig opnieuw de cel pellet door trituratie met een 1 mL pipetin in 1 mL van cultuur medium. Breng de celvering over op één of twee putten van een 6-putplaat, naar passage bij een verhouding van respectievelijk 1:1 of 1:2.</li>
	<li>Vul het medium in elke put aan om 2 mL te maken en plaats de culturen in de weefselkweekincubator. Vervang het medium twee keer per week door 2 mL vers medium.</li>
</ol>7. Groei van hoornvliesendotheliale cellagen op biomateriële membranen
OPMERKING: De volgende procedure beschrijft de stappen die betrokken zijn bij het monteren van een membranous biomateriaal in een op maat gemaakt montageapparaat - een micro-Boyden-kamer genoemd - voor celcultuur. Raadpleeg onze recente publicatie6 voor meer informatie over het apparaat en voor aankoopgegevens.
<ol><li>Monteer de bovenste kamer van de micro-Boyden kamer door het plaatsen van een rode O-ring in het midden.</li>
	<li>Gebruik een trephine met een diameter van 18 mm om een schijf uit een biomateriaalplaat op een polytetrafluorethyleen (PTFE) snijplaat te slaan. Plaats deze schijf over de rode O-ring in de bovenkamer van de micro-Boyden kamer.</li>
	<li>Schroef de onderste kamer op de bovenste kamer en vastzet de biomateriaalschijf ertussen.</li>
	<li>Week de geassembleerde micro-Boyden kamer in 70% ethanol voor 1 uur om het te steriliseren.</li>
	<li>Dompel de geassembleerde micro-Boyden-kamer gedurende 10 min volledig onder in steriele HBSS om de ethanol te verwijderen. Herhaal deze wasstap twee keer. Voer een laatste wasstap uit voor 10 min in onaangevuld kweekmedium.</li>
	<li>Breng de gesteriliseerde micro-Boyden kamer naar kweekmedium in de put van een 6-put plaat ervoor te zorgen dat de bovenste kamer is bovenste. Pas het niveau van kweekmedium aan zodat het het onderste oppervlak van het biomateriaalmembraan raakt, maar niet in de bovenste kamer stroomt.</li>
	<li>Bereid een suspensie van hoornvlies endotheelcellen met behulp van de procedure beschreven in sectie 6. Er moet voldoende celdichtheid in de suspensie worden bereikt om een zaaidichtheid van ten minste 100.000 cellen per cm2 op het membraan in de micro-Boyden-kamer mogelijk te maken. Het kweekoppervlak binnen de micro-Boyden kamer is 0,5 cm2 en kan een volume van 100 μL bevatten. Daarom moet een suspensie met 500.000 cellen/mL worden voorbereid.</li>
	<li>Pipetteer 100 μL celsuspensie (50.000 cellen) op het membraan in de micro-Boyden-kamer. Incubeer in de weefselkweekincubator gedurende 4 uur voordat u het medium bijvult om de kamer volledig onder te dompelen. Incubeer de cultuur voor de vereiste periode van tijd, ter vervanging van het medium twee keer per week. OPMERKING: Zodra het hoornvlies endotheel cellen hebben bevestigd aan het bovenste oppervlak van het biomateriaal membraan de micro-Boyden kamer kan worden omgedraaid binnen de cultuur goed, zodat de onderste kamer is bovenste. Meer cellen kunnen vervolgens worden toegevoegd aan de kamer om celculturen te initiëren op het andere oppervlak van het membraan. Bijvoorbeeld, hoornvlies stromal cellen kunnen gemakkelijk worden toegepast op het alternatieve oppervlak waardoor het nabootsen van de relatieve locatie van hoornvlies celtypes zoals gezien in het achterste hoornvlies.</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
<li>Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Corneal transplantation.</a> The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).</li>
<li>Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+issues+for+human+corneal+endothelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regnerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).</li>
<li>Senoo, T., Joyce, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Cycle+Kinetics+in+Corneal+Endothelium+from+Old+and+Young+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).</li>
<li>Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+process+of+corneal+endothelial+morphological+change+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology%2C+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro.</a> Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).</li>
<li>Harkin, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+Biomaterials+for+Use+in+Ophthalmic+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies.</a> Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).</li>
<li>Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell migration.</a> Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).</li>
<li>Walshe, J., Harkin, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+explant+culture+provides+novel+insights+into+the+potential+location+and+phenotype+of+corneal+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells.</a> Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).</li>
<li>Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+corneal+endothelial+cells+from+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cultivation of corneal endothelial cells from sheep.</a> Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).</li>
<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
<li>Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+human+corneal+endothelial+cells+isolated+from+paired+donor+corneas%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas.</a> PLoS One. 6 (12), 28310(2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Een belangrijke technische uitdaging in verband met het opzetten en uitbreiden van menselijke hoornvlies endotheelcellen is het voorkomen van EMT optreden in de culturen. EMT kan worden geactiveerd in hoornvlies endotheelcellen door verlies van cel-op-cel contact, maar de meeste celkweek protocollen voor deze cellen te betrekken enzymatische dissociatie naar enkele cellen tijdens isolatie en subcultuur10. Hier presenteren we een alternatief celkweekprotocol voor hoornvliesendotheliale cellen dat h...

Het hoornvlies is een transparant weefsel dat zich aan de voorkant van het oog bevindt. Het bestaat uit drie grote lagen: een epitheellaag op het buitenoppervlak, een middelste stromalaag en een binnenste laag genaamd het hoornvliesendotheel. Het hoornvlies endothehelium is een monolaag van cellen die zit op een kelder membraan genaamd Descemet's membraan en het handhaaft de transparantie van het hoornvlies door het reguleren van de hoeveelheid vloeistof die de stroma van de onderliggende waterige humor. Te veel vocht in de stroma veroorzaakt hoornvlies zwelling, dekking en verlies van het gezichtsvermogen. Het endotheel is daarom van vitaal belang voor het behoud van visie.
Het hoornvlies endotheel kan disfunctioneel worden om een aantal redenen, waaronder veroudering, ziekte en letsel, en de enige huidige behandeling is transplantatie chirurgie. Tijdens deze operatie worden het endotheel en het membraan van Descemet uit het hoornvlies van de patiënt verwijderd en vervangen door een graft van endotheel en het membraan van Descemet verkregen uit een donorhoornvlies. Veel endotheelgrafts bevatten ook een dunne laag stromal weefsel om de behandeling en gehechtheid aan het gastheerhoornvlies te helpen1.
Wereldwijd is de vraag naar hoornvliesdonorweefsel voor transplantatieoperaties groter dan het bedrag dat door oogbanken kan worden geleverd2. Er is daarom een drive om weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties die kunnen worden gebruikt om dit tekort te verlichten3ontwikkelen. De reden hiervoor is gebaseerd op het feit dat momenteel, endotheel van een individueel hoornvlies kan alleen worden overgedragen aan een enkele patiënt, echter, als het hoornvlies endotheel cellen werden voor het eerst uitgebreid en geteeld op biomateriële steigers in weefselcultuur, ze kunnen worden gebruikt om meerdere patiënten te behandelen.
Grote uitdagingen die moeten worden aangepakt voordat weefsel-engineered hoornvlies endotheeltransplantaties een haalbare optie voor chirurgen worden: (1) het vaststellen van technieken voor het uitbreiden van hoornvlies endotheelcellen van hoge kwaliteit en voor het produceren van volwassen en functionele hoornvlies endotheel cellagen in vitro, en (2) het vaststellen van technieken voor het kweken van de cellen op biomateriële steigers om weefsel-engineered grafts die gelijk zijn aan, of beter dan, de donor hoornvlies-afgeleide grafts die momenteel worden gebruikt te produceren.
Hoornvliesendotheliale cellen hebben een zeer laag proliferative potentieel in vivo, maar kunnen worden gestimuleerd om in vitro te verdelen4. Niettemin hebben ze een sterke neiging om in vitro epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan, wat hun vermogen om een volwassen, functionele endotheellaag te vormen vermindert. Bekende triggers voor EMT in hoornvlies endotheelcellen zijn blootstelling aan bepaalde groeifactoren en verlies van cel-op-cel contact5. Het is dus bijna onvermijdelijk dat hoornvliesendotheliale celculturen die enzymatisch gescheiden zijn tijdens de subcultuur veranderingen zullen ondergaan die verband houden met EMT. Hier presenteren we een celkweekmethode voor menselijke of schapen hoornvliesendotheliale cellen die is ontworpen om verstoring van cel-cel-celcontacten tijdens isolatie-, expansie- en subcultuurfasen te minimaliseren, om het potentieel voor EMT te verminderen. Bovendien tonen we aan hoe weefsel-engineered grafts die lijken op donor hoornvlies-afgeleide endotheel / Descemet's membraan / stromal weefsel grafts kunnen worden geproduceerd door groeiende gekweekte cellagen aan beide zijden van een bio-materiaal membraan in een op maat gemaakte montage-apparaat.

<table><tbody><tr><td>Aanhechtingsfactor</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>Een 1X steriele oplossing met gelatine die gebruikt wordt om weefselkweekoppervlakken te coaten. Bewaren bij 4 °C.</td></tr><tr><td>Runderhypofyse-extract</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>Een enkele flacon bevat 25 mg. In porties invriezen.</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Merck</td><td>C5670</td><td>Oplossen in HBSS om een 1 mM stockoplossing te maken. Filter steriliseren.</td></tr><tr><td>Centrifugebuis, 50 ml</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>Chondroitinsulfaat</td><td>LKT Laboratories</td><td>C2960</td><td>Dit is bovien chondroitinsulfaat. Oplossen in HBSS om een 0,08 g/mL stockoplossing te maken. Filter steriliseren en in porties invriezen.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Oplossen in DPBS om een 2 mg/mL stockoplossing te maken. Filter steriliseren en in porties invriezen.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>100% onverdunde ethanol moet worden verdund tot 70% in gedeïoniseerd water voor het steriliseren van instrumenten en oppervlakken.</td></tr><tr><td>Foetaal runder serum</td><td>GE Healthcare Australia Pty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>Dit is een HyClone merk van foetaal runder serum.</td></tr><tr><td>Dekglas No. 1, Ø 13 mm</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>Plaats gesteriliseerde dekglazen in 24-well platen voor weefselkweek.</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>Hank's evenwichtige zout oplossing, 1X, bevattend calciumchloride en magnesiumchloride.</td></tr><tr><td>L-ascorbinezuur 2-fosfaat</td><td>Merck</td><td>A8960</td><td>Oplossen in HBSS om een 150 mM stockoplossing te maken. Filter steriliseren.</td></tr><tr><td>Micro-Boyden kamer</td><td>CNC Components Pty. Ltd.</td><td>Bovenste ring: QUT-0002-0006, Basisring: QUT-0002-0007</td><td>Beide componenten zijn gemaakt van polytetrafluorethyleen (PTFE).</td></tr><tr><td>O-ring voor micro-Boyden kamer</td><td>Ludowici Sealing Solutions</td><td>RSB012</td><td>Samengesteld uit siliconenrubber.</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>Een gereduceerd serum medium bevattend glutamine.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing, 1X, zonder calciumchloride en magnesiumchloride.</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Een 100X antibioticum oplossing bevattend 10.000 eenheden/mL penicilline en 10.000 µg/mL streptomycine.</td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>Steriele petrischaal, 92 X 16 mm, voor weefsel dissecties.</td></tr><tr><td>Weefselkweekplaat, 24 well</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td><td>Een plaat bevattend 24 wells, elk met een oppervlakte van 2 cm2.</td></tr><tr><td>Weefselkweekplaat, 6 well</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>Een plaat bevattend 6 wells, elk met een oppervlakte van 9 cm2.</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>Een 1X enzym oplossing voor het dissociëren van cellen.</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>Een 1X EDTA oplossing voor het dissociëren van cellen.</td></tr><tr><td>Uurwerkerstangen</td><td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>Nummer 4 uurwerkerstangen werken goed voor het verwijderen van strips van endotheel/Descemet's membraan van hoornvliezen.</td></tr></tbody></table>

groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Hoornvlies endotheelcelculturen hebben de neiging om epitheel-naar-mesenchymale overgang (EMT) te ondergaan na verlies van cel-op-cel contact. EMT is schadelijk voor de cellen omdat het hun vermogen om een volwassen en functionele laag te vormen vermindert. Hier presenteren we een methode voor het vaststellen en subcultureren van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale celculturen die het verlies van cel-op-cel contact minimaliseert. Explants van hoornvlies endothehelium / Descemet's membraan worden genomen uit donorhoornvliezen en geplaatst in weefselcultuur onder omstandigheden die het mogelijk maken de cellen collectief migreren naar het cultuuroppervlak. Zodra een cultuur is vastgesteld, worden de explants overgebracht naar verse platen om nieuwe culturen te initiëren. Dispase II wordt gebruikt om klontjes cellen voorzichtig van weefselkweekplaten te tillen voor subculturing. Hoornvlies endotheelcelculturen die met dit protocol zijn vastgesteld, zijn geschikt voor de overdracht naar biomateriële membranen om weefsel-gemanipuleerde cellagen te produceren voor transplantatie in dierproeven. Een op maat gemaakt apparaat voor de ondersteuning van biomateriële membranen tijdens weefselkweek wordt beschreven en een voorbeeld van een weefsel-engineered graft samengesteld uit een laag hoornvlies endotheelcellen en een laag hoornvlies stromal cellen aan weerszijden van een collageen type I membraan wordt gepresenteerd.

De methode voor het isoleren en uitbreiden van hoornvliescellen van menselijke of schapenhoornvliezen wordt samengevat in figuur 1 en figuur 2. De meeste explants die zijn afgeleid van de hoornvliezen van 1 tot 2-jarige schapen of menselijke donoren van minder dan 30 jaar oud zal hechten aan Attachment Factor-gecoate weefsel kweekplaten binnen een week, echter, is het niet ongebruikelijk om te vinden dat tot een derde van de explants niet hechten binnen deze tij...

Dit protocol beschrijft de kritieke stappen die nodig zijn om hoornvliesendotheliale celculturen uit explants van menselijk of schapenweefsel vast te stellen en te kweken. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het subculturen van hoornvliescellen op membranous biomaterialen.

Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Dit celcultuurprotocol is ontworpen om te voorkomen dat hoornvlies endotheelcellen epitheliale naar mesenchymale overgang ondergaan tijdens isolatie, expansie en subcultuur. Celculturen worden vastgesteld uit hoornvliesweefsel explants, die kunnen worden hergebruikt om een voortdurende levering van primaire cellen van een donor te garanderen. Begin met het coaten van de putten van een zes-goed weefsel kweekplaat met gehechtheid factor met behulp van de instructies van de fabrikant.Voeg vervolgens een milliliter cultuurmedium toe aan elke gecodeerde put. Plaats het hoornvlies endotheel kant omhoog in een steriel petrischaaltje op het podium van een ontledende microscoop. Pas de verlichting zo aan dat het hoornvliesoppervlak goed verlicht is met voldoende contrast om de endotheellaag te markeren en pas de zoom zo aan dat de rand en een centraal hoornvlies endotheel in beeld zijn.Gebruik gesteriliseerde horlogemaker tangen om het membraan van Descemet voorzichtig op te tillen en te scheuren uit de buurt van de onderliggende stroma. Plaats de membraanstrook in een van de bereide putten van de kweekplaat, zorg ervoor dat u het deksel van de plaat onmiddellijk vervangt om het risico op besmetting te verminderen. Verwijder eerst de stroken van het membraan van Descemet uit de extreme periferie van het endotheel, en later uit de centrale gebieden, waarbij alle stroken van één hoornvlies in één put worden verwijderd.Wanneer voltooid, inculbateren van de explants in een bevochtigde cel cultuur incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Monteer de bovenste kamer van de micro Boyden kamer door het plaatsen van een rode O ring in het midden. Gebruik een trephine met een diameter van 18 millimeter om een schijf van een biomateriaalplaat op een PTFE snijplank te ponsen.Plaats vervolgens de schijf over de rode O-ring in de bovenste kamer van de micro-boydenkamer. Schroef de onderste kamer op de bovenste kamer en beveilig de schijf van het biomateriaal ertussen. En week de geassembleerde micro Boyden kamer in 70% ethanol voor een uur om het te steriliseren.Na het weken, volledig onderdompelen in steriele HBSS gedurende 10 minuten om de ethanol te verwijderen. Was vervolgens de kamer in cultuurmedium gedurende 10 minuten. En overdracht naar cultuurmedium in een put van een zes-put plaat, ervoor te zorgen dat de bovenste kamer is naar boven georiënteerd.Pas het niveau van het medium zo aan dat het contact maakt met het onderste oppervlak van het biomateriaalmembraan, maar niet in de bovenste kamer stroomt. Pipette 100 microliters van celsuspensie op het membraan in de micro Boyden kamer, en uitbroeden in de weefselkweek incubator voor vier uur, alvorens het toevoegen van medium om volledig onder te dompelen de kamer. De meeste explants die werden afgeleid uit de hoornvliezen van een tot twee jaar oude schapen of menselijke donoren van minder dan 30 jaar oud verbonden aan gehechtheid factor gecodeerde weefselkweek platen binnen een week.Na zes weken waren er veel kleine, strak verpakte cellen aanwezig naast de explant. Kleine, strak verpakte cellen in de hoornvlies endotheelcelculturen zijn bestand tegen vertering met drievoudige, terwijl de grotere fibblastic cellen er gevoeliger voor zijn. Dit verschil werd benut om selectief grote cellen uit de culturen te verwijderen alvorens de kleinere cellen naar nieuwe platen over te brengen.Immunole bloemscentie analyses werden uitgevoerd op hoornvlies endotheel celculturen om ZO-1 te lokaliseren, een strak knooppunt eiwit, en N-cadherine, een hechting knooppunt eiwit. Dezelfde antilichamen werden gebruikt voor zowel schapen als menselijke cellen, en beide eiwitten werden gedetecteerd in de plasmamembranen van cellen van beide soorten. De op maat gemaakte micro Boyden kamer stond toe dat beide zijden van een membraan tegelijkertijd als celkweekoppervlakken konden worden gebruikt.Een dwarsdoorsnede weergave van een weefsel ontworpen cel constructie toont een enkele laag van hoornvlies endotheelcellen op een oppervlak, en een meerlaagse cultuur van hoornvlies stromal cellen op de andere. Bij het proberen van dit protocol, is het belangrijk om te voorkomen dat schrapen het endotheel met je tangen als je peeling Descemet membraan uit de buurt van het hoornvlies. Na deze procedure kan de integriteit van een hoornvlies endotheelcellaag op een membraan worden gecontroleerd door de elektrische weerstand te meten.

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Mechanische stimulatie geïnduceerde Calcium golfvoortplanting in celmonolagen: Het voorbeeld van Bovine corneale endotheelcellen

Wij rapporteren een methode voor de fabricage van micropockets binnen electrospun membranen waarin celgedrag te bestuderen. Specifiek beschrijven we een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen voor de productie van PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) corneale biomateriaal inrichtingen voorzien microfeatures.

Combinatie van Microstereolithography en Electrospinning naar Membranen Uitgerust met Niches voor cornearegeneratie Produce

Een voorbeeld van adenovirale gentherapie in humane diabetische orgaan-gecultiveerde hoornvliezen wordt gepresenteerd met als doel de normalisatie van vertraagde wondgenezing en een duidelijk verminderde expressie van epitheliale stamcelmarkers in deze hoornvliezen. Het beschrijft ook de optimalisering van dit proces in stamcel-verrijkte limbale epitheelculturen.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Dit protocol beschrijft een nieuwe driedimensionale in vitro model, waar hoornvlies stromale cellen en gedifferentieerde neuronale cellen samen worden gekweekt om te helpen bij het onderzoek en het begrijpen van de interacties van de twee celtypes.

Hoornvlies weefselengineering: Een In Vitro Model van de interacties die stromale-zenuwen van het hoornvlies, menselijke

Beschrijven we een methode om ingenieur een retinale weefsel samengesteld van retinale pigment epitheliale cellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen gekweekt op de top van menselijke vruchtwater membranen en de voorbereiding voor de transplantatie in diermodellen.

Transplantatie-geschikt retinale Pigment epitheel Tissue Engineering afgeleid van menselijke embryonale stamcellen

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier wordt een stap-voor-stap protocol voor de bereiding en de teelt van de corneale knoppen van het varkens gesplitst. Aangezien dit organo-typisch gecultiveerde orgel cultuur model de celsterfte binnen 15 dagen weergeeft, vergelijkbaar met de menselijke donor cornea's, vertegenwoordigt het het eerste model dat langdurige teelt van niet-humane cornea's toestaat zonder toxische dextran toe te voegen.

Een porcine Corneale endotheliale orgel cultuur model met behulp van splitsen Corneale knoppen

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Descemet's Stripping Only is een experimentele procedure waarbij patiënten met centrale cornea guttae als gevolg van Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy het membraan van Descemet laten strippen voor perifere cellen om de endotheellaag te regenereren. We presenteren een nieuwe methodologie die DSO simuleert in dystrofische menselijke hoornvliezen ex vivo met versnelde genezing gestimuleerd door eFGF1 (NM141).

Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige single-cell suspensies uit hele muishoornvliezen te verkrijgen via sequentiële vertering met collagenase A en trypsine. Deze methode levert levensvatbare individuele cellen met hoge RNA-integriteit op, waardoor ze compatibel zijn met downstream-toepassingen zoals single-cell RNA-sequencing en flowcytometriey.

Een protocol voor het oogsten van single-cel suspensie uit muizenhoornvliezen

Leer hoe u hoornvlies endotheliale cellen van mens en schaap kweekt op biomateriële membranen. Dit protocol voorkomt epitheliale tot mesenchymale transitie tijdens isolatie en subcultuur.

Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Meer video's verkennen