Voorbereiding van perifere bloedmononucleaire celkorrels en plasma uit een enkele bloedafname op klinische proeflocaties voor biomarkeranalyse

PBMC- en plasmamonsters zijn eenvoudig te verkrijgen en zeer informatief in de vroege klinische ontwikkeling. Dit robuuste protocol minimaliseert de pre-analytische variabiliteit die op klinische locaties wordt geïntroduceerd. Dit protocol is snel en eenvoudig en vereist basislabapparatuur en minimale expertise van de operator om het bloed te verwerken tot PBMC's en plasma.

Het is compatibel met drukke labdagen in ziekenhuizen. Downstream-analyse van bloedbestanddelen die voortvloeien uit dit protocol kan farmacokinetische en farmacodynamische relaties, medicijndosisplanning en bewijs van doelbetrokkenheid informeren en inzicht geven in de werkingsmechanismen van geneesmiddelen, die zowel realtime als introspectieve analyse ondersteunen. We gebruiken dit protocol voor oncologiestudies, specifiek om DNA-schaderesponsmechanismen te analyseren.

Materialen die door dit protocol worden verzameld, kunnen echter relevant zijn in veel ziektegebieden en meerdere therapeutische modaliteiten. Nadat u acht milliliter donorbloed per monster hebt ontvangen, registreert u het tijdstip waarop het bloed is afgenomen en keert u elke buis acht tot 10 keer voorzichtig om voordat u de met anticoagulantia behandelde bloedmonsters overbrengt in elk van de buizen die zijn gelabeld voor straling. Voor klinische monsters centrifugeert u de buizen direct na het omkeren ervan.

Plaats de 0,2 grijze buizen in een voorverwarmde röntgenkast, sluit de deur en breng een 0,2 grijze dosis aan op de buizen. Vervang de doorstraalde buizen met een lage dosis door de zeven grijze buizen en pas de dosis aan om een zevengrijze stralingsdosis toe te passen op de bestralingsmonsters met hoge dosis. Nadat beide monsters zijn bestraald, incubeer je alle drie de buizen gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Breng de monsters over in celvoorbereidingsbuizen voordat u de cellen scheidt met een snelle centrifugeer, waarbij u ervoor zorgt dat de eenheden worden ingesteld op x g of gelijkwaardige RCF. Bekijk na de centrifugering de buizen tegen een donkere achtergrond om de plasma-, rode bloedcel- en buffylaaglagen te identificeren. Breng met behulp van een serologische pipet ongeveer de helft van het plasma over in een gelabelde conische centrifuge van 15 milliliter zonder de buffylaaglaag te verstoren en bewaar de buis plasma op nat ijs.

Gebruik vervolgens een pasture pipet om de volledige PBMC met buffy coatlaag over te brengen in een nieuwe buis van 15 milliliter en voeg PBS op kamertemperatuur toe aan de PBMC tot een eindvolume van 15 milliliter per monster. Meng de cellen voorzichtig vijf keer door inversie en verzamel de cellen door centrifugeren met een lagere snelheid, zorg ervoor dat u de centrifugeereenheden controleert. Aspireer alles behalve de laatste 500 microliter supernatant zonder de pellets te verstoren.

Voeg verse PBS toe aan een eindvolume van 10 milliliter aan elke buis en resuspend door de buizen voorzichtig om te keren. Gebruik 40 microliter aliquots van de cellen om te tellen. Verzamel na het tellen de cellen met nog een centrifugeermiddel en verwijder zoveel mogelijk supernatant zonder de pellets te verstoren.

Om de PBMC op te slaan voor latere verwerking, resuspendeer de pellets in 50 microliter verse PBS per monster met zachte pipetting en breng elke volledige celsuspensie over in een gelabelde cryovial van 1,5 milliliter op nat ijs. Flash vriest vervolgens de cellen in volgens de gewenste methode en plaatst ze in een vriesbox op min 80 graden. Noteer het tijdstip waarop de cellen zijn bevroren.

Als alternatief moeten de pellets in één milliliter of vriesmengsel per monster worden geresuspendeerd en worden de celsuspensusingen overgedragen aan individuele cryovials met het etiket. Plaats vervolgens de buizen en voorgekoelde vriesdozen voor min 80 graden Celsius opslag. Om het plasma in te vriezen, voegt u tot één milliliter aliquots veel van het plasma toe tot elk van vijf microbuisjes van twee milliliter zonder de resterende pellet te verstoren en registreert u het totale plasmavolume in elke buis.

Vries vervolgens onmiddellijk de plasma aliquots rechtop in een vriezer van min 80 graden Celsius. Voor de westerse vlekanalyse van de monsters moet de pellet in elke buis worden geresuspeneerd met een geschikt volume lysisbuffer aangevuld met protease- en fosfataseremmers die gelijk zijn aan dat van het celpelletvolume met zachte pipetatie en de celmonsters gedurende 10 minuten op ijs incuberen. Breng aan het einde van de incubatie de monsters over naar buizen van 1,5 milliliter en soniceer ze met drie 30 seconden op 30 seconden van cycli bij vier graden Celsius.

Verzamel de monsters door middel van centrifugeren en breng de supernatanten over naar nieuwe buizen van 1,5 milliliter. Meng vervolgens 40 microgram per monster met de laadbuffer en kook de monsters gedurende vijf minuten. Laad 20 microgram van elk monster per baan in tweevoud in een 4-12%Bis-Tris eiwitgel en voer een SDS-PAGE uit.

Het aantal cellen dat wordt verkregen uit acht milliliter bloed varieert afhankelijk van de patiënt en de ziekte-instelling. Over het algemeen is de celkorrel klein van formaat en transparant wit van kleur. Soms kunnen de pellets wat rode bloedcelbesmetting hebben, wat een negatief effect heeft op de kwaliteit van het preparaat.

Een typische opbrengst van een chronische lymfatische leukemiepatiënt die dit protocol gebruikt, varieert van 1,62 keer 10 tot de vierde tot 1,99 keer 10 tot de negende cellen per acht milliliter mononucleair celpreparaat met een uiteindelijke eiwitconcentratie variërend van 1,62 tot 19,77 milligram per milliliter. In deze representatieve analyse van drie patiëntenmonsters werd een toename van post-translationele modificaties waargenomen bij hogere ioniserende stralingsdoses. Interessant is dat de fosforylering van ataxie-telangiectasia gemuteerd en RAD50 aanzienlijk was bij de lage dosis van 0,2 grijstinten, wat suggereert dat deze post-translationele modificaties mogelijk kunnen worden ondervraagd als farmacodynamische biomarkers voor behandelingen waarbij DNA-dubbele strengbreuken worden gemaakt met een goed dynamisch bereik in tumor, evenals perifere bloedmonsters.

Voor een optimale monstervoorbereiding, verwerk het bloed binnen een uur na het verzamelen bij kamertemperatuur, centrifugeer de monsters correct en bekijk de buis tegen de donkere achtergrond om de buffy coat te kunnen onderscheiden.