Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Dit protocol is belangrijk omdat het helpt bij het begrijpen van de farmacokinetiek van ethanol bij het ontwikkelen van zebravisembryo's en dit zal helpen bij het standaardiseren van ethanolblootstellingsregimes in zebravisstudies. Het belangrijkste voordeel van onze techniek is dat onderzoekers hierdoor snel en reproduceerbaar ethanolniveaus kunnen meten tijdens de embryonale ontwikkeling, met name in embryo's waar geen bloedtoevoer beschikbaar is. Deze methode kan gemakkelijk worden toegepast op andere modelsystemen, evenals andere omgevingsfactoren uitgaande van de juiste techniek en apparatuur setup.

Ik verwacht dat individuen die dit protocol voor het eerst uitvoeren, worstelen met de snelheid die nodig is om verdamping van ethanol tijdens embryoverwerking te voorkomen. Begin met het overbrengen van 10 embryo's met extra embryonale vloeistof in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen gemarkeerd met een lijn met een volume van 250 microliter. Voeg water toe aan de vullijn.

Bereid extra microcentrifugebuizen voor gedechorioneerde monsters. Om het chorion te verwijderen, incubeer de embryo's in een 100 millimeter petrischaal met twee milligram per milliliter proteasecocktail in embryomedia gedurende 10 minuten. Draai de schotel voorzichtig om de paar minuten om de chorion te breken.

Zodra alle embryo's vrij zijn van het chorion, verwijder ze uit de protease cocktail en was ze twee keer met verse media. Breng de embryo's vervolgens over naar een verse schaal van 100 millimeter. Wanneer alle monsters klaar zijn voor volumemeting, gebruikt u een P200-micropipet met de kleinst mogelijke punt om alle vloeistof voorzichtig uit de embryo's te verwijderen.

Weeg het water met een schaal met minder dan 0,1 milligram precisie, dan bepalen het volume van de 10 embryo's door het gewicht van het verwijderde water af te trekken van 250 microliter. Om het volume van een enkel embryo te bepalen, verdeelt u het verschil door 10. Verzamel de embryo's uit de paringstanks en leg ze in een standaard petrischaal van 100 millimeter en broed de schaal vervolgens uit op 28,5 graden Celsius.

Breng na zes uur bevruchting tot 100 embryo's over naar een nieuw gerecht met embryomedia en 1% ethanol of media alleen. Bedek maar om de petrischaaltjes niet te verzegelen en plaats ze 18 uur in een couveuse van 28,5 graden Celsius of tot ze 24 uur na de bevruchting zijn. Gebruik twee P200 micropipetten ingesteld op 50 microliters en aspirate de protease cocktail oplossing in een en water in de tweede.

Plaats dan snel 10 embryo's in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met behulp van een glazen pipet en sluit de dop. Herhaal dit proces voor alle monsters worden getest, controles en ethanol behandelde embryo's. Werken met een monster tegelijk, snel open de dop en aspirate alle resterende embryo media met een P200 micropipet ingesteld op 200 microliters.

Voeg snel maar voorzichtig de 50 microliter water toe en verwijder ze, voeg vervolgens de 50 microliter proteasecocktail toe en sluit de dop van de buis. Laat het monster 10 minuten op kamertemperatuur zitten en voeg dan snel 450 microliters van vijf molaire natriumchloride toe en sluit de dop van de buis. Homogeniseer het monster door 10 minuten te vortexen en breng twee microliter supernatant over naar een gaschromatografie flacon.

Verzegel de flacon met een polytetrafluorethyleendop. Na het voltooien van de opstartmethode, laad 436 huidige SPME ethanol twee tot vijf minuten RG run. meth uit het methodenmenu in de analysesoftware voor elk voorbeeld op de voorbeeldlijst.

Vul de monsterlijst in die begint met de lucht, het water en vijf molaire natriumchloride protease cocktail blanks. Voer dan in de ethanol normen in volgorde van 0,3125 tot 40 millimolar. Volg de normen met de tweede ronde van losse flodders.

Voer alle gehomogeniseerde embryo-supernatantmonsters in die moeten worden getest van de laagste tot hoogste voorspelde ethanolconcentratie en eindig door een derde ronde losse flodders in te voeren. Voeg de gaschromatografie flacons toe aan de autosampler in de volgorde waarin de monsters zijn ingevoerd en laat ze 10 tot 15 minuten opwarmen. Start vervolgens het monster wordt uitgevoerd met behulp van de software.

Nadat alle runs zijn voltooid, activeert u de afsluitmethode door een definitief voorbeeld toe te voegen aan de voorbeeldlijst en standby.meth uit te voeren. Een back-up maken van alle gegevens die tijdens de samplerun zijn verkregen. Zodra de afsluitmethode is voltooid, klikt u op het geopende chromatogram en opent u de map met de resultaten.

Monsters worden automatisch geïntegreerd in dit programma. Zorg er in de resultaten voor dat de juiste pieken zijn geïntegreerd. Zodra alle monsters zijn bevestigd, drukt of exporteert u de resultaten.

Plot de piekhoogte van de ethanolnormen op een grafiek en bereken vervolgens de hellings-, y-intercept- en r-kwadraatwaarden. Verkrijg de ethanolwaarde voor elk monster door de piekhoogte van het monster af te trekken van de y-intercept van de normen en deze waarde te delen door de helling van de normen. Om de ethanolconcentratie in de embryo's te berekenen, berekent u de verdunningsfactor voor elk monster en vermenigvuldigt u de waarde van de monster ethanol met deze verdunningsfactor.

Bereken ten slotte referentiemonsters in de media door de media-ethanolwaarde te vermenigvuldigen met een verdunningsfactor van 10. Om de embryonale ethanolconcentraties goed te berekenen, werden de hoeveelheden embryo's in hun chorion en verwijderd uit hun chorion gemeten. In deze analyse bestond het embryo uit 56% van het totale volume in het chorion.

Op basis van eerder gepubliceerd werk werd 73,6% gebruikt als embryonaal watergehalte voor alle gepresenteerde analyses. Dit resulteerde in water bestaande uit 0,82 microliter van de 1,1 microliter van embryonale volume. Van het totale watervolume zit 49% in het embryo en 51% in de extraembryonische vloeistof.

Voor de gaschromatografieanalyse werden twee groepen van 15 monsters en de media waarmee ze werden behandeld vijf keer per groep geanalyseerd. Media-ethanolniveaus waren 143,6 millimolar voor groep één en 133,6 millimolar voor groep twee. De ethanolconcentraties van de embryo's bedroegen gemiddeld 63,5 millimolar en 53,1 millimolar voor respectievelijk de groepen één en twee.

Voor elk monster werd een verhouding berekend tussen de concentratie embryonale ethanol en de medianiveaus ethanol. Groep één had 44% van de media-ethanolniveaus, terwijl de groep 40% van de ethanolniveaus in de media had. Onbehandelde controle embryo's werden gemeten bij nul millimolar media ethanol concentratie.

Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is dat de verwerking van de embryo's voor GC-analyse goed is van cruciaal belang als ethanol is vluchtig en zal snel verdampen. De beste manier om deze stap uit te voeren wordt beschreven, maar het moet worden beoefend om een goede spier geheugen te ontwikkelen. Deze procedure zal helpen standaardiseren ethanol behandeling regimes in zebravissen en laat toekomstig werk om de genetische en cellulaire mechanismen van ethanal terratogeneiteit ontleden.