Aantonen van een lineaire relatie tussen vasculaire endotheliale groei factor en luteïniserend hormoon in nier schors extracten
22 januari 2020
Hier gepresenteerd is een protocol voor het gebruik van een corticale nier extract voorbereiding en totale eiwit normalisatie om de correlatie tussen vasculaire endotheliale groeifactor en luteïniserend hormoon in de nier van zoogdieren demonstreren.
Ons protocol merkt op dat het gebruik van nierextracten van koeien en varkens een uitstekende en economische hulpbron is voor de studie van nierfysiologie, met name het onderzoeken van de correlatie tussen vasculaire endotheelgroeifactor en andere analyten. Het is altijd een uitdaging geweest om VEGF, een essentiële groeifactor in orgaan angiogenese, te correleren met andere eiwitten. Deze techniek stelt ons in staat om de associatie tussen VEGF en analyten zoals hormonen te onderzoeken.
Dit zal zeker onze kennisbasis ten aanzien van deze belangrijke groeifactor bevorderen. Deze methode kan nuttig zijn voor het correleren van andere analyten in niercorticale extracten naast de in deze video genoemde. Visuele demonstratie zal anderen helpen om reproduceerbare resultaten te verkrijgen zonder enige steekproef fouten.
Het gebruik van vers weefsel is essentieel voor het succes van deze techniek. Het is belangrijk om direct na het slachten verse hele nieren van een dier te verkrijgen. Breng het weefsel altijd over naar het laboratorium op ijs.
Gebruik steriele schaar, tangen, een mes, en petrischaaltjes om nieren te ontleden en accijns het vereiste weefselgedeelte. Snijd de nier voorzichtig doormidden langs het sagittale vlak en snijd een stuk weefsel uit het cortexgebied in het midden van de nier. Hak het weefsel in kleine stukjes met het mes en breng het in een microfuge buis met een milliliter ijskoude 1X RIPA lyse extractie buffer.
Label de buis met specifieke monsterdetails en leg deze op ijs. Gebruik een handheld homogenisator met een steriele sonde om het weefsel gedurende één tot twee minuten te homogeniseren totdat er geen brokken zichtbaar zijn, en hydrateer de buis onmiddellijk op 9, 600 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Bereid na centrifugatie afzonderlijke aliquots van het monster voor ELISA en totale eiwitanalyse om meervoudige vries-/dooicycli te voorkomen.
Voordat u met de test begint, brengt u alle reagentia en de testplaat op kamertemperatuur om de overtollige putten te verwijderen en ze bij vier graden Celsius op te slaan tot verder gebruik. Verdun de 20X wasbuffer tot 300 milliliter met dubbel gedestilleerd water en zet de lege putten zonder enige oplossing. Voeg 50 microliter standaard of monster en nog eens 50 microliters mierikswortel peroxidase conjugaat toe aan elke put, voeg dan onmiddellijk 50 microliters antilichaamoplossing toe aan elke put en verzegel de plaat.
Meng de plaat en broed het op 37 graden Celsius gedurende een uur. Na de incubatie, was elke put met 200 microliters van wasbuffer. Voeg 50 microliter substraat A en substraat B toe aan elke put, meng de plaat voorzichtig door op de zijkant te tikken en sluit het vervolgens 15 minuten af in het donker bij 37 graden Celsius.
Voeg 50 microliter stopoplossing toe aan elke put. Tik voorzichtig op de plaat en lees de absorptie op 450 nanometer met een spectrofotometer. Bereid de reagentia en was buffer zoals eerder beschreven, voeg dan 100 microliter van standaard of monster aan elke put, verzegel de plaat, meng goed, en uitbroed het gedurende twee uur op 37 graden Celsius.
Verwijder de vloeistof in elke put en voeg 100 microliter van detectie reagens A.Seal de plaat en uitbroed het voor nog een uur. Vervolgens was je elke put met 400 microliters wasbuffer, voeg dan 90 microliter substraatoplossing toe aan elke put, tik voorzichtig op de plaat en broed het nog een uur uit bij 37 graden Celsius. Voeg na de laatste incubatie 50 microliter stopoplossing toe aan elke put, tik voorzichtig op de plaat en lees de absorptie op 450 nanometer met een spectrofotometer.
Schat het totale eiwit van de runder- en varkensnierextracten met een standaard BSA-test en gebruik deze schatting om de LH- en VEGF-A-ELISA-resultaten te normaliseren. De gemiddelde en mediane niveaus van LH en VEGF werden berekend voor zowel dieren als geslachten. Na het verifiëren van de normaliteit van gegevens werden lineaire regressiemodellen gebruikt om de relatie tussen LH en VEGF te onderzoeken.
LH bleek een sterke en significante voorspeller van VEGF te zijn in zowel runder- als varkensnieren. Bij het proberen van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om identieke gebieden in elk weefsel monster. Een soortgelijke procedure kan worden gebruikt om elk type weefsel te extraheren.
Vergeet niet om analyten te normaliseren door het totale eiwitextract van welk weefsel je ook gebruikt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol demonstreert de correlatie tussen vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en luteïniserend hormoon (LH) in nierextracten van zoogdieren met behulp van een gestandaardiseerde methode. De studie maakt gebruik van corticale nierextracten van koeien en varkens om het begrip van de renale fysiologie en eiwitinteracties te vergroten.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Nierfysiologie
- Groeifactoranalyse
- Eiwitnormalisatietechnieken
Achtergrond
- De associatie van VEGF met andere eiwitten was in eerdere studies een uitdaging.
- Het belang van het gebruik van vers nierweefsel voor nauwkeurige resultaten.
- De vooruitgang in methoden maakt een betere reproduceerbaarheid in biologische assays mogelijk.
Gebruikte methoden
- Gebruik van nierextracten van koeien en varkens voor proteïne-assays
- ELISA voor het kwantificeren van LH- en VEGF-niveaus
- Looped lineaire regressieanalyse voor de verificatie van de relatie
Belangrijkste resultaten
- Een significante correlatie tussen LH en VEGF werd waargenomen in zowel runder- als varkensnieren.
- Normalisatie van de ELISA-resultaten naar het totaal eiwit was cruciaal voor de nauwkeurigheid.
- De methode kan mogelijk worden toegepast voor de analyse van andere analyten in nierextracten.
Conclusies
- Deze studie presenteert een betrouwbare methode om belangrijke groeifactoren in de renale biologie te correleren.
- De bevindingen hebben implicaties voor verder onderzoek naar orgaanangiogenese en aanverwante hormonale interacties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Het vaststellen van een kwantitatieve, lineaire relatie tussen luteïniserend hormoon (LH) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) in extracten van de nierschors pakt een belangrijke uitdaging aan bij de targetvalidatie voor renale angiogenese-routes. Deze aanpak vergroot het voorspellend vertrouwen in mechanistische studies door robuuste, reproduceerbare meting van interacties tussen hormonen en groeifactoren in hogere zoogdiermodellen mogelijk te maken. Het protocol ondersteunt de translationele continuïteit van discovery biology naar preklinisch onderzoek door gebruik te maken van toegankelijke runder- en varkensweefsels.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar de mechanistische link tussen LH en VEGF in nierweefsel.
- Ondersteunt biologische risicovermindering door kwantificering van hormoongestuurde VEGF-modulatie.
- Faciliteert functionele targetvalidatie voor angiogenese-gerelateerde pathways in niermodellen.
- Biedt een reproduceerbaar kader voor hypothesetoetsing in de renale fysiologie.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde extracten van de nierschors voor voor downstream kwantitatieve assays.
- Standaardiseert de normalisatie van analytgelevels op basis van totaal eiwit voor de reproduceerbaarheid van de assay.
- Maakt betrouwbare ELISA-gebaseerde kwantificatie van LH en VEGF mogelijk voor screeningsworkflows.
- Ondersteunt schaalbaarheid en cross-species aanpassing van assays met behulp van overvloedige weefselbronnen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekte-relevante systemen door de regulatie van VEGF in hogere zoogdieren te modelleren.
- Biedt continuïteit voor translationele biomarkerstudies naar renale angiogenese.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door reproduceerbare, kwantitatieve resultaten te ondersteunen.
- Vermindert de risico's van mechanistische aannames voorafgaand aan de selectie van preklinische modellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door kwantitatieve hypothesetests, standaardisatie van assays en afstemming van translationele modellen mogelijk te maken voor onderzoek naar renale angiogenese.
- Discovery Biology: Ondersteunt het mechanistische testen van hypothesen over LH-VEGF-interacties in extracten van de nierschors.
- Screening: Levert reproduceerbare, genormaliseerde ELISA-resultaten voor vergelijkende analyse tussen monsters en soorten.
- Analytics: Biedt kwantitatieve metingen van afhankelijke variabelen en lineaire regressieresultaten voor robuuste statistische analyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat de brug tussen ontdekkingsbevindingen en preklinische modellen met gebruik van fysiologisch relevante zoogdierweefsels.
- Bedrijfbrede hergebruikbaarheid: Biedt een schaalbaar, aanpasbaar protocol voor bredere correlatiestudies van analyten in de renale fysiologie.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar renale angiogenese.
- Operationele waarde: Standaardiseert weefselverwerking, analytennormalisatie en ELISA-workflows voor reproduceerbaarheid.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en portfolliage door robuuste, kwantitatieve gegevens te leveren.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van renale targets en pathways mogelijk voor verdere ontwikkeling.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefseldissectie, homogenisatie en het uitvoeren van ELISA-assays.
- Toegang tot verse runder- of varkensnieren en analytische instrumentatie voor eiwitkwantificering en ELISA-uitlezingen is noodzakelijk.
- Strikte normalisatie en consistentie bij het bemonsteren zijn vereist om de vergelijkbaarheid tussen monsters te waarborgen.
- Aanpasbaar aan andere weefseltypen en analyten met de juiste wijzigingen in het protocol.
- Afhankelijk van onmiddellijke weefselverwerving en handhaving van de koude keten voor de integriteit van de monsters.
