LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging

LarveSPA is de eerste methode die continue live beeldvorming van intacte drosophila larven voor meer dan 10 uur met hoge temporele en ruimtelijke resolutie mogelijk maakt. Deze methode wordt gebruikt voor het onthullen van dynamische cellulaire processen van larven perifere sensorische neuronen en voor het bestuderen van vele andere cellulaire processen die gebeuren in de buurt van de larve lichaam muur. Deze methode is eenvoudig te gebruiken en heeft minder beperking op larvengrootte.

Zes tot negen larven kunnen tegelijkertijd in de beeldkamer worden gemonteerd, wat het experiment mogelijk maakt. De beeldkamer van de PDMS-cuboids kan tegen minimale kosten worden vervaardigd en is herbruikbaar. Deze methode is vooral nuttig voor het bestuderen van mechanismen van dendriet ontwikkeling en dededrietendegeneratie met behulp van drosophila larve dendritische toelating neuronen.

In staat zijn om het beeld van hetzelfde neuron voor uren kan onthullen hoe lange termijn wereldwijde veranderingen van dendritische patronen ontstaan uit korte termijn gedrag op het niveau van de individuele tak. Het gebruik van PDMS-cuboïden die overeenkomen met de grootte van larven verhoogt het slagingspercentage van immobiliserende larven. Meer nuttige tapes vind je in onze sectie probleemoplossing.

Na de bouw van een aluminium blok van een machine winkel, verzegelen de onderkant van het metalen frame met behulp van een lange cover slip met UV-lijm. Genees de UV-aanwijzing met behulp van een handheld UV-lamp gedurende 30 seconden. Bevestig lagen verpakkingstape aan het binnenoppervlak van een rechthoekige petrischaal of ronde celkweekplaat.

Gebruik één laag voor tweede in-star larven, twee lagen voor vroege derde in-star larven, of drie lagen voor late derde in-star larven. Snijd de tape in reizen van specifieke breedte met een scheermesje, 1,5 millimeter voor de eenlaag tape en twee millimeter voor de twee laag of drie laag tape. Laat ten minste een vijf millimeter ruimte tussen de twee strips.

Verwijder de tapelagen die de ruimte bedekken. Verwijder stof van het binnenoppervlak van de plaat met plakband. Daarna is de mal klaar voor gebruik.

Om de PDMS-mix voor te bereiden, meng je zeven gram PDMS-basis in 0,7 gram uithardingsmiddel grondig in een kleine container. Plaats de container gedurende ten minste 15 minuten in een vacuümdesiccator om lucht uit het mengsel te verwijderen. Langzaam giet ongeveer 5,5 gram PDMS mengsel op de mal om een een tot twee millimeter dikte te bereiken.

Plaats het PDMS-mengsel gedurende ten minste 15 minuten opnieuw in de vacuümdesiccator om de resterende luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. Breek de laatste paar bubbels met een pipettip. Genees de PDMS twee uur lang op een vlakke ondergrond in een warmte-incubator bij 65 graden Celsius.

Gebruik vervolgens een scheermesje om de uitgeharde PDMS langs de rand van de mal los te maken en los te maken van de mal. Bewaar de PDMS tussen twee stukken grote plakband bij kamertemperatuur. Voor vroege en late derde in-star larven, snijd de PDMS in acht door twee bij een millimeter cuboids door de positionering van de groef gemaakt door de tape strip in het midden van de lange kant van de cuboid.

Voor de tweede in-star larven, snijd de cuboid tot acht bij een millimeter. Om de bovenste cover slip voor te bereiden voor montage, kies zes PDMS cuboids met groeven die overeenkomen met de grootte van de larven. Verwijder stof van het oppervlak van de PDMS met plakband.

Bevestig vier stukken dubbelzijdige tape ter grootte van 12 bij vijf millimeter op een lange afdekslip van 22 bij 50 millimeter voor het bevestigen van PDMS-cuboids later. Pas de spaties tussen de twee stukken dubbelzijdige tape aan op dezelfde als de breedte van de PDMS-groef. Breng een kleine druppel UV-lijm in de groef van elke PDMS-kuboïde en voeg zes kleine druppels UV-lijm toe in de ruimte tussen de dubbelzijdige tapes op de cover slip.

Om de larven voor te bereiden op montage, met behulp van een paar tangen, reinigt u de larven in water om voedsel van het lichaamsoppervlak te verwijderen. Plaats de schone larven op een klein stukje bevochtigd tissuepapier in een kleine petrischaal zonder deksel en plaats de kleine petrischaal in een grote petrischaal met een stuk droog tissuepapier. Gebruik in een chemische kap een plastic overbrengende pipet om 160 tot 240 microliter isoflurane op het droogweefselpapier aan te brengen en het deksel van de grote petrischaal te sluiten.

Wacht twee tot drie minuten terwijl u de larven in de gaten houdt. Zodra hun mondhaken stoppen met bewegen, haal je de larven uit de grote petrischaal. Plaats de geïmmobiliseerde larven op de UV-lijm tussen de dubbelzijdige tapes op de afdeksel met de rugslijmvlies naar de afdeksel.

Bedek elke larve met een PDMS-blok en pas de romp van de larve in de groef van de PDMS. Laat de kop en de staart van de larve buiten de PDMS-groef. Vermijd het blokkeren van de spiracles van de larve door de lijm.

Druk op de uiteinden van het PDMS-blok op de dubbelzijdige tape zonder kracht op de groef toe te passen. Trek voorzichtig aan de staart van de larve om de cuticula onder de PDMS plat te maken. Draag een veiligheidsbril en gebruik een handheld UV-lamp om de UV-lijm gedurende vier minuten te genezen op de hoge stand.

Draai de afdeksel ondersteboven en gebruik de UV-lamp om de UV-lijm nog vier minuten te genezen. Plaats een klein stukje lenspapier met een grootte van 15 bij 30 millimeter aan de onderkant van de beeldkamer. Bevochtig het papier met 20 tot 30 microliter water.

Plaats de afdekking slip op de kamer, zodat de larven worden geconfronteerd met de binnenkant van de kamer. Gebruik de UV-lijm om beide uiteinden van de afdeksel aan het metalen oppervlak te hechten. De rugzijde van de larven is klaar voor beeldvorming onder een confocale microscoop.

Na beeldvorming, verwijder de olie op de bovenste cover slip met behulp van lens papier. Maak de bovenklep slip van het metalen frame door te snijden in de ruimte tussen de cover slip en het metalen frame met een scheermesje. De beeldkamer is klaar voor hergebruik.

Maak de PDMS-cuboïden los van de bovenste afdekstrook met tangen. Rol de PDMS-cuboïden op plakband om lijmresten en stof te verwijderen. De PDMS cuboids zijn klaar voor hergebruik.

In dit protocol werden drosophila larven langer dan 10 uur geïmmobiliseerd voor continue beeldvorming. Dit cijfer toont zes recente derde in-sterlarven die in de kamer worden opgezet. De stammen van de larven werden bevestigd terwijl hun hoofden en staarten vrij waren om zich te bewegen.

Hier tonen we de toepassing van LarveSPA in het bestuderen van neuronale dendrietdynamica en degeneratie van dendriet met behulp van klasse vier DA-neuronen als model. Om larven met behulp van deze methode succesvol te immobiliseren, is het van cruciaal belang om te stoppen met het blootstellen van de larven aan isoflurane zodra de mondhaken stoppen met bewegen en de UV-lijm genezen voordat larven volledig wakker worden. Om degeneratie en regeneratie van dendriet te bestuderen, kan laserletsel worden uitgevoerd wanneer larven worden geïmmobiliseerd in de beeldkamer.

LarveSPA heeft ons geholpen om te begrijpen hoe dynamische groeiende dendrieten niet aan innervate epidermale cellen zoals in hepatische cel proteoglycanen en hoe fosphatidylserine wordt blootgesteld aan degenederritsen na laserletsel. Bescherm de ogen met een veiligheidsbril tijdens het gebruik van de UV-lamp. Het uitschakelen van larven met behulp van isofluran moet worden uitgevoerd in een rookkap.