Name: Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryos met behulp van head space gaschromatografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer hoe u ethanol niveaus kwantificeert in zebravis embryo's met head space gaschromatografie. Deze methode maakt snelle, reproduceerbare metingen mogelijk voor toxicologisch onderzoek naar ontwikkeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek gepresenteerd in dit artikel werd ondersteund door eerdere subsidies van national institutes of health / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH / NIDCR) R01DE020884 aan J.K.E. en National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wij danken Rueben Gonzales voor het verstrekken en assisteren met gaschromatograaf analyse. Wij danken Tiahna Ontiveros en Dr Gina Nobles schriftelijke hulp.

Alle zebravisembryo's die in deze procedure werden gebruikt, werden gefokt en gefokt volgens de vastgestelde IACUC-protocollen27. Deze protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Texas in Austin en de Universiteit van Louisville.
OPMERKING: De zebravislijn Tg(fli1:EGFP)y1 werd gebruikt in deze studie28. Al het water dat in deze procedure wordt gebruikt, is steriel omgekeerd osmosewater. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met Behulp van Graphpad Prism v8.2.1.
1. Embryomedia maken
<ol><li>Los 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g van K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4en 4,9 g MgSO4·7H2O in 1 L water op. Negeer het witte neerslag dat zich vormt; dit zal geen invloed hebben op de media. Filter steriliseert de voorraadoplossing en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Los 1,2 g NaHCO3 op in 1 L van 20x embryomediavoorraad en voeg 19 L water toe om de werkende embryomediaoplossing te creëren. Houd de werkende embryomediaoplossing op 28 °C.</li>
</ol>2. Meten van het embryonale volume met behulp van waterverplaatsing
OPMERKING: In dit protocol worden 24 uur postbevruchting (hpf) embryo's(figuur 1)gebruikt. De embryo's die bij de volumemetingen worden gebruikt, worden niet gebruikt in de ethanolanalyse.
<ol><li>Plaats 10 embryo's en extraembryonale vloeistof in 1,5 mL microcentrifugebuis met een volume van 250 μL (figuur 2A). Voeg water toe aan de vullijn van 250 μL (zie monster met geverfd water in figuur 2B).</li>
	<li>Herhaal stap 2.1 om recipiënten op te zetten voor embryo's die hun chorions hebben laten verwijderen.<ol>
<li>Om de chorion te verwijderen, plaatst u de embryo's in hun chorions in een 100 mm petrischaal met 2 mg/mL proteasecocktail in embryomedia op kamertemperatuur (RT) gedurende 10 min. Om de paar minuten, zachtjes wervelen de embryo's om de chorion te breken.</li>
		<li>Zodra alle embryo's vrij zijn van hun chorion, verwijder de gedechorionated embryo's uit protease cocktail/embryo media en plaats in een nieuwe 100 mm petrischaal met verse embryomedia om de embryo's te wassen. Herhaal deze wasstap 1 meer tijd (voor een totaal van 2 wasbeurten). Breng de embryo's over naar een verse petrischaal van 100 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van de kleinst mogelijke tip en zonder beschadiging van de embryo's, zorgvuldig verwijderen van alle vloeistof uit de buurt van de embryo's met behulp van een p200 micropipettor (Figuur 2C) en weeg het water met een schaal met <0,1 mg precisie. Als u het volume van het monster van 10 embryo's wilt bepalen, trekt u het gewicht/volume van het water (1 mL water = 1 g water.) af van 250 μL. Om het volume van één embryo te bepalen, verdeelt u het verschil tussen 250 μL en het gewicht van het water dat door 10 wordt verwijderd.</li>
</ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ01.jpg">
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ02.jpg">
3. Behandeling van embryo's met ethanol
<ol><li>Verzamel embryo's uit paringstanks en plaats in een standaard petrischaal van 100 mm. Tel niet meer dan 100 embryo's per petrischaaltje uit en uitbroed bij 28,5 °C. OPMERKING: Als de chorion moet worden verwijderd (stap 2.2), moet deze worden verwijderd voordat ethanol wordt toegevoegd.</li>
	<li>Bij 6 pkf, voeg tot 100 embryo's toe aan een nieuwe standaard 100 mm Petrischaal met embryomedia of embryomedia + 1% ethanol (v/v). Dek af, maar verzegel de petrischaal niet. Plaats de embryo's in een laagtijdelijke couveuse op 28,5 °C gedurende 18 uur, of totdat de embryo's het ontwikkelingstijdpunt van 24 pk f bereiken.</li>
</ol>4. Werkstroom voorbereiden alvorens de embryo's te verwerken op hoofdgaschromatografie
<ol><li>Maak een oplossing van 5 M NaCl in water (450 μL zal per monsterbuis nodig zijn) om alle eiwitten te denatureren en ethanolmetabolisme te voorkomen. Maak de protease cocktail ( Table ofMaterials) met een concentratie van 2 mg/mL in embryomedia.</li>
	<li>Label een microcentrifugebuis van 1,5 m L en een gaschromatograafflesvan 2 mL voor elk monster. Label extra 2 mL gaschromatograaf flacons voor de hieronder beschreven ethanolnormen, evenals lucht, water en de 5 M NaCl/protease cocktail blanks.</li>
	<li>Stel drie p200-micropipettors twee set-op-50 μL en de derde set op 200 μL; een p1000 micropipettor ingesteld op 450 μL en een p2 micropipettor ingesteld op 2 μL. Voor de glaspipetten die worden gebruikt om embryo's van de petrischaaltjes naar de 1,5 mL microcentrifugebuizen over te brengen, passeert u snel de pipettip door een vlam om de randen glad te strijken om de embryo's niet te beschadigen wanneer ze in de pipet worden getrokken.</li>
</ol>5. Verwerking van embryo's voor hoofdruimtegaschromatografie
OPMERKING: Zowel embryo's in hun chorions als embryo's die eerder uit hun chorions zijn verwijderd, worden hetzelfde behandeld voor consistentie bij de berekening van verdunningsfactoren.
<ol><li>Met behulp van de twee p200 micropipettors ingesteld op 50 μL, trekken 50 μL van de protease cocktail oplossing in een en trekken 50 μL water in de tweede.</li>
	<li>Plaats met behulp van de glazen pipet en micropipett snel 10 embryo's (vanaf stap 3.2) in een microcentrifugebuis van 1,5 mL en sluit de dop (zoals beschreven in figuur 2A). Herhaal dit voor alle monsters die moeten worden getest, controles en met ethanol behandelde embryo's.</li>
	<li>Met behulp van de p200 micropipettor ingesteld op 200 μL, snel open de dop en verwijder alle resterende embryo media (zoals beschreven in figuur 2C). Plaats snel de pipet met 50 μL water in de buis en snel maar voorzichtig (om de embryo's niet te beschadigen) voeg, verwijder dan het water. Voeg snel 50 μL van de protease cocktailoplossing toe aan de wachtende pipett en sluit de buisdop(figuur 2D). OPMERKING: Voer dit proces één monster tegelijk uit.</li>
	<li>Laat het monster 10 min bij RT zitten om de proteasecocktail de chorion te laten degraderen. Voeg vervolgens snel 450 μL van 5 M NaCl toe en sluit de buisdop(figuur 2E). Vortex de monsters voor 10 min. Om het proces te versnellen, stelt u de mixer in om meerdere monsters tegelijk te vortexen. OPMERKING: Voeg een kleine hoeveelheid (~ 100 μL) van een silicakraalmengsel (2 maten, 0,5 mm en 1 mm kraal) toe aan elke buis met embryo's ouder dan 24 pkf. In oudere embryo's blijft het notochord intact, ongeacht hoe lang ze gehomogeniseerd zijn.</li>
	<li>Na het homogeniseren gedurende 10 min, snel verwijderen 2 μL van gehomogeniseerde embryo supernatant en toe te voegen aan een gaschromatograaf flacon. Sluit de flacon snel af met de polytetrafluorethyleendop.</li>
</ol>6. Voorbereiding van media- en ethanolnormen
<ol><li>Om de medianormen voor te bereiden, verdunt u de media met een factor 10 met een 5 M NaCl/protease cocktailoplossing. Voeg 2 μL van elk monster toe aan een gaschromatograafflacon en afdichting met een polytetrafluorethyleendop.</li>
	<li>Om de ethanolnormen voor te bereiden, creëert u een seriële verdunning van 100% ethanol in 5 M NaCl/protease cocktailoplossing voor de volgende concentraties: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 en 40 mM. Voeg 2 μL van elke standaard toe aan een gaschromatograafflacon en afdichting met een polytetrafluorethyleendop.</li>
</ol>7. Voorbereiden van de hoofdruimte gaschromatograaf
OPMERKING: Deze instelling en het protocol moeten mogelijk worden gewijzigd, afhankelijk van de gebruikte gaschromatograaf. Hoofd ruimte gas chromatografie wordt gebruikt om ethanol niveaus te kwantificeren, niet voor scheiding.
<ol><li>Stel de verwarming voor de autosampler in op 58 °C en schakel in. Laat de kachel 58 °C bereiken en zet de lucht- en waterstofgasleidingen aan die de gaschromatograaf voeden (voor vlamionisatie die wordt gebruikt om de ethanol te kwantificeren). OPMERKING: De psi moet worden ingesteld om de chromatograaf goed te bedienen volgens de specificaties van de fabrikant. Zorg ervoor dat de heliumlijn aan staat en ingesteld op de juiste psi.</li>
	<li>Voor het septum, zorg ervoor dat het aantal monsters geïnjecteerd is niet >100. Voor de injectievezel moet u ervoor zorgen dat het aantal geïnjecteerde monsters niet >500 is. OPMERKING: Als een van beide is over de hoeveelheid injecties, zullen ze moeten worden gewijzigd voordat het uitvoeren van de test monsters.</li>
	<li>Schakel de analysesoftware in en zorg ervoor dat het werkstation goed is ingesteld. Bewaar alle gegevens volgens lab/afdelingsstandaarden. Maak een nieuwe voorbeeldlijst voor de uit te voeren monsters.</li>
	<li>Start de opstartmethode en wacht tot de vlamionisatiedetector stabiliseert voordat de monsters worden uitgevoerd. Eenmaal stabiel, voer de software opstarten methode om de vezel schoon te maken.</li>
</ol>8. Monstermetingen met behulp van hoofdruimtegaschromatografie
<ol><li>Zodra de opstartmethode is voltooid, maakt u 1 nieuwe regel per voorbeeld in de voorbeeldlijst. Uit het methodemenu in de analysesoftware, laad 436 Huidige spme ethanol 2013 3min absorberen 2_5min rg run. METH voor elk monster in de steekproeflijst.<ol>
<li>Vul de voorbeeldlijst in, te beginnen met de lucht, water, 5 M NaCl/protease cocktail blanks. Voer vervolgens in de normen in volgorde, van 0,3125 tot 40 mM. Volg de normen met een tweede ronde van de lucht, water en 5 M NaCl/protease cocktail blanks.</li>
		<li>Voer alle gehomogeniseerde embryo supernatant monsters worden getest, van de laagste tot hoogste voorspelde ethanol concentratie. Einde door het invoeren van een derde en laatste ronde van de lucht, water, en 5 M NaCl / protease cocktail blanks.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voeg de gaschromatograafflesjes toe aan de autosampler in de volgorde waarin de monsters zijn ingevoerd. Laat monsters 10-15 min opwarmen.</li>
	<li>Nadat alle monsters en de uiteindelijke spaties zijn uitgevoerd, activeert u de uitschakelmethode in de software door een definitief monster toe te voegen in de voorbeeldlijst en stand-by te werken. METH. Een back-up maken van alle gegevens die tijdens de steekproefworden verkregen. Schakel de apparatuur in de volgende volgorde uit: autosamplerkachel, waterstoftank en pas na de chromatograaftemperatuur 30 °C, de luchttank. Laat de heliumtank aan om de waskolom te behouden.</li>
</ol>9. Steekproef ethanol piek integratie en monster concentratie analyse
OPMERKING: Alle waarden vanaf 9,3 zijn berekend in een excelbestand dat alle vooraf ingevulde vergelijkingen hebben ingevuld.
<ol><li>Zodra de afsluitmethode is voltooid, klikt u op Chromatogram openen. Open de map met de resultaten. Monsters worden automatisch geïntegreerd in dit programma.</li>
	<li>Zorg er in de resultaten voor dat de juiste pieken zijn geïntegreerd (ethanolpieken tussen 2 en 2,5). Zodra alle monsters zijn bevestigd, print of exporteer t.a.v. de resultaten.</li>
	<li>Zet de piekhoogte van de ethanolnormen in een grafiek in. Bereken de helling, Y-onderschepping en R2-waarden voor de ethanolnormen (R2 moet >0,99) zijn. OPMERKING: Deze waarden worden gebruikt om de ethanolconcentratie van de monsterpiekhoogte te bepalen.</li>
	<li>Trek voor elk monster de piekhoogte van het monster af van de Y-onderschepping van de ethanolnormen. Verdeel deze waarde door de helling van de ethanolnormen om de ethanolwaarde voor elk monster in de GC-flesjes te verkrijgen.</li>
</ol><img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ03.jpg">
<ol start="5"><li>Om de ethanolconcentratie in de embryo's te berekenen, berekent u eerst de verdunningsfactor voor elk monster. Neem de volumemeting berekend in stap 2.3 van dit protocol en verdeel deze door de volumemeting plus 500 μL. Dit vertegenwoordigt de 5 M NaCl/protease cocktailoplossing die tijdens de embryoverwerking aan elk monster is toegevoegd (stappen 5.3 en 5.4).</li>
</ol><img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ04.jpg">
<ol start="6"><li>Vermenigvuldig met behulp van deze verdunningsfactor met de steekproef ethanolwaarde voor elk monster. De resultaten zullen in mM concentratie zijn. Bereken mediareferentiemonsters door de waarde van de media-ethanol te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor van 10.</li>
</ol><img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ05.jpg">
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/60766/60766equ06.jpg">

<ol><li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome%3A+a+prospective+national+surveillance+study%5BTitle%5D)+AND+%22Archive+of+Diseases+in+Childhood%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li>
<li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li>
<li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li>
<li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93(2014).</li>
<li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+%28PAE%29%3A+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li>
<li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+Alcohol+Consumption%3A+Studies+with+Mutant+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li>
<li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social%2C+cognitive+and+affective+behavioral+domains%3A+Insights+from+rodent+models%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li>
<li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li>
<li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067(2012).</li>
<li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li>
<li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse%3A+a+minireview%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology%2C+Biochemistry+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li>
<li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li>
<li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoSGenetics%22%5BJournal%5D)">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999(2012).</li>
<li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li>
<li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li>
<li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li>
<li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II%3A+microencephaly+and+neuronal+losses%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J. Jr, Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects%3A+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li>
<li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+%28nNOS%29+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research.+Developmental+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li>
<li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li>
<li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders%3A+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li>
<li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis%3A+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li>
<li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li>
<li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li>
<li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol%27s+molecular+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+Danio+%28Brachydanio%29+rerio%22">The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio</a>. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (1993).</li>
<li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li>
<li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li>
<li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemia+Medica%22%5BJournal%5D)">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li>
<li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+%28HS-GC-FID%29%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Testing+and+Analysis%22%5BJournal%5D)">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li>
<li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li>
<li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Analytical+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li>
<li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+methanol%2C+acetaldehyde%2C+acetone%2C+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Human+and+Experimental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li>
<li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142(2012).</li>
<li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li>
<li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats%3A+effects+of+dose+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li>
<li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Alcoholism%3A+Clinical+and+Experimental+Research%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology+and+Teratology%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin%2C+Fgf%2C+and+sonic+hedgehog+function%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Research+Part+A%3A+Clinical+and+Molecular+Teratology%22%5BJournal%5D)">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Als ontwikkelingsmodelsysteem zijn zebravissen bij uitstek geschikt om de impact van omgevingsfactoren op de ontwikkeling te bestuderen. Ze produceren grote aantallen extern bevruchte embryo's, die het mogelijk maakt voor nauwkeurige timing en dosering paradigma's in ethanol studies. Dit, gecombineerd met de live imaging mogelijkheden en de genetische en ontwikkelingsbescherming met de mens, maken zebravissen een krachtig modelsysteem voor teratologie studies. Beschreven is een protocol voor het meten van embryonale etha...

Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) beschrijven een breed scala aan neurologische stoornissen en craniofaciale dysmorfologieën geassocieerd met blootstelling aan embryonale ethanol1. Meerdere factoren, waaronder timing en dosering van blootstelling aan ethanol en genetische achtergrond, dragen bij aan de variatie van FASD2,3. Bij mensen maakt de complexe relatie van deze variabelen het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD uitdagend. Diermodellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit. Een breed scala van dier model systemen is gebruikt om meerdere aspecten van FASD studie en de resultaten zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in de blootstelling bij de mens4. Knaagdiermodelsystemen worden gebruikt om vele aspecten van de FASD te onderzoeken, waarbij muizen de meest voorkomende5,6,7zijn. Het merendeel van dit werk is gericht op ontwikkelingsfouten aan vroege blootstelling aan ethanol8, hoewel later blootstelling aan ethanol is aangetoond dat ontwikkelingsafwijkingen veroorzaken en9. Bovendien hebben de genetische vermogens van muizen sterk geholpen in ons vermogen om de genetische onderbouwing van FASD10,11te onderzoeken. Deze studies bij muizen suggereren sterk dat er gen-ethanol interacties met de sonische egel route, retinoïne zuur signalering, Superoxide dismutase, stikstofmonoxide synthase I, Aldh2 en Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Deze studies tonen aan dat diermodellen van cruciaal belang zijn voor het bevorderen van ons begrip van De FASD en de onderliggende mechanismen ervan.
De zebravis is ontstaan als een krachtig modelsysteem om vele aspecten van ethanol teratogenese te onderzoeken22,23. Vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische traktaaten en levende beeldvormingsmogelijkheden, zijn zebravis bij uitstek geschikt om factoren zoals timing, dosering en genetica van ethanolteratogenese te bestuderen. Ethanol kan worden toegediend aan precies geënsceneerde embryo's en de embryo's kunnen vervolgens worden afgebeeld om de directe impact van ethanol tijdens ontwikkelingsprocessen te onderzoeken. Dit werk kan rechtstreeks aan mensen worden verwant, omdat de genetische programma's van ontwikkeling hoogst behouden tussen zebravissen en mensen zijn en daarom kunnen helpen fasd menselijke studies24begeleiden. Terwijl zebravis zijn gebruikt om ethanol te onderzoeken, een gebrek aan consensus in de rapportage van embryonale ethanol concentraties maakt vergelijking met de mens moeilijk25. In zoogdiersystemen correleren de bloedalcoholniveaus rechtstreeks met weefselethanolniveaus26. Veel van de zebravisstudies behandelen embryo's vóór volledige vorming van hun bloedsomloop. Zonder moedermonster om te onderzoeken, is een proces om ethanolconcentraties te beoordelen nodig om ethanolniveaus in het embryo te kwantificeren. Hier beschrijven we een proces om ethanolconcentraties te kwantificeren in een zich ontwikkelend zebravisembryo met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.

<table><tbody><tr><td>Air</td><td></td><td></td><td>Geleverd door contract aan de universiteit</td></tr><tr><td>Analytische balans</td><td>VWR</td><td>10204-962</td><td></td></tr><tr><td>AutoSampler, CP-8400</td><td>Varian</td><td></td><td>Gaschromatograaf Autosampler</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>VWR</td><td>97062-590</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Gaschromatografie-vial met polytetrafluorethyleen/siliconen septum en plastic dop 2 mL</td><td>Agilent</td><td>8010-0198</td><td>Kan de vialen hergebruiken na reiniging, maar niet de doppen/septums</td></tr><tr><td>Gaschromatograaf, CP-3800</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Helium</td><td></td><td></td><td>Geleverd door contract aan de universiteit</td></tr><tr><td>HP Innowax capillaire kolom</td><td>Agilent</td><td>19095N-123I</td><td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &mu;m filmdikte</td></tr><tr><td>Hyrdogen</td><td></td><td></td><td>Geleverd door contract aan de universiteit</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat (heptahydraat)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugebuisje 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>2682002</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettipjes 10 &mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611106</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettipjes 1000 &mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611127</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettipjes 200 &mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>13611112</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen 100 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p1000L Micropipet</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p200L Micropipet</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman L p2L Micropipet</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>Polytetrafluorethyleen/siliconen septum en plastic dop</td><td>Agilent</td><td>5190-7021</td><td>Vervangende doppen/septums voor gaschromatografie-vialen</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat (dibasisch)</td><td>VWR</td><td>BDH9266-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>VWR</td><td>97062-916</td><td></td></tr><tr><td>Silica Beads.5 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079105z</td><td></td></tr><tr><td>Silica Beads 1,0 mm</td><td>Biospec Products</td><td>11079110z</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>VWR</td><td>BDH9280-500G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat (dibasisch)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>Solid-phase microextraction vezelassemblage Carboxen/Polydimethylsiloxaan</td><td>Millipore Sigma</td><td>57343-U</td><td>Vervangende vezels</td></tr><tr><td>Star Chromatography Workstation</td><td>Varian</td><td></td><td>Chromatografiesoftware</td></tr><tr><td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td><td>Millipore Sigma</td><td>23154</td><td>Vervangende inlaat-septums</td></tr></tbody></table>

kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Foetale Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschrijven een zeer variabel continuüm van ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsstoornissen, met inbegrip van gezichtsdysmorfologieën en neurologische stoornissen. Met een complexe pathologie treft FASD jaarlijks ongeveer 1 op de 100 kinderen die in de Verenigde Staten worden geboren. Door het zeer variabele karakter van FASD zijn diermodellen kritisch gebleken in ons huidige mechanistische begrip van door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten. Steeds meer laboratoria richten zich op het gebruik van zebravissen om door ethanol veroorzaakte ontwikkelingsfouten te onderzoeken. Zebravissen produceren grote aantallen extern bevruchte, genetisch hardnekkige, doorschijnende embryo's. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te controleren en de impact van blootstelling aan embryonale ethanol te kwantificeren door middel van live imaging technieken. Dit, gecombineerd met de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling met de mens, heeft bewezen dat zebravis een krachtig model is om de mechanistische basis van ethanolteratogeniteit te bestuderen. Echter, ethanol blootstelling regimes hebben gevarieerd tussen verschillende zebravissen studies, die de interpretatie van zebravissen gegevens over deze studies heeft verward. Hier is een protocol om ethanolconcentraties in zebravissenembryo's te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie.

Bloedethanol niveaus kunnen niet worden bepaald in de vroege embryonale zebravissen, omdat ze niet over een volledig gevormde bloedsomloop. Om het ethanolgehalte in de zebravisembryo's te bepalen, worden de ethanolniveaus rechtstreeks gemeten aan de andere dag van gehomogeniseerd embryonaal weefsel. Om de embryonale ethanolconcentraties goed te meten, moet rekening worden gehouden met het embryonale volume. Het embryo (dooier bevestigd) zit in de chorion (eierschaal) omgeven door extraembryonaal vocht (<strong class="xfi...

Dit werk beschrijft een protocol om ethanolniveaus in een embryo van zebravissen te kwantificeren met behulp van hoofdruimtegaschromatografie van de juiste blootstellingsmethoden voor embryoverwerking en ethanolanalyse.

Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Dit protocol is belangrijk omdat het helpt bij het begrijpen van de farmacokinetiek van ethanol bij het ontwikkelen van zebravisembryo's en dit zal helpen bij het standaardiseren van ethanolblootstellingsregimes in zebravisstudies. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat onderzoekers hierdoor snel en reproduceerbaar ethanolniveaus kunnen meten tijdens de embryonale ontwikkeling, met name in embryo's waar geen bloedtoevoer beschikbaar is. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op andere modelsystemen, evenals andere omgevingsfactoren uitgaande van de juiste techniek en apparatuur setup.Ik verwacht dat individuen die dit protocol voor het eerst uitvoeren, worstelen met de snelheid die nodig is om verdamping van ethanol tijdens embryoverwerking te voorkomen. Begin met het overbrengen van 10 embryo's met extra embryonale vloeistof in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen gemarkeerd met een lijn met een volume van 250 microliter. Voeg water toe aan de vullijn.Bereid extra microcentrifugebuizen voor gedechorioneerde monsters. Om het chorion te verwijderen, incubeer de embryo's in een 100 millimeter petrischaal met twee milligram per milliliter proteasecocktail in embryomedia gedurende 10 minuten. Draai de schotel voorzichtig om de paar minuten om de chorion te breken.Zodra alle embryo's vrij zijn van het chorion, verwijder ze uit de protease cocktail en was ze twee keer met verse media. Breng de embryo's vervolgens over naar een verse schaal van 100 millimeter. Wanneer alle monsters klaar zijn voor volumemeting, gebruikt u een P200-micropipet met de kleinst mogelijke punt om alle vloeistof voorzichtig uit de embryo's te verwijderen.Weeg het water met een schaal met minder dan 0,1 milligram precisie, dan bepalen het volume van de 10 embryo's door het gewicht van het verwijderde water af te trekken van 250 microliter. Om het volume van een enkel embryo te bepalen, verdeelt u het verschil door 10. Verzamel de embryo's uit de paringstanks en leg ze in een standaard petrischaal van 100 millimeter en broed de schaal vervolgens uit op 28,5 graden Celsius.Breng na zes uur bevruchting tot 100 embryo's over naar een nieuw gerecht met embryomedia en 1% ethanol of media alleen. Bedek maar om de petrischaaltjes niet te verzegelen en plaats ze 18 uur in een couveuse van 28,5 graden Celsius of tot ze 24 uur na de bevruchting zijn. Gebruik twee P200 micropipetten ingesteld op 50 microliters en aspirate de protease cocktail oplossing in een en water in de tweede.Plaats dan snel 10 embryo's in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met behulp van een glazen pipet en sluit de dop. Herhaal dit proces voor alle monsters worden getest, controles en ethanol behandelde embryo's. Werken met een monster tegelijk, snel open de dop en aspirate alle resterende embryo media met een P200 micropipet ingesteld op 200 microliters.Voeg snel maar voorzichtig de 50 microliter water toe en verwijder ze, voeg vervolgens de 50 microliter proteasecocktail toe en sluit de dop van de buis. Laat het monster 10 minuten op kamertemperatuur zitten en voeg dan snel 450 microliters van vijf molaire natriumchloride toe en sluit de dop van de buis. Homogeniseer het monster door 10 minuten te vortexen en breng twee microliter supernatant over naar een gaschromatografie flacon.Verzegel de flacon met een polytetrafluorethyleendop. Na het voltooien van de opstartmethode, laad 436 huidige SPME ethanol twee tot vijf minuten RG run. meth uit het methodenmenu in de analysesoftware voor elk voorbeeld op de voorbeeldlijst.Vul de monsterlijst in die begint met de lucht, het water en vijf molaire natriumchloride protease cocktail blanks. Voer dan in de ethanol normen in volgorde van 0,3125 tot 40 millimolar. Volg de normen met de tweede ronde van losse flodders.Voer alle gehomogeniseerde embryo-supernatantmonsters in die moeten worden getest van de laagste tot hoogste voorspelde ethanolconcentratie en eindig door een derde ronde losse flodders in te voeren. Voeg de gaschromatografie flacons toe aan de autosampler in de volgorde waarin de monsters zijn ingevoerd en laat ze 10 tot 15 minuten opwarmen. Start vervolgens het monster wordt uitgevoerd met behulp van de software.Nadat alle runs zijn voltooid, activeert u de afsluitmethode door een definitief voorbeeld toe te voegen aan de voorbeeldlijst en standby.meth uit te voeren. Een back-up maken van alle gegevens die tijdens de samplerun zijn verkregen. Zodra de afsluitmethode is voltooid, klikt u op het geopende chromatogram en opent u de map met de resultaten.Monsters worden automatisch geïntegreerd in dit programma. Zorg er in de resultaten voor dat de juiste pieken zijn geïntegreerd. Zodra alle monsters zijn bevestigd, drukt of exporteert u de resultaten.Plot de piekhoogte van de ethanolnormen op een grafiek en bereken vervolgens de hellings-, y-intercept- en r-kwadraatwaarden. Verkrijg de ethanolwaarde voor elk monster door de piekhoogte van het monster af te trekken van de y-intercept van de normen en deze waarde te delen door de helling van de normen. Om de ethanolconcentratie in de embryo's te berekenen, berekent u de verdunningsfactor voor elk monster en vermenigvuldigt u de waarde van de monster ethanol met deze verdunningsfactor.Bereken ten slotte referentiemonsters in de media door de media-ethanolwaarde te vermenigvuldigen met een verdunningsfactor van 10. Om de embryonale ethanolconcentraties goed te berekenen, werden de hoeveelheden embryo's in hun chorion en verwijderd uit hun chorion gemeten. In deze analyse bestond het embryo uit 56% van het totale volume in het chorion.Op basis van eerder gepubliceerd werk werd 73,6% gebruikt als embryonaal watergehalte voor alle gepresenteerde analyses. Dit resulteerde in water bestaande uit 0,82 microliter van de 1,1 microliter van embryonale volume. Van het totale watervolume zit 49% in het embryo en 51% in de extraembryonische vloeistof.Voor de gaschromatografieanalyse werden twee groepen van 15 monsters en de media waarmee ze werden behandeld vijf keer per groep geanalyseerd. Media-ethanolniveaus waren 143,6 millimolar voor groep één en 133,6 millimolar voor groep twee. De ethanolconcentraties van de embryo's bedroegen gemiddeld 63,5 millimolar en 53,1 millimolar voor respectievelijk de groepen één en twee.Voor elk monster werd een verhouding berekend tussen de concentratie embryonale ethanol en de medianiveaus ethanol. Groep één had 44% van de media-ethanolniveaus, terwijl de groep 40% van de ethanolniveaus in de media had. Onbehandelde controle embryo's werden gemeten bij nul millimolar media ethanol concentratie.Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is dat de verwerking van de embryo's voor GC-analyse goed is van cruciaal belang als ethanol is vluchtig en zal snel verdampen. De beste manier om deze stap uit te voeren wordt beschreven, maar het moet worden beoefend om een goede spier geheugen te ontwikkelen. Deze procedure zal helpen standaardiseren ethanol behandeling regimes in zebravissen en laat toekomstig werk om de genetische en cellulaire mechanismen van ethanal terratogeneiteit ontleden.

quantification-ethanol-levels-zebrafish-embryos-using-head-space-gas

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Om de moleculaire mechanismen van de ethanol-geïnduceerde ontwikkelingsschade begrijpen, hebben we een zebravis model van ethanol blootstelling en het verkennen van de fysieke, cellulaire en genetische veranderingen die optreden na blootstelling aan...

Het beoordelen van Teratogene Veranderingen in een zebravis model van foetale blootstelling aan alcohol

Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te...

Metabole Profiel Analyse van zebravis embryo&#39;s

This video demonstrates the use of headspace gas chromatography to determine the ethanol concentrations in zebrafish embryos. This method provides a useful tool for qualitative and quantitative analysis of volatile organic compounds.

Headspace Gas Chromatography: A Technique to Assess Ethanol Concentration in Zebrafish Embryos

Een nieuwe methode voor het verminderen van variabiliteit bij het blootstellen van vissen aan geneesmiddelen wordt uitgelegd. Vissen die werden blootgesteld aan verschillende patronen van ethanolblootstelling bleken veranderde angstniveaus te hebben tijdens ontwenning in een licht/donker scototaxisch onderzoek.

Een nieuwe methode van de Drug aan Multiple zebravis ( Danio rerio) En de kwantificering van Terugtrekking

Aanhoudende fibrose met afzetting van overmatige extracellulaire matrix-eiwitten leidt tot cirrose. Alcoholmisbruik is een van de belangrijkste oorzaken van ernstige leverziekten. We hebben een ethanol-geïnduceerde zebravis model van een fibrotische lever opgezet om de mechanismen en strategieën van het bevorderen van hepatocytenregeneratie bij alcohol-geïnduceerde schade te bestuderen.

Ontwikkeling van een ethanol-geïnduceerde fibrotische lever Model in zebravis om te studeren Progenitor Cell-gemedieerde Hepatocyt Regeneration

Dit protocol beschrijft histologische analyses van de levers van zebravislarven die 24 uur met 2% ethanol zijn behandeld. Een dergelijke acute ethanolbehandeling resulteert in hepatische steatosis en zwelling van de hepatische vasculatuur.

Histologische analyses van acute alcoholische leverbeschadiging bij zebravis

Genbewerkingstechnologieën hebben onderzoekers in staat gesteld om zebravissen mutanten te genereren om de genfunctie relatief eenvoudig te onderzoeken. Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van parallelle embryogenotypering en kwantificering van in situ hybridisatiesignalen bij zebravissen. Deze onbevooroordeelde aanpak zorgt voor een grotere nauwkeurigheid in fenotypische analyses op basis van in situ hybridisatie.

Genotyping en kwantificering van In Situ Hybridization Kleuring in Zebrafish

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Het doel van het huidige protocol is om de stappen te schetsen die nodig zijn om een sociale voorkeurstest voor volwassen zebravissen op te zetten en te gebruiken en aan te tonen dat deze kan worden gebruikt om door ethanol geïnduceerde sociale defecten te karakteriseren.

Modellering van foetale alcoholspectrumstoornissen bij zebravissen om de impact van een ongunstige embryonale omgeving op het sociale gedrag van volwassenen te karakteriseren

Hier presenteren we een methode voor het uitlijnen en cryosectieren van meerdere zebravislarvenmonsters (Danio rerio) en het verzamelen ervan op een enkel glaasje voor ruimtelijke transcriptomische analyse.

Ruimtelijk compacte opstelling van larvale zebravissecties voor ruimtelijke transcriptomische analyse

We ontwikkelden een aangepaste QuEChERS-HPLC-methode om de interne niveaus van 16 PAK's in zebravisembryo's te beoordelen.

Een gemodificeerde QuEChERS-HPLC-methode voor de detectie van polycyclische aromatische koolwaterstoffen in zebravisembryo's die zijn blootgesteld aan fijnstof

Leer hoe u ethanol niveaus kwantificeert in zebravis embryo's met head space gaschromatografie. Deze methode maakt snelle, reproduceerbare metingen mogelijk voor toxicologisch onderzoek naar ontwikkeling.

Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Meer video's verkennen