Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells
8 februari 2020
Hier presenteren we een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabelde dextran in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Daarnaast kan dextrans van 3-10 kDa worden gebruikt om endocytose in haar en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti te bestuderen.
Het algemene doel van dit protocol is het bestuderen van de opname van regelmatige dextran fluorescently gelabeld met Texas Red in levende haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de drie kilodalton Texas Red dextran kan worden gebruikt om mechanotransducductiekanaalfunctie in levende haarcellen te beoordelen. Om het slakkenhuis te oogsten, plaatst u de schedel van een postnatale dag zes muis in een 60 millimeter kweekschotel met Leibovitz's L-15-medium en gebruik een chirurgische schaar om een oppervlakkige snede te maken van het voorste uiteinde van het achterste uiteinde van de schedel en over de externe gehoorkanalen.
Vouw de huid naar de neus om de schedel bloot te stellen en maak een incisie van de achterkant naar de voorkant van de schedel en over de ooglijn. Scheid de schedel in twee helften en gebruik een kleine spatel om de hersenen te verwijderen. Wanneer de temporele botten kunnen worden waargenomen, gebruik kleine schaar te snijden rond deze botten om het weefsel accijns.
Dompel de tijdelijke botten onder in de 35 millimeter schotel met verse L-15 medium en plaats de schotel onder een stereo microscoop uitgerust met een breed veld oculair en een externe wisselstroom halogeen lichtbron. Gebruik tangen om het omringende cochleair weefsel, halfronde kanalen en vestibulaire organen te verwijderen. Zodra het slakkena is ontleed en geplaatst in een nieuwe schotel met verse L-15 media, gebruik chirurgische tangen om een steekwond op het ronde raam en een punctie op de apicale cochleair regio te maken.
Wanneer alle slakkenplaat zijn geoogst, plaatst u het weefsel in een put van een negen-goed glasdepressieplaat met 200 microliters van vers L-15-medium. Voor dextran etikettering van de geïsoleerde weefsels, vervang het medium van elk monster goed met 200 microliters van verse L-15 medium aangevuld met twee milligram per milliliter van de fluorescentie geconjugeerde dextran van belang. Broed de monsters twee uur lang bij kamertemperatuur en 25 rotaties per minuut in een driedimensionale shaker in een gekantelde hoek van 25 graden beschermd tegen licht.
Aan het einde van de incubatie, was de weefsels een keer met medium en een keer met HBSS gedurende twee minuten per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, bevestig de exemplaren in 4%paraformaldehyde gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door twee snelle en zachte wasbeurten in HBSS. Gebruik na de tweede wasbeurt fijne tipkrachten om het cochleair bot, het spiraalvormige ligament en het tectorial membraan te verwijderen en het geïsoleerde orgaan van Corti in HBSS te wassen.
Wees extra voorzichtig bij het verwijderen van het transparante tectorial membraan, omdat het weefsel op de haarcellen gemakkelijk kan worden beschadigd tijdens deze stap. Om de F-actine te labelen, permeabiliseren de monsters in 0,5%Triton X-100 in PBS aangevuld met 100 tot 200 verdunning van fluorescerend gelabeld phalloidine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de weefsels twee tot drie keer in verse HBSS per wasbeurt, zoals aangetoond, gevolgd door een enkele wasbeurt in PBS.
Gebruik een geschikte montage-medium om het orgaan van Corti weefsels monteren op glazen microscoop dia's haar stereocilia zijden omhoog en beeld van de monsters op een fluorescerende confocale microscoop met behulp van de 63X olie onderdompeling doelstelling. Na een twee uur durende incubatie met drie kilodalton dextran fluorescerend geconjugeerd met Texas Red, orgel van Corti explant van wilde type postnatale dag zes muizen tonen een robuuste en specifieke etikettering van zowel binnen-en buitenste haarcellen. Beeldvorming van de haarcelstereciën en cellichamen blijkt dat alleen die cellen die drie kilodalton dextran Texas Red in hun cellichaam hebben opgenomen, ook fluorescerende etikettering van hun stereocilia hebben aangetoond.
Belangrijk is dat een uniform tl-signaal wordt waargenomen langs de stereocilia met verrijking aan de uiteinden van de kortere stereocilia rijen waar het mechanotransductiekanaal zich bevindt. Vesicle-achtige structuren in het cellichaam van de haarcellen en de naburige ondersteunende cellen worden ook waargenomen suggereert dat dextran Texas Red kan ook worden opgenomen door endocytose. Grotere 10 kilodalton dextrans produceerde ook een blaas-achtig patroon in het cellichaam van haarcellen en ondersteunende cellen.
Met name de aanwezigheid van een calciumchelator of mechanotransducductie kanaal blokkers voorkomt stereocilia etikettering en de opname van drie kilodalton dextran Texas Red in haarcellen. Het vesicle-achtige patroon wordt echter nog steeds waargenomen in aanwezigheid van mechanotransducductiekanaalblokkade, wat aangeeft dat dit patroon van opname onafhankelijk is van functionele MET-kanalen. Het is zeer belangrijk om het orgaan van Corti-weefsel zorgvuldig te ontleden en de juiste oriëntatie van de haarcellen te bevestigen voordat het weefsel wordt gemonteerd voor beeldvorming.
Na dextran etikettering van levende en functionele haarcellen, immunostaining van het vaste weefsel kan worden uitgevoerd om specifieke celsoorten van het belang te identificeren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabeld dextraan in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Deze techniek maakt het mogelijk om de functie van mechanotransductiekanalen in levende haarcellen te beoordelen.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Auditief onderzoek
Achtergrond
- Het begrijpen van mechanotransductie in auditieve haarcellen is essentieel voor de gehoorfunctie.
- Dextranen van verschillende groottes kunnen worden gebruikt om cellulaire processen zoals endocytose te bestuderen.
- Het Corti-orgaan is een sleutelstructuur in het slakkenhuis die betrokken is bij het gehoor.
- Fluorescente labeling helpt bij het visualiseren van cellulaire opnameprocessen.
Doel van de studie
- Om de opname van Texas Red-gelabeld dextran in levende auditieve haarcellen te visualiseren.
- Om de functionaliteit van mechanotransductiekanalen in deze cellen te beoordelen.
- Om het gebruik van dextranen voor het bestuderen van endocytose in haarcellen en ondersteunende cellen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van de cochlea van muizen op postnatal dag zes.
- Het gebruik van chirurgische technieken om de cochleaire structuren bloot te leggen.
- Het aanbrengen van Texas Red-gelabelde dextran op de auditieve haarcellen.
- Het visualiseren van de opname met behulp van fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle visualisatie van dextraan-opname in levende haarcellen.
- Aantoonde functionaliteit van mechanotransductiekanalen.
- Inzichten verschaffen in endocytosemechanismen in het Corti-orgaan.
- Het vaststellen van een betrouwbare methode voor het bestuderen van de biologie van auditieve cellen.
Conclusies
- De methode visualiseert effectief de opname van dextran in auditieve haarcellen.
- Deze aanpak kan het begrip van mechanotransductie bij het gehoor verbeteren.
- Toekomstige studies kunnen voortbouwen op deze techniek om aanverwante cellulaire processen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het beoordelen van de functie van mechanotransductiekanalen in levende auditieve haarcellen is cruciaal voor de validatie van targets in therapeutica voor gehoorverlies. Deze methode biedt een directe, kwantitatieve weergave van de kanaalactiviteit via de opname van fluorescerende dextranen, waardoor mechanistische risicoreductie mogelijk wordt voor targets die betrokken zijn bij sensorische transductie. De aanpak ondersteunt het voorspellend vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door moleculaire functie te koppelen aan het cellulaire fenotype in een ziekterellevant systeem.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door direct de functionele activiteit van mechanotransductiekanalen in levende haarcellen te meten.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie van targets mogelijk via een robuuste, op imaging gebaseerde assay voor kanaalfunctie.
- Predictieve waarde: Ondersteunt portfolio-triage door verbindingen die de MET-kanaalfunctie behouden of moduleren te onderscheiden van verbindingen die dat niet doen.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream compound screening door MET-afhankelijke dextran-opname te bevestigen als functionele biomarker.
- Kwantitatieve output: Genereert meetbare fluorescentiesignalen in stereocilia en het cellichaam die correleren met de kanaalactiviteit en over monsters heen kunnen worden genormaliseerd.
- Schaalbaarheid & Hergebruik: Ondersteunt platformadaptatie voor high-content analyse van de kinetiek van kleurstofopname in explantaten van het organ of Corti.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ziekterelatie: Maakt gebruik van postnatale muizen-explantaten van het Corti-orgaan als een ziekterevante systeem om de functie van auditieve haarcellen te bestuderen.
- Translationele Continuïteit: Slaat een brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische validatie door een consistente MET-activiteitsmeting te bieden over verschillende experimentele fasen heen.
- Risico-gecorrigeerde Vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door verbindingen te identificeren die de opname van dextraan verstoren via blokkade van het MET-kanaal.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van hypothesetoetsing van targets tot lead-identificatie, waarbij de functionele validatie van mechanotransductiekanalen voorafgaat aan de screening en optimalisatie van verbindingen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door een directe read-out te bieden van de MET-kanaalafhankelijke cellulaire opname in haarcellen.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde dextran-labelingsprotocollen die reproduceerbare, kwantitatieve fluorescentie-outputs opleveren in stereocilia en het cellichaam.
- Analytiek: Levert meetbare afhankelijke variabelen (fluorescentie-intensiteit in stereocilia-rijen en blaasjesachtige patronen) die vergelijking van experimentele condities en compound-effecten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan op de preklinische continuïteit door dezelfde MET-activiteitsread-out te gebruiken om target engagement in ziektemodellen te evalueren.
- Herbruikbaarheid binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare capaciteit voor het beoordelen van de sensorische transductiefunctie in diverse auditieve onderzoeksprogramma's.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Biedt voorspellende zekerheid bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in de analyse van mechanotransductiepaden te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid door gedefinieerde parameters voor incubatie, wassen en imaging van dextranopname.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming door targetmodulatie te koppelen aan functionele read-outs van haarcellen, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van hun effect op MET-afhankelijke dextranopname in een ziekterelevant systeem.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in muis-slakkenhuisdissectie, isolatie van het Corti-orgaan en fluorescentiemicroscopie.
- Afhankelijk van confocale beeldvormingsinfrastructuur met geschikte laser- en detectie-instellingen voor Texas Red-fluorescentie.
- Noodzaak tot standaardisatie van dextranconcentratie, incubatietijd en schudcondities tussen laboratoria.
- Omvat overwegingen voor aanpassing bij het toepassen van de methode op verschillende zoogdiermodellen of ontwikkelingsstadia.
- Beperkt door de noodzaak van preparatie van levend weefsel en de gevoeligheid van haarcellen voor mechanische en omgevingsstress tijdens de dissectie.
