Name: LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Leer LarvaSPA voor langdurige time-lapse imaging van intacte Drosophila larven. Deze methode maakt continu beeldvorming van perifere sensorische neuronen mogelijk om dendrietontwikkeling en celbiologische processen te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Lingfeng Tang voor het opzetten van een eerdere versie van de LarvaSPA methode; Glenn Swan bij Cornell Olin Hall Machine shop voor het maken van eerdere prototypes van de imaging kamer; Philipp Isermann voor het bouwen van metalen frames en het geven van suggesties over het maken van PDMS-cuboïden; Cornell BRC Imaging faciliteit voor toegang tot microscopen (gefinancierd door NIH subsidie S10OD018516); Maria Sapar voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door een Cornell Fellowship toegekend aan H.J.; een Cornell start-up fonds en NIH subsidies (R01NS099125 en R21OD023824) toegekend aan C.H. H.J. en C.H. bedacht het project en ontwierp de experimenten. H.J. voerde de experimenten uit. H.J. en C.H. schreven het manuscript.

1. Het maken van de beeldkamer
<ol><li>Het metalen frame kan worden opgebouwd uit een aluminium blok in een typische machinewinkel. De specificaties van het frame zijn geïllustreerd in figuur 1A.</li>
	<li>Voor de constructie van de beeldkamer sluit u de onderkant van het metalen frame af met een lange afdekslip (22 mm x 50 mm) en UV-lijm(figuur 1A). Genees de UV-lijm met een hand-held UV-lamp.</li>
</ol>2. PdMS-cuboïden maken
<ol><li>Bereid de mal voor op PDMS-cuboïden.<ol>
<li>Bevestig lagen verpakkingstape aan het binnenoppervlak van een rechthoekige (80 mm x 55 mm) petrischaal of ronde celkweekplaat. Gebruik één laag (0,063 mm dik) voor tweede instar larven, 2 lagen (0,126 mm dik) voor vroege derde instar larven, of drie lagen (0,189 mm dik) voor late derde instar larven (Figuur 1B).</li>
		<li>Snijd de tape in stroken van specifieke breedte met een scheermesje: 1,5 mm voor de 1-laags tape en 2 mm voor 2-laags of 3-laags tape. De breedte en dikte van de strip bepalen de grootte van de larven die de uiteindelijke PDMS-cuboïde kan bevatten. Laat ten minste een 5 mm ruimte tussen de twee stroken. Verwijder de tapelagen die de ruimte bedekken (figuur 1B).</li>
		<li>Verwijder stof van het binnenoppervlak van de plaat met plakband. De mal is klaar voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de PDMS-mix voor.<ol>
<li>Meng 7 g PDMS-basis en 0,7 g uithardingsmiddel (10:1 verhouding) grondig in een kleine container.</li>
		<li>Plaats de container minstens 15 min in een vacuümdesiccator om lucht uit het mengsel te verwijderen.</li>
		<li>Giet langzaam ongeveer 5,5 g PDMS-mengsel op de mal om een dikte van 1-2 mm(figuur 1B)te bereiken.</li>
		<li>Plaats het PDMS-mengsel gedurende ten minste 15 minuten opnieuw in de vacuümdesiccator om de resterende luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. Breek de laatste paar bubbels met een pipet tip.</li>
		<li>Verhard de PDMS op een vlak oppervlak in een warmteincubator bij 65 °C gedurende 2 uur.</li>
		<li>Gebruik een scheermesje om de genezen PDMS los langs de rand van de mal en los te maken van de mal. Bewaar de PDMS tussen twee stukken grote plakband bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Snijd de PDMS voor vroege en late derde insterlarven in 8 mm x 2 x 1 mm cuboïden (langs de stippellijnen in figuur 1B)door de groef van de tapestrip (stap 2.1.2) in het midden van de lange zijde van de cuboïde(figuur 1B,C) teplaatsen. Snijd voor tweede instar larven de cuboïde tot 8 mm x 1 mm x 1 mm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Het monteren van larven voor langdurige time-lapse beeldvorming
<ol><li>Bereid de bovenste coverslip voor op montage.<ol>
<li>Kies zes PDMS-cuboïden met groeven die overeenkomen met de grootte van de larven. Volg de aanbevolen groef en grootte van PDMS op basis van de stappen 2.1.1, 2.1.2 en 2.2.7.</li>
		<li>Verwijder stof van het oppervlak van de PDMS met plakband.</li>
		<li>Bevestig vier stukken dubbelzijdige tape (12 mm x 5 mm) op een lange coverslip (22 mm x 50 mm) voor het later bevestigen van PDMS-kuboïden. De ruimten tussen de twee stukken dubbelzijdige tape moeten dezelfde zijn als de breedte van de PDMS-groef.</li>
		<li>Breng een kleine druppel (~ 1,2 μL) UV-lijm aan in de groef van elke PDMS-cuboïde en voeg zes kleine druppels UV-lijm toe in de ruimte tussen de dubbelzijdige tape op de coverslip.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid de larven voor op de montage.<ol>
<li>Met behulp van een paar tangen, reinig de larven in water om voedsel te verwijderen uit het lichaamsoppervlak.</li>
		<li>Plaats schone larven op een klein stukje bevochtigd tissuepapier in een kleine (35 mm) petrischaal zonder deksel. Plaats de kleine petrischaal in een grote (60 mm) petrischaal met een stuk droog tissuepapier. Breng in een chemische kap 8-12 druppels (160-240 μL) isoflurane aan op het droge weefselpapier met behulp van een plastic overbrengende pipet en sluit het deksel van de grote petrischaal.</li>
		<li>Wacht 2-3 min tijdens het bewaken van de larven. Haal de larven uit de grote petrischaal zodra hun mondhaken stoppen met bewegen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zet de dieren op.<ol>
<li>Om beeldstructuren aan de rugzijde van het dier te plaatsen, plaatst u de geïmmobiliseerde larven op de UV-lijm tussen de dubbelzijdige tape op de coverslip met de rugnageldie naar de coverslip gericht is.</li>
		<li>Bedek elke larve met een PDMS-blok en plaats de romp van de larve in de groef van de PDMS. Laat het hoofd en de staart van de larve buiten de PDMS-groef. Vermijd het blokkeren van de spiracles van de larve door de lijm.</li>
		<li>Druk op de uiteinden van het PDMS-blok op de dubbelzijdige tape zonder kracht op de groef toe te passen. Trek voorzichtig aan de staart van de larve om de nagelriem onder de PDMS plat te maken.</li>
		<li>Cure de UV-lijm gedurende 4 min met behulp van een hand-held UV-lamp op de hoge instelling (op ongeveer 0,07 mW/mm2). LET OP: Bescherm de ogen met een veiligheidsbril tijdens het gebruik van de UV-lamp.</li>
		<li>Draai de coverslip ondersteboven en herhaal stap 3.3.4.</li>
		<li>Bevochtig een klein stukje lenspapier (15 mm x 30 mm) met 20 μL–30 μL water. Plaats het bevochtigde lenspapier onder aan de beeldkamer(figuur 1A,D).</li>
		<li>Plaats de coverslip op de kamer, zodat de larven zijn geconfronteerd met de binnenkant van de kamer. Sluit beide uiteinden van de coverslip aan het metalen oppervlak met behulp van UV-lijm(figuur 1A,D). De dorsale kant van de larven is klaar voor beeldvorming onder confocale microscoop(figuur 1E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Beeldvorming
<ol><li>Beeldlarven met een aangewezen microscoop. Alle resultaten in dit protocol (Figuur 2, Figuur 3, Video S2, Video S3en Video S4) werden verkregen met behulp van een confocale systeem met een 40x (1.30 NA) oliedoelstelling.</li>
</ol>5. Herstel van de beeldkamer en PDMS-cuboïden
<ol><li>Verwijder na beeldvorming de olie op de bovenste coverslip met behulp van een lenspapier. Maak de bovenste coverslip los van het metalen frame door met een scheermesje in de ruimte tussen de coverslip en het metalen frame te snijden. De beeldkamer is klaar voor hergebruik.</li>
	<li>Maak de PDMS-cuboïden met tangen los van de bovenste coverslip. Rol de PDMS-cuboïden op plakband om lijmresten en stof te verwijderen. De PDMS-cuboïden zijn klaar voor hergebruik.</li>
</ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li>
<li>Daniele, J. R., Baqri, R. M., Kunes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+axonal+trafficking+via+a+novel+live-imaging+technique+reveals+distinct+hedgehog+transport+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Analysis of axonal trafficking via a novel live-imaging technique reveals distinct hedgehog transport kinetics.</a> Biology Open. 6 (5), 714-721 (2017).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+immunostaining+of+hemocyte+compartments+in+Drosophila+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo immunostaining of hemocyte compartments in Drosophila for live imaging.</a> PLoS One. 9 (6), 98191(2014).</li>
<li>Han, C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer-driven+membrane+markers+for+analysis+of+nonautonomous+mechanisms+reveal+neuron-glia+interactions+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enhancer-driven membrane markers for analysis of nonautonomous mechanisms reveal neuron-glia interactions in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (23), 9673-9678 (2011).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direction+Selectivity+in+Drosophila+Proprioceptors+Requires+the+Mechanosensory+Channel+Tmc%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Direction Selectivity in Drosophila Proprioceptors Requires the Mechanosensory Channel Tmc.</a> Current Biology. 29 (6), 945-956 (2019).</li>
<li>Heckscher, E. S., Lockery, S. R., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Drosophila+larval+crawling+at+the+level+of+organism%2C+segment%2C+and+somatic+body+wall+musculature%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of Drosophila larval crawling at the level of organism, segment, and somatic body wall musculature.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (36), 12460-12471 (2012).</li>
<li>Vaadia, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Proprioceptive+System+Dynamics+in+Behaving+Drosophila+Larvae+Using+High-Speed+Volumetric+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy.</a> Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), e50998(2014).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+the+Drosophila+larval+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of the Drosophila larval neuromuscular junction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 481-489 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+imaging+chamber+for+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Building an imaging chamber for in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 476-480 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junctions+to+study+synapse+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+intact+Drosophila+larvae+at+sub-cellular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of intact Drosophila larvae at sub-cellular resolution.</a> Journal of Visualized Experiments. (43), e2249(2010).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).</li>
<li>Chaudhury, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+cryo-anesthesia+of+Drosophila+larvae+for+high+resolution+in+vivo+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
<li>Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+establish+dendrite-substrate+relationships+that+promote+dendritic+self-avoidance+and+patterning+in+drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
<li>Poe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+space-filling+requires+a+neuronal+type-specific+extracellular+permissive+signal+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dendritic space-filling requires a neuronal type-specific extracellular permissive signal in Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (38), 8062-8071 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).</li>
<li>Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+injury+triggers+DLK-independent+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration.</a> Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+Externalization+Results+from+and+Causes+Neurite+Degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
<li>Desjardins, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Awake+Mouse+Imaging%3A+From+Two-Photon+Microscopy+to+Blood+Oxygen+Level-Dependent+Functional+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%3A+Cognitive+Neuroscience+and+Neuroimaging%22%5BJournal%5D)">Awake Mouse Imaging: From Two-Photon Microscopy to Blood Oxygen Level-Dependent Functional Magnetic Resonance Imaging.</a> Biological Psychiatry: Cognitive Neuroscience and Neuroimaging. 4 (6), 533-542 (2019).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+brain+imaging+in+live+adult+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term optical brain imaging in live adult fruit flies.</a> Nature Communications. 9 (1), 872(2018).</li>
<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Hier beschrijven we LarvaSPA, een veelzijdige methode om levende Drosophila larven te monteren voor langdurige time-lapse beeldvorming. Deze methode vereist geen herstellende of opnieuw monterende larven, waardoor ononderbroken beeldvorming mogelijk is. Het is daarom ideaal voor het bijhouden van biologische processen die uren in beslag nemen, zoals dedenrite degeneratie en regeneratie. Deze methode kan ook worden gebruikt voor beeldvorming intracellulaire calciumdynamica en subcellulaire gebeurtenissen zoals mi...

Time-lapse live imaging is een krachtige methode voor het bestuderen van dynamische cellulaire processen. De ruimtelijke en tijdelijke informatie die door time-lapse films kan onthullen belangrijke details voor het beantwoorden van celbiologie vragen. De Drosophila larve is een populair in vivo model voor onderzoeken met behulp van live imaging, omdat de transparante carrosserie zorgt voor niet-invasieve beeldvorming van interne structuren1,2. Daarnaast zijn tal van genetische hulpmiddelen beschikbaar in Drosophila om fluorescerende label anatomische structuren en macromoleculen3. Echter, lange termijn time-lapse beeldvorming van Drosophila larven is een uitdaging. In tegenstelling tot stationaire vroege embryo's of poppen bewegen Drosophila-larven voortdurend, waardoor immobilisatie nodig is voor live beeldvorming. Effectieve manieren om levende Drosophila-larven te immobiliseren zijn het monteren in halocarbon olie met chloroform4,verdoven met behulp van isoflurane of Dichlorvos oplossing5, en comprimeren tussen de coverslip en de microscoopdia6. Hoewel sommige van deze methoden zijn gebruikt voor microscopie, geen van hen is effectief voor de lange termijn live imaging. Andere methoden werden ontwikkeld voor beeldvorming body wall neuronen in kruipende larven met behulp van conventionele confocale microscopie of licht-sheet microscopie7,8,9. Deze methoden zijn echter niet ideaal voor het monitoren van cellulaire dynamiek als gevolg van de beweging van de larven.
Er zijn nieuwe methoden ontwikkeld om langdurige time-lapse beeldvorming van Drosophila-larven te bereiken. Met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) "larve chip" kunnen Drosophila larven effectief worden geïmmobiliseerd door vacuümgegenereerde zuigkracht in een gespecialiseerde microkamer zonder verdoving. Deze methode biedt echter geen hoge temporele resolutie voor celbiologiestudies en heeft strikte beperkingen op diergrootte10. Een andere methode met behulp van een verdovingsapparaat bereikte live beeldvorming van Drosophila larven op meerdere tijdpunten en is toegepast om neuromusculaire knooppunten11,12,13,14,15,16te bestuderen. Deze methode maakt echter ook geen continue beeldvorming langer dan 30 min mogelijk en vereist herhaaldelijk gebruik van desflurane, wat neurale activiteit kan remmen en het onderzochte biologische proces kan beïnvloeden17,18. Onlangs is een nieuwe methode die microfluïdeen en cryoanesthesie combineert gebruikt om larven van verschillende groottes te immobiliseren voor korte tijd (minuten)19. Deze methode vereist echter gespecialiseerde apparaten zoals een koelsysteem en langere perioden van immobilisatie vereisen herhaalde koeling van de larven.
Hier presenteren we een veelzijdige methode om Drosophila larven te immobiliseren die langer dan 10 uur compatibel is met ononderbroken time-lapse beeldvorming. Deze methode, die we "Larva Stabilization by Partial Attachment" (LarvaSPA) noemen, houdt in dat de larvecuticula wordt vastgemaakt aan een coverslip voor beeldvorming in een op maat gemaakte beeldkamer. Dit protocol beschrijft hoe de beeldkamer te maken en hoe larven te monteren in een verscheidenheid van ontwikkelingsstadia. In de LarvaSPA-methode worden de gewenste lichaamssegmenten met behulp van een UV-reactieve lijm op de coverslip aangebracht. Een PDMS-cuboïde oefent bovendien druk uit op de larven, waardoor ontsnapping wordt voorkomen. De lucht en het vocht in de beeldkamer zorgen voor het overleven van de gedeeltelijk geïmmobiliseerde larven tijdens beeldvorming. Voordelen van LarvaSPA ten opzichte van andere technieken zijn het volgende: (1) Het is de eerste methode die het mogelijk maakt voor continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor uren met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie; (2) De methode kent minder beperkingen op de grootte van de larve; (3) De beeldkamer en PDMS-cuboïden kunnen tegen minimale kosten worden vervaardigd en herbruikbaar zijn.
Naast het beschrijven van de larve montage methode, bieden we verschillende voorbeelden van de toepassing ervan voor het bestuderen van dendriet ontwikkeling en dendriet degeneratie van Drosophila dendritic arborization (da) neuronen.

<table><tbody><tr><td>6061 Aluminium staven</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K421</td><td></td></tr><tr><td>3M dubbelzijdig plakband</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16093</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch verpakkingstape</td><td>3M</td><td></td><td>1.88"B x 22.2 Yards</td></tr><tr><td>DUMONT #3 Pincet</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-241-34</td><td></td></tr><tr><td>Glazen deksel</td><td>Azer Scientific</td><td>1152250</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal Microscoop</td><td>Leica</td><td>SP8 uitgerust met een resonante scanner</td><td></td></tr><tr><td>Lenspapier</td><td>Berkshire</td><td>LN90.0406.24</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (middelgroot)</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>Petrischalen (klein)</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td></td></tr><tr><td>Veiligheidsmesje</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-20</td><td></td></tr><tr><td>Rechthoekige petrischaal</td><td>VWR</td><td>25384-322</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 kit (PBMS kit)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Overdrachtpipet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1371126</td><td></td></tr><tr><td>UV-lijm</td><td>Norland products</td><td>#6106, NOA 61</td><td>Breekindex 1.56</td></tr><tr><td>UV-lamp (Workstar 2003)</td><td>Maxxeon</td><td>MXN02003</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum-droger</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71232</td><td></td></tr><tr><td>Doekjes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimwipes</td><td></td></tr></tbody></table>

larvaspa, een methode voor het monteren van drosophila larve voor lange termijn time-lapse imaging

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is een waardevolle aanpak voor het onderzoeken van celbiologie vragen. De Drosophila larve is bijzonder geschikt voor in vivo levende beeldvorming omdat de larve body wall en de meeste inwendige organen transparant zijn. Echter, continue live beeldvorming van intacte Drosophila larven voor langer dan 30 min is een uitdaging, omdat het moeilijk is om niet-invasief immobilisatieimmobilizing larven voor een lange tijd. Hier presenteren we een larve montagemethode genaamd LarvaSPA die het mogelijk maakt voor continue beeldvorming van levende Drosophila larven met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie voor langer dan 10 uur. Deze methode omvat het gedeeltelijk bevestigen van larven aan de coverslip met behulp van een UV-reactieve lijm en bovendien het beperken van larve beweging met behulp van een polydimethylsiloxane (PDMS) blok. Deze methode is compatibel met larven in ontwikkelingsstadia van tweede instar tot zwervende derde instar. We tonen toepassingen van deze methode bij het bestuderen van dynamische processen van Drosophila somatosensorische neuronen, waaronder dendrietgroei en door verwondingen veroorzaakte dendrite degeneratie. Deze methode kan ook worden toegepast om vele andere cellulaire processen die gebeuren in de buurt van de larve body wall te bestuderen.

De larve imaging kamer is opgebouwd door het lijmen van een op maat gemaakt metalen frame en twee coverslips aan elkaar. Het ontwerp van het metalen frame is gespecificeerd in figuur 1A. Drosophila larven in de kamer worden aan de bovenste coverslip met behulp van UV-lijm en PDMS-cuboïden gehecht. De groef op de PDMS-cuboïde en de dubbelzijdige tape de cuboïde is bevestigd om de ruimte te creëren om de larven vast te houden (Figuur 1B,C). De PDM...

Dit protocol beschrijft een methode voor het monteren van Drosophila larven om langer dan 10 uur ononderbroken time-lapse beeldvorming bij intacte levende dieren te bereiken. Deze methode kan worden gebruikt om veel biologische processen dicht bij de larve lichaam wand beeld.

LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

LarveSPA is de eerste methode die continue live beeldvorming van intacte drosophila larven voor meer dan 10 uur met hoge temporele en ruimtelijke resolutie mogelijk maakt. Deze methode wordt gebruikt voor het onthullen van dynamische cellulaire processen van larven perifere sensorische neuronen en voor het bestuderen van vele andere cellulaire processen die gebeuren in de buurt van de larve lichaam muur. Deze methode is eenvoudig te gebruiken en heeft minder beperking op larvengrootte.Zes tot negen larven kunnen tegelijkertijd in de beeldkamer worden gemonteerd, wat het experiment mogelijk maakt. De beeldkamer van de PDMS-cuboids kan tegen minimale kosten worden vervaardigd en is herbruikbaar. Deze methode is vooral nuttig voor het bestuderen van mechanismen van dendriet ontwikkeling en dededrietendegeneratie met behulp van drosophila larve dendritische toelating neuronen.In staat zijn om het beeld van hetzelfde neuron voor uren kan onthullen hoe lange termijn wereldwijde veranderingen van dendritische patronen ontstaan uit korte termijn gedrag op het niveau van de individuele tak. Het gebruik van PDMS-cuboïden die overeenkomen met de grootte van larven verhoogt het slagingspercentage van immobiliserende larven. Meer nuttige tapes vind je in onze sectie probleemoplossing.Na de bouw van een aluminium blok van een machine winkel, verzegelen de onderkant van het metalen frame met behulp van een lange cover slip met UV-lijm. Genees de UV-aanwijzing met behulp van een handheld UV-lamp gedurende 30 seconden. Bevestig lagen verpakkingstape aan het binnenoppervlak van een rechthoekige petrischaal of ronde celkweekplaat.Gebruik één laag voor tweede in-star larven, twee lagen voor vroege derde in-star larven, of drie lagen voor late derde in-star larven. Snijd de tape in reizen van specifieke breedte met een scheermesje, 1,5 millimeter voor de eenlaag tape en twee millimeter voor de twee laag of drie laag tape. Laat ten minste een vijf millimeter ruimte tussen de twee strips.Verwijder de tapelagen die de ruimte bedekken. Verwijder stof van het binnenoppervlak van de plaat met plakband. Daarna is de mal klaar voor gebruik.Om de PDMS-mix voor te bereiden, meng je zeven gram PDMS-basis in 0,7 gram uithardingsmiddel grondig in een kleine container. Plaats de container gedurende ten minste 15 minuten in een vacuümdesiccator om lucht uit het mengsel te verwijderen. Langzaam giet ongeveer 5,5 gram PDMS mengsel op de mal om een een tot twee millimeter dikte te bereiken.Plaats het PDMS-mengsel gedurende ten minste 15 minuten opnieuw in de vacuümdesiccator om de resterende luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. Breek de laatste paar bubbels met een pipettip. Genees de PDMS twee uur lang op een vlakke ondergrond in een warmte-incubator bij 65 graden Celsius.Gebruik vervolgens een scheermesje om de uitgeharde PDMS langs de rand van de mal los te maken en los te maken van de mal. Bewaar de PDMS tussen twee stukken grote plakband bij kamertemperatuur. Voor vroege en late derde in-star larven, snijd de PDMS in acht door twee bij een millimeter cuboids door de positionering van de groef gemaakt door de tape strip in het midden van de lange kant van de cuboid.Voor de tweede in-star larven, snijd de cuboid tot acht bij een millimeter. Om de bovenste cover slip voor te bereiden voor montage, kies zes PDMS cuboids met groeven die overeenkomen met de grootte van de larven. Verwijder stof van het oppervlak van de PDMS met plakband.Bevestig vier stukken dubbelzijdige tape ter grootte van 12 bij vijf millimeter op een lange afdekslip van 22 bij 50 millimeter voor het bevestigen van PDMS-cuboids later. Pas de spaties tussen de twee stukken dubbelzijdige tape aan op dezelfde als de breedte van de PDMS-groef. Breng een kleine druppel UV-lijm in de groef van elke PDMS-kuboïde en voeg zes kleine druppels UV-lijm toe in de ruimte tussen de dubbelzijdige tapes op de cover slip.Om de larven voor te bereiden op montage, met behulp van een paar tangen, reinigt u de larven in water om voedsel van het lichaamsoppervlak te verwijderen. Plaats de schone larven op een klein stukje bevochtigd tissuepapier in een kleine petrischaal zonder deksel en plaats de kleine petrischaal in een grote petrischaal met een stuk droog tissuepapier. Gebruik in een chemische kap een plastic overbrengende pipet om 160 tot 240 microliter isoflurane op het droogweefselpapier aan te brengen en het deksel van de grote petrischaal te sluiten.Wacht twee tot drie minuten terwijl u de larven in de gaten houdt. Zodra hun mondhaken stoppen met bewegen, haal je de larven uit de grote petrischaal. Plaats de geïmmobiliseerde larven op de UV-lijm tussen de dubbelzijdige tapes op de afdeksel met de rugslijmvlies naar de afdeksel.Bedek elke larve met een PDMS-blok en pas de romp van de larve in de groef van de PDMS. Laat de kop en de staart van de larve buiten de PDMS-groef. Vermijd het blokkeren van de spiracles van de larve door de lijm.Druk op de uiteinden van het PDMS-blok op de dubbelzijdige tape zonder kracht op de groef toe te passen. Trek voorzichtig aan de staart van de larve om de cuticula onder de PDMS plat te maken. Draag een veiligheidsbril en gebruik een handheld UV-lamp om de UV-lijm gedurende vier minuten te genezen op de hoge stand.Draai de afdeksel ondersteboven en gebruik de UV-lamp om de UV-lijm nog vier minuten te genezen. Plaats een klein stukje lenspapier met een grootte van 15 bij 30 millimeter aan de onderkant van de beeldkamer. Bevochtig het papier met 20 tot 30 microliter water.Plaats de afdekking slip op de kamer, zodat de larven worden geconfronteerd met de binnenkant van de kamer. Gebruik de UV-lijm om beide uiteinden van de afdeksel aan het metalen oppervlak te hechten. De rugzijde van de larven is klaar voor beeldvorming onder een confocale microscoop.Na beeldvorming, verwijder de olie op de bovenste cover slip met behulp van lens papier. Maak de bovenklep slip van het metalen frame door te snijden in de ruimte tussen de cover slip en het metalen frame met een scheermesje. De beeldkamer is klaar voor hergebruik.Maak de PDMS-cuboïden los van de bovenste afdekstrook met tangen. Rol de PDMS-cuboïden op plakband om lijmresten en stof te verwijderen. De PDMS cuboids zijn klaar voor hergebruik.In dit protocol werden drosophila larven langer dan 10 uur geïmmobiliseerd voor continue beeldvorming. Dit cijfer toont zes recente derde in-sterlarven die in de kamer worden opgezet. De stammen van de larven werden bevestigd terwijl hun hoofden en staarten vrij waren om zich te bewegen.Hier tonen we de toepassing van LarveSPA in het bestuderen van neuronale dendrietdynamica en degeneratie van dendriet met behulp van klasse vier DA-neuronen als model. Om larven met behulp van deze methode succesvol te immobiliseren, is het van cruciaal belang om te stoppen met het blootstellen van de larven aan isoflurane zodra de mondhaken stoppen met bewegen en de UV-lijm genezen voordat larven volledig wakker worden. Om degeneratie en regeneratie van dendriet te bestuderen, kan laserletsel worden uitgevoerd wanneer larven worden geïmmobiliseerd in de beeldkamer.LarveSPA heeft ons geholpen om te begrijpen hoe dynamische groeiende dendrieten niet aan innervate epidermale cellen zoals in hepatische cel proteoglycanen en hoe fosphatidylserine wordt blootgesteld aan degenederritsen na laserletsel. Bescherm de ogen met een veiligheidsbril tijdens het gebruik van de UV-lamp. Het uitschakelen van larven met behulp van isofluran moet worden uitgevoerd in een rookkap.

larvaspa-method-for-mounting-drosophila-larva-for-long-term-time

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mesoscopische fluorescentie tomografie opereert buiten de grenzen van de penetratie-weefsel snijden fluorescentie microscopie. De techniek is gebaseerd op multi-projectie verlichting en een foton transport beschrijving. Tonen we aan in-vivo het hele lichaam 3D-visualisatie van de morfogenese van GFP-expressie vleugel imaginaire schijven...

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor verdoving en beeldvorming van...

In vivo beeldvorming van Intact Drosophila larven aan Subcellulaire resolutie

Source: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

Dit document toont het gebruik van een snelle scanning confocale microscoop om het celgedrag rechtstreeks via puparium. Bij het verlaten van het popstadium intact, kan deze methode waarneming en meting van dynamische celprocessen in een stadium van Drosophila ontwikkeling die moeilijk rechtstreeks te bestuderen.

Imaging Door de Pupal zaak van<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Hier beschrijven we een eenvoudig en breed toegankelijk microscopie techniek om hoogwaardige digitale video van Drosophila volwassen en larvale mutante fenotype over te nemen van een zijdelingse perspectief.

Overname van hoge kwaliteit digitale video van Drosophila Larven en volwassen gedrag van een Lateral Perspectief

Dit protocol presenteert een efficiënte methode voor het beeldvormen van het levende Drosophila pupale oogneuro-epitheel. Deze methode compenseert voor weefselbeweging en ongelijke topologie, verbetert de visualisatie van celgrenzen door het gebruik van meerdere GFP-gelabelde junctie-eiwitten en maakt gebruik van een eenvoudig te monteren beeldvormingsopstelling.

Live-beeldvorming van de Drosophila Pupal Eye

Dit protocol beschrijft een gedetailleerde methode voor de lange termijn ex vivo cultuur en live beeldvorming van een Drosophila imaginaire disc. Het toont fotoreceptor differentiatie en ommatidial rotatie binnen de 10 uur periode van live-imaging van het oog disc. Het protocol is eenvoudig en niet duur setup nodig.

Langdurige Live-Imaging van<em&gt; Drosophila</em&gt; Disc Eye

Hier presenteren we een protocol voor live-imaging wond reparatie en de geassocieerde inflammatoire respons bij hoge spatio-temporele resolutie in vivo. Deze methode maakt gebruik van de popstadium van Drosophila ontwikkeling om op lange termijn beeldvormings- en na verloop van tijd het volgen van specifieke cel populaties en is compatibel met efficiënte RNAi-gemedieerde gene inactivatie.

Op lange termijn In Vivo Tracking van inflammatoire cel dynamiek binnen Drosophila poppen

Hier beschrijven we de methode die we hebben gebruikt voorbeeld zeer beweeglijke dendritische filopodia in een live voorbereiding van de hersenen Drosophila larvale, en het protocol dat we hebben ontwikkeld om time-lapse 3D-beeldverwerkings sets voor kwantitatieve beoordelingen van dendriet te kwantificeren dynamiek in het ontwikkelen van neuronen.

Time-lapse Live beeldvorming en kwantificering van snelle dendritische tak dynamiek bij de ontwikkeling van Drosophila neuronen

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor langdurige live beeldvorming van de Drosophila-poot tijdens het popstadium, waarbij het puparium volledig wordt verwijderd. Dit protocol kan ook op andere weefsels worden toegepast.

Langdurige live beeldvorming van de ontwikkeling van de poppoot van Drosophila na verwijdering van Puparium

Leer LarvaSPA voor langdurige time-lapse imaging van intacte Drosophila larven. Deze methode maakt continu beeldvorming van perifere sensorische neuronen mogelijk om dendrietontwikkeling en celbiologische processen te bestuderen.

LarvaSPA, een methode voor het monteren van Drosophila Larve voor lange termijn Time-Lapse Imaging

Meer video's verkennen