Name: Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Leer een veilig infectiemodel voor Clostridioides difficile in zebrafishlarven via microinjectie en microgavage. Deze methode maakt real-time studie van de aangeboren immuunrespons tegen anaerobe pathogenen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn Timo Fritsch dankbaar voor uitstekende dierenverzorging. Wij danken de leden van de Köster en Steinert labs voor steun en nuttige discussies. We danken Dr. Dandan Han voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij erkennen dankbaar de financiering van de deelstaat Nedersaksen, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

Alle hier beschreven dierwerkzaamheden werden uitgevoerd in overeenstemming met de wettelijke voorschriften (EU-Richtlijn 2010/63, licentie AZ 325.1.53/56.1-TUBS en licentie AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Bereiding van laagsmeltende Agarose, Gel Plate en Microinjection/Microgavage Naalden
<ol><li>Los 0,08 g laagsmeltende agarose op (Tabel met materialen, agarose A2576) in 10 mL van 30% Danieau's medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) en 17,4 mM NaCl, opgeslagen bij kamertemperatuur (RT) om een 0,8% oplossing te verkrijgen. OPMERKING: Hogere of lagere concentraties agarose kunnen worden gebruikt. Echter, de benodigde tijd om te stollen varieert voor verschillende merken van agarose, zelfs bij dezelfde concentratie.</li>
	<li>Bereid micro-injectie en microgavage naalden uit glazen haarvaten(Tabel met materialen).<ol>
<li>Gebruik een micropipette trekker met de volgende instellingen (merk op dat eenheden specifiek zijn voor de hier gebruikte trekker; zie Materiaaltabel):microinjectienaalden (luchtdruk = 500; warmte = 400; trekkracht = 125; snelheid = 75; tijd = 150); en microgavagenaalden (luchtdruk = 500; warmte = 400; trek = 100; snelheid = 75; tijd = 150). Gebruik een microloadertip om 3 μL nuclease-vrije H2O in de getrokken naald te laden.</li>
		<li>Introduceer de naald in de injector en bevestig hem goed. Pas de naald aan een geschikte hoek aan voor injectie. Stel de injectiedruk tussen 600-900 hPa in voor micro-injectienaald en 200-300 hPa voor gavagenaald.</li>
		<li>Plaats een druppel minerale olie op de zwarte cirkel van de kalibratieplaat. Gebruik fijne tangen om de punt van de naald te knippen. Injecteer een druppel in de minerale olie om de grootte van de druppel te meten.</li>
		<li>Voor micro-injectie moet u de injectietijd aanpassen om een druppel te verkrijgen met een diameter van 0,10-0,12 mm, wat overeenkomt met een volume van 0,5–1,0 nL. Voor microgavage, het verkrijgen van een druppel met een diameter van 0,18-0,20 mm, die gelijk is aan een volume van 3-5 nL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid een 1,5 % agarose plaat met agarose (Tabel van materialen, 8050) in een 10 cm Petri schotel in 30% Danieau's medium met behulp van een kunststof mal als de microgavage mal. Bewaar bij 4 °C om uitdroging te voorkomen totdat dat nodig is. Warm tot RT of 28 °C voorafgaand aan het experiment.</li>
</ol>2. Bereiding en etikettering van C. difficile en sporen met fluorescerende kleurstof
<ol><li>Bereid een 1 mM voorraad oplossing van een fluorescerende kleurstof(Tabel met materialen). Omdat de kleurstof wordt verkocht in 50 μg aliquots poeder, voeg 69 μL DMSO toe aan de flacon om een voorraadconcentratie van 1 mM te verkrijgen.</li>
	<li>Bereid een 100 μM werkoplossing van de tl-kleurstof door 2 μL 1 mM-oplossing toe te voegen aan 18 μL DMSO in een centrifugebuis en meng goed.</li>
	<li>Cultuur C. difficile (R20291, een ribotype 027 stam) door het inenten van 10 mL BHIS vloeibaar medium met twee tot drie kolonies van een plaat in een anaerobe kap zonder te schudden 's nachts. BHIS is BHI aangevuld met 0,5% (w/v) gistextract en 0,1% (w/v) L-cysteïne. Los 1 g L-cysteïne op in 10 mL ddH2O en steriliseer door filtratie, voeg vervolgens toe aan het autoclaved medium om een definitieve concentratie van 1 g/L te verkrijgen. Selectief kweken van C. difficile wordt gedaan met behulp van chromID C. difficile platen (Tabel van materialen).</li>
	<li>Kleuring C. difficile met de fluorescerende kleurstof<ol>
<li>Oogst C. difficile bij een OD600 van 1,0–1,2 en was 1x met 1 mL 1x PBS (5.000 x g voor 3 min bij RT). Resuspend in 1 mL van 1 x PBS.</li>
		<li>Voeg 3 μL werkende oplossing van de fluorescerende kleurstof toe aan 1 mL bacteriënsuspensie. Incubeer het monster gedurende 15 min bij RT in het donker. Was de bevlekte C. difficile eenmaal met 1 mL PBS om restkleurstof te verwijderen en resuspendin e od600 van 1.0 (1.0 OD600 is ongeveer gelijk aan 108 cfu/mL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injectie van bevlekte C. difficile in Zebrafish Larven
<ol><li>Verdoven 20-30 zebravissen larven op 5 dagen na de bevruchting (hier aangeduid als 5 dpf) met 0,02%–0,04% tricaine (tricaine poeder wordt opgelost in dubbel gedestilleerd water en aangepast aan pH = 7 met 1 M Tris-HCL oplossing) in 30% Danieau's medium ~ 10 min voor Injectie. Breng de verdoofde larven over op een verse petrischaal van 10 cm en verwijder het medium van overtollige 30% Danieau.</li>
	<li>Plaats een daling van 0,8% laag smeltende agarose op de zebravissen larven te dekken. Pas de larven voorzichtig aan op een zijdelingse positie. Leg de petrischaal 30-60 s op ijs om de laagsmeltende agarose te laten stollen. Voeg 30% Danieau's medium met 0,02%–0,04% tricaine om de agarose te dekken.</li>
	<li>Bereid de injectieoplossing voor. Voeg 1 μL 0,5% fenolrood toe aan PBS-oplossing in 9 μL van het met kleurstof bevlekte C. difficile-inoculum om het injectieproces te visualiseren.</li>
	<li>Laad een gekalibreerde microinjectienaald met de injectieoplossing met behulp van een microloader. Monteer de geladen naald op een micromanipulator en plaats deze onder een stereomicroscoop.</li>
	<li>Stel de injectiedruk tussen 600-900 hPa aan. Stel de inspuittijd in op 0,1–0,3 s om 0,5–1,0 nL te verkrijgen. Zet de naald in de micromanipulator op een ~ 45 ° hoek wijzend naar de ingebedde larven.</li>
	<li>Plaats de naaldpunt boven het maag-darmkanaal dicht bij de urogenitale porie. Doorboor agarose dan de spier met de naald tip, dan steek het in het darmlumen en injecteren 0,5-1,0 nL van C. difficile. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de geïnjecteerde larven te monitoren en de goed geïnjecteerde larven op te pikken voor confocale beeldvorming.</li>
</ol>4. Generatie van gnotobiotic zebravissen larven
<ol><li>Gebruik de gevestigde natuurlijke fokmethode om gnotobiotische zebravisembryo's te genereren, waaronder: in vitro fertilisatie, wassen met antibioticahoudende medium (1 μg/mL amphotericine B, 10 μg/mL kanamycine en 20 μg/mL ampicillin), wassen met 0,1% wt/vol polyvinyl pyrrolidone-jodium (PVP-I) en incubatie van de embryo's in een celkweekkap12.</li>
	<li>Houd alle gnotobiotic zebravislarven onder gnotobiotic voorwaarden tot 5 dpf of net vóór de gavage. Na de gavage worden zebravissenlarven overgebracht naar een standaard incubator, maar met steriel 30% Danieau's medium.</li>
</ol>5. Gavage van ZebravisLarven
<ol><li>Kalibreer de microgavagenaald zoals beschreven in stap 1.2.</li>
	<li>Meet de diameter van de punt van de naald door de naald op een kalibratieplaat te plaatsen met één druppel minerale olie. Zorg ervoor dat de tip 30-40 μm in diameter, bot en glad is. Gooi de scherpe of ruwe naalden weg. LET OP: Scherpe randen van naalden kunnen worden afgemaakt door snel vlammen.</li>
	<li>Bereid de gavageoplossing zoals beschreven in stap 3.3.</li>
	<li>Laad en monteer de naald op een micromanipulator zoals beschreven in stap 3.4. Stel de micromanipulator aan om de naald in een hoek van 45° te plaatsen.</li>
	<li>Verdoven de zebravislarven waarnaar in stap 3.1 wordt verwezen. Wanneer de larven stoppen met bewegen, breng ze naar de groef van een microgavage mal met behulp van een Pasteur pipet.</li>
	<li>Plaats een daling van 0,8% laag smeltende agarose op de zebravissen larven te dekken. Pas de larven voorzichtig aan met koppen rechtop gericht bij 45° hoeken in de groef en staarten tegen de wand van de groef. Zorg ervoor dat de hoeken van de koppen ongeveer hetzelfde zijn, zodat ze zijn uitgelijnd met de hoek van de gavagenaalden. Plaats de microgavagemal 30-60 s op ijs, waardoor de laag smeltende agarose kan stollen om de posities van de larven te stabiliseren.</li>
	<li>Stel de injectiedruk tussen 200-300 hPa aan. Stel de injectietijd in op 0,1–0,3 s om een injectievolume van 3-5 nL C. difficile te verkrijgen.
</li>
	<li>Bedien de naald voorzichtig door de agarose en vervolgens in de mond van zebravissenlarven, via de slokdarm. Zodra de punt van de naald zich in de voorste darmbol bevindt, drukt u op het injectiepedaal om de bacteriën vrij te geven. Vul het lumen van de darm met het geleverde volume. Laat het niet overlopen van de slokdarm of cloaca. Trek de naald voorzichtig uit de mond van de zebravis.</li>
	<li>Na gavage, red de geïnfecteerde zebravissen larven uit de agarose met een flexibele microloader tip door eerst het snijden van de agarose weg dan door het opheffen van de larven. Breng deze larven over in steriel 30% Danieau's medium. Spoel de larven twee keer in steriel medium. Breng de larven over op een verse petrischaal van 10 cm. De larven worden tot 11 dpf onderhouden.</li>
</ol>6. Confocale microscopieanalyse van geïnjecteerde zebravissenlarven
<ol><li>Verdovende zebravislarven aangeduid als stap 3.1. Maak een gat in de bodem van een 35 mm petrischaal met een glazen schuif aan het gat, aangeduid als de beeldkamer. Breng embryo's naar de bodem van de beeldkamer met een voldoende hoeveelheid van 30% Danieau's medium.</li>
	<li>Voeg 200-300 μL van 1% laag smeltende agarose toe om de verdoofde larven te bedekken. Aangezien een omgekeerde confocale microscoop wordt gebruikt, plaats het besmette gebied van de larven tegen de glasdia zo dicht mogelijk.</li>
	<li>Laat de agarose stollen op ijs voor 30-60 s. Dompel de agarose onder met 30% Danieau's met 0,02%–0,04% tricaine.</li>
	<li>Beeld de larven met een confocale laser scanning microscoop(Tabel met materialen).</li>
</ol>7. Dissectie van Larvale Zebrafish Darm om levensvatbare C. difficile terug te vorderen
<ol><li>O-darmkanaal van larven isoleren om bacteriële belasting te analyseren. Begin met het euthanaseren van zebravislarven met 0,4 % tricaine.</li>
	<li>Spoel de zebravis kort af met steriele 1x PBS en breng ze over op een verse agaroseplaat.</li>
	<li>Dissectie van zebravissen<ol>
<li>Steek een naald in de rugromp van zebravissenlarven dicht bij het hoofd om de zebravissen te immobiliseren. Verwijder het hoofd achter de kieuwen met een lancet.</li>
		<li>Steek de tweede naald in het midden van de rugstam. Steek de derde naald in de buik van de zebravis en trek de darm uit de lichaamsholte. OPMERKING: Extreme zorg is nodig om de intacte darm te isoleren. Als het moeilijk is om dit te doen, uit te voeren extra trekt om de rest van de darm te scheiden van de resterende inwendige organen.</li>
		<li>Gebruik een micro-injectienaald om 10-15 darmen over te brengen in een 1,5 mL buis met 200 μL steriel van 1x PBS.</li>
		<li>Homogeniseren van de darmen met een stamper om het weefsel te verstoren en homogenaten voor te bereiden. Zorg ervoor dat de stamper de bodem van de buis bereikt om alle darmen volledig te verstoren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de homogenaten in C. difficile kweekmiddel met D-cycloserine en cefoxitine, met of zonder taurocholate (TCA, een kiemmiddel van C. difficile sporen) in een anaërobe kamer.</li>
	<li>Incubeer de plaat anaeroob gedurende 48 uur bij 37 °C.</li>
	<li>Gebruik bacteriële cultuur voor 16S rRNA-PCR.<ol>
<li>Zet een kolonie opnieuw op in 50 μL van H2O en kook deze op 95 °C gedurende 15 min. Pellet het lysed debris door centrifugatie (14.000 rpm voor 2 min bij RT) en gebruik 2 μL van de supernatant als sjabloon in 25 μL PCR-reactie met behulp van C. difficile-specifieke primers (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').</li>
		<li>Wanneer bacteriën uit vloeibare cultuur worden gebruikt, oogst dan 1 mL cultuur en was één keer met 1 mL PBS (14.000 rpm voor 2 min bij RT). Resuspend de pellet in 100 μL van H2Odd en behandelen zoals hierboven gedaan. Om bacteriële kolonies verder te karakteriseren, streep op een BHIS- of chromID-plaat (Tabel van materialen).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+infection%3A+new+developments+in+epidemiology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+protection+against+Clostridium+difficile+infection+by+the+monoclonal+antitoxin+antibodies+actoxumab+and+bezlotoxumab%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab.</a> Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).</li>
<li>Kelly, C. P., Kyne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+immune+response+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The host immune response to Clostridium difficile.</a> Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).</li>
<li>Britton, R. A., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+the+intestinal+microbiota+and+host+in+Clostridium+difficile+colonization+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance.</a> Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).</li>
<li>Goorhuis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+Clostridium+difficile+Infection+Due+to+a+New+Hypervirulent+Strain%2C+Polymerase+Chain+Reaction+Ribotype+078%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078.</a> Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).</li>
<li>Pépin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+fluoroquinolones+as+the+predominant+risk+factor+for+Clostridium+difficile-associated+diarrhea%3A+a+cohort+study+during+an+epidemic+in+Quebec%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec.</a> Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).</li>
<li>Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Fatal+Clostridium+difficile+-Associated+Disease+during+Continuous+Administration+of+Clindamycin+in+Hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122, 1-12 (2014).</li>
<li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+Zebrafish+Embryos+with+Intracellular+Bacterial+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3781(2012).</li>
<li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+Between+the+Gastrointestinal+Microbiome+and+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile.</a> Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+mCherry+red+fluorescent+protein+for+studies+of+protein+localization+and+gene+expression+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microgavage+of+Zebrafish+Larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microgavage of Zebrafish Larvae.</a> Journal of Visualized Experiments. (72), e4434(2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+Clostridium+difficile-Associated+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease.</a> Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).</li>
<li>Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+animal+models+for+the+study+of+Clostridium+difficile+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Letters%22%5BJournal%5D)">Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis.</a> FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).</li>
<li>Brugman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+to+study+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model to study intestinal inflammation.</a> Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).</li>
<li>Goulding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+profiles+of+infection+and+pathology+in+hamsters+infected+with+Clostridium+difficile+strains+630+and+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1.</a> Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).</li>
<li>Toh, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonizing+the+Embryonic+Zebrafish+Gut+with+Anaerobic+Bacteria+Derived+from+the+Human+Gastrointestinal+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract.</a> Zebrafish. 10, 194-198 (2013).</li>
<li>Bloemberg, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+static+immersion+and+intravenous+injection+systems+for+exposure+of+zebrafish+embryos+to+the+natural+pathogen+Edwardsiella+tarda%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda.</a> BMC Immunology. 12, 58(2011).</li>
<li>Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+host-pathogen+interaction+as+revealed+by+global+proteomic+profiling+of+zebrafish+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).</li>
<li>Valenzuela, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+capacity+of+human+gut+microorganisms+to+colonize+the+zebrafish+larvae+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio).</a> Frontiers in Microbiology. 9, (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De gepresenteerde methoden wijzigen en breiden een bestaande aanpak uit om zebravissenlarven te infecteren door zowel injectie als microgavage10,14uit te voeren. Het toont ook een benadering aan om anaërobe ziekteverwekkers met zebravissenlarven te bestuderen22. Bovendien vergemakkelijkt het protocol de analyse van aangeboren immuuncelreacties in vivo op CDI en bij kolonisatie van C. difficile bij zebravissen. De methode is reprod...

C. difficile is een gram-positieve, spore-vormende, anaërobe en toxine-producerende bacillus dat is de belangrijkste oorzaak van ernstige infecties in het maag-darmkanaal1. Typische symptomen van CDI zijn diarree, buikpijn en fatale pseudomembranous colitis, en het kan soms leiden tot de dood1,2. Bewijs heeft aangetoond dat gastheer immuunreacties een cruciale rol spelen in zowel de progressie als de uitkomst van deze ziekte3. Naast de immuunrespons is de inheemse darmmicrobiota cruciaal voor het begin en de pathogenese van CDI4. In het afgelopen decennium zijn zowel het aantal gevallen als het sterftecijfer van CDI aanzienlijk toegenomen als gevolg van de opkomst van een hypervirulente stam van C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Een beter begrip van onderliggende immuunmechanismen en de rol van microbiota tijdens CDI zal helpen leiden tot nieuwe therapeutische ontwikkelingen en vooruitgang, waardoor deze epidemie beter kan worden onder controle.
Verschillende diermodellen, zoals de hamster en de muis, zijn ontwikkeld om inzicht te geven in de immuunverdediging tegen C. difficile7,8. Echter, de rol van aangeboren immuuncellen is nog steeds slecht begrepen, vooral omdat aangeboren immuuncel gedrag is voornamelijk afgeleid van histologische analyse of gekweekte cellen in vitro. Daarom zal het vaststellen van een transparant zebravismodel om de aangeboren immuunrespons op C. difficile binnenkant van een levend gewerveld organisme aan het licht te brengen, dergelijke studies vergemakkelijken. Zebravissen larven hebben een functioneel aangeboren immuunsysteem, maar ze missen het adaptieve immuunsysteem tot 4-6 weken na de bevruchting9. Deze unieke functie maakt zebravissenlarven een uitstekend model om de geïsoleerde respons en functie van aangeboren immuuncellen in CDI te bestuderen.
Dit rapport beschrijft nieuwe methoden met behulp van zebravissen larven om de interacties tussen C. difficile en aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen te bestuderen. Ten eerste wordt een gelokaliseerd micro-injectieprotocol gepresenteerd dat C. difficile inoculum en kleuring omvat. Met behulp van in vivo confocale time-lapse beeldvorming wordt de respons van neutrofielen en macrofagen op de infectieplaats geregistreerd en wordt de fagocytose van bacteriën door neutrofielen en macrofagen waargenomen. Er is echter gemeld dat de injectie zelf weefselschade veroorzaakt en leidt tot de aanwerving van leukocyten onafhankelijk van de bacterie10. Daarom wordt vervolgens een niet-invasief microgavageprotocol beschreven om C. difficile in de darm van zebravissenlarven te leveren. Eerdere studies hebben aangetoond dat inheemse gastro-intestinale microbiota een gastheer te beschermen tegen de kolonisatie van C. difficile11. Daarom worden gnotoötische zebravissenlarven ook gebruikt om de zebravis die besmet zijn 12vatbaar te maken. Daarna wordt darmdissectie uitgevoerd om levensvatbare C. difficile te herstellen en de duur van hun aanwezigheid in zebravissen darmkanaal te valideren.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2576</td><td>Ultra-low gelling agarose</td></tr><tr><td>Agarose low-melting (LM)</td><td>Pronadisa</td><td>8050</td><td>Het wordt gebruikt in agarose platen</td></tr><tr><td>BacLight Red Bacterial Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B35001</td><td>Fluorescente kleurstof</td></tr><tr><td>Brain-Heart-Infusion Broth</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>X916.1</td><td></td></tr><tr><td>Brass (wild-type)</td><td></td><td></td><td>deficiënt in melaninesynthese, gebruikt om stabiele transgene lijnen te genereren</td></tr><tr><td>Calcium nitrate (Ca(NO3)2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0019</td><td>Injectienaalden</td></tr><tr><td>Clostridioides difficile</td><td></td><td></td><td>R20291,, een ribotype 027 stam, TcdA+/TcdB+/CDT+ productie</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>A994</td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td>open-source platform</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>6763</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal needle puller</td><td>Sutter instrument Inc</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>Leica Application Suite X (LAS X)</td><td>Leica</td><td></td><td>Beeldverwerking</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate (MgSO4)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>P026</td><td></td></tr><tr><td>Micro injector</td><td>eppendorf</td><td>5253000017</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection molds</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>5346</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>8149</td><td></td></tr><tr><td>Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>stabiele transgene lijn waarin de lyZ promotoren de expressie van EGFP fluorescent eiwit in neutrofielen aansturen</td></tr><tr><td>Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3</td><td></td><td></td><td>stabiele transgene lijn waarin de mpeg1.1 de expressie van EGFP fluorescent eiwit in macrofagen aansturen</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

ontwikkeling van een larval zebrafish infection model voor clostridioides difficile

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infectie (CDI) wordt beschouwd als een van de meest voorkomende gezondheidszorg-geassocieerde gastro-intestinale infecties in de Verenigde Staten. De aangeboren immuunrespons tegen C. difficile is beschreven, maar de exacte rollen van neutrofielen en macrofagen in CDI zijn minder begrepen. In de huidige studie worden Danio rerio (zebravissen) larven gebruikt om een C. difficile infectiemodel vast te stellen voor beeldvorming van het gedrag en de samenwerking van deze aangeboren immuuncellen in vivo. Om C. difficilete controleren, is een etiketteringsprotocol met behulp van een fluorescerende kleurstof ingesteld. Een gelokaliseerde infectie wordt bereikt door micro-injecting gelabeld C. difficile, die actief groeit in de zebravissen darmkanaal en bootst de darmepitheel schade in CDI. Echter, dit directe infectie protocol is invasief en veroorzaakt microscopische wonden, die experimentele resultaten kunnen beïnvloeden. Daarom wordt hier een meer niet-invasief microgavageprotocol beschreven. De methode omvat de levering van C. difficile cellen rechtstreeks in de darm van zebravissen larven door intubatie via de open mond. Deze infectie methode bootst nauw de natuurlijke infectie route van C. difficile.

C. difficile is strikt anaeroob, maar de chromofhore van fluorescerende eiwitten vereist meestal zuurstof om te rijpen. Om dit probleem te overwinnen, werd een fluorescerende kleurstof gebruikt om levende C. difficile cellen die actief groeiden vlekken (R20291, een ribotype 027 stam; Figuur 1A). Met behulp van het Gal4/UAS-systeem werden stabiele transgene zebravislijnen gegenereerd voor live beeldvorming, waarbij de mpeg1.1- of lyZ-promotors</...

Hier gepresenteerd is een veilige en effectieve methode om zebravissen larven te infecteren met fluorescerend gelabeldanaërobe C. difficile door micro-injectie en niet-invasieve microgavage.

Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

Deze methode kan antwoord geven op de belangrijkste vraag over de rol van aangeboren immuunsysteem in de Clostridium-infectie, zoals of en hoe macrofagen deze ziekteverwekker herkennen of phgocytose. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het kan worden toegepast op veel verschillende anaërobe bacteriën, dat de infectie tijd kan worden gemanipuleerd, en dat orale toediening vertegenwoordigt de normale menselijke infectie veel dichterbij. Breng na het kweken een milliliter van de cultuur over in een spectrofotometer cuvette en meet de OD600.Breng het benodigde bedrag over in een verse buis van 1,5 milliliter om een laatste OD van 1 tot 1,2 in één milliliter eindvolume te bereiken. Was één keer met één milliliter 1X PBS en centrifuge drie minuten lang op kamertemperatuur op 5.000 g. Resuspend in een milliliter van 1X PBS.Voeg drie microliter werkoplossing van de voorbereide fluorescerende kleurstof toe aan de bacteriële suspensie van één milliliter. Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Daarna, was de gekleurde Clostridioides difficile eenmaal met 1X PBS om resterende kleurstof te verwijderen, en resuspend in een milliliter van 1X PBS om een OD600 van 1.0 te bereiken.Plaats eerst een druppel van 0,8%laag smeltende agarose op de zebravislarven in een petrischaaltje om te bedekken. Pas de larven voorzichtig aan een zijdelingse positie aan. Plaats de petrischaal 30 tot 60 seconden op ijs zodat de laagsmeltende agarose kan stollen.Voeg 30% Danieau's medium met 0,02% tot 0,04% tricaine toe om de agarose te dekken. Om injectieoplossing voor te bereiden, voeg een microliter van 0,5% fenolrood in PBS-oplossing toe in negen microliter van de met kleurstof bevlekte Clostridioides difficile entmateriaal. Laad een gekalibreerde microinjectienaald met de injectieoplossing met behulp van een Microloader.Monteer de geladen naald in een micromanipulator en plaats deze onder een stereomicroscoop. Pas de injectiedruk aan tussen 600 en 900 hectopascals. Stel de injectietijd in op 0,1 op 0,3 seconden om 0,5 tot 1,0 nanoliter te verkrijgen.Plaats de naald in de micromanipulator in een hoek van ongeveer 45 graden, wijzend naar de ingebedde larven. Plaats de naaldpunt boven het maag-darmkanaal, dicht bij de urogenitale porie. Doorboor door de agarose, dan is de spier met de naald tip.Steek het vervolgens in het darmlumen en injecteer 0,5 tot 1,0 nanoliter clostridioides difficile. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de geïnjecteerde larven te monitoren en gebruik een flexibele microloadertip om de goed geïnjecteerde larven op te pikken voor confocale beeldvorming. In een 1,5%agarose plaat met groeven, plaats een daling van 0,8%laag smeltende agarose op de zebravis larven te dekken.Stel de larven voorzichtig aan met koppen rechtop gericht onder hoeken van 45 graden in de groef en staarten tegen de wand van de groef. Bedien de naald voorzichtig door de agarose, vervolgens in de mond van zebravislarven, door de slokdarm. Zodra de punt van de naald is in de voorste darmlamp, druk op de injectie pedaal om 0,5 release tot een nanoliter van bacteriën cultuur.Vul het lumen van de darm. Laat het niet overlopen van de slokdarm of cloaca. Trek voorzichtig de naald uit de mond van de zebravis.Na gavage, red de geïnfecteerde zebravislarven uit de agarose met een flexibele Microloader-tip door eerst de agarose weg te snijden, dan door de larven op te tillen. Breng deze larven over in het medium van 30% Danieau en spoel twee keer af. Voeg na het verdoven van de zebravissenlarven 200 tot 300 microliters van 1%laag smeltende agarose toe om de verdoofde larven te bedekken.Plaats het besmette gebied van de larven zo dicht mogelijk tegen een glazen glijbaan. Laat de agarose stollen op ijs voor 30 tot 60 seconden. Dompel de agarose onder in 30%Danieau's medium met 0,02% tot 0,04%tricaine.Ga over tot het beeld van de larven met een confocale laser scanning microscoop. Na het euthanaseren van de geïnfecteerde zebravislarven, steek een naald in de rugstam van zebravislarven dicht bij het hoofd om de zebravis te immobiliseren. Verwijder het hoofd achter de kieuwen met een lancet.Steek een tweede naald in het midden van de rugboomstam. Steek een derde naald in de buik van de zebravis, en trek de darm uit de lichaamsholte. Gebruik een microinjectienaald om 10 tot 15 darmen over te brengen in een buis van 1,5 milliliter met 200 microliter steriele 1X PBS.Homogeniseer de darmen met een stamper om het weefsel te verstoren en homogenaten voor te bereiden. Zorg ervoor dat de stamper de bodem van de buis bereikt om alle darmen volledig te verstoren. Voeg in de homogenaten Clostridioides difficile opfokmedium toe dat D-cycloserine en cefoxitine bevat, met of zonder taurocholaat, en incubeer in een anaerobe kamer.In deze studie bereiken zowel neutrofielen als macrofagen de infectielocaties. Het voorbeeld van een geactiveerde macrofaag fagocytizing twee bacteriën toont de clearing door fagocytose en de spijsvertering van de gelabelde Clostridioides difficile. De microgavage om fluorescentie-gelabelde Clostridioides difficile leveren in het darmlumen van macrofaag en neutrofiele reporter lijnen op vijf dagen na de bevruchting bootst het natuurlijke pad van Clostridioides difficile infectie.Echter, neutrofielen en macrofagen niet duidelijk migratie naar het maag-darmkanaal voor maximaal 12 uur na microgavage. In de tussentijd, fluorescentie van de gelabelde Clostridioides difficile verdwenen na ongeveer vijf uur post-microgavage. Darmmonsters 24 uur na infectie werden ontleed en toonden bacteriële groei.Er groeiden geen bacteriën in de controlegroep. Op latere punten groeiden geïncubeerde monsters alleen in het medium met TCA, wat suggereert dat de totale Clostridioides difficile in de darm sporen had gevormd. 16S rDNA PCR identificeerde de gekweekte bacterie als Clostridioides difficile, die specifieke PCR amplicons van voorspelbare grootte rond 800 basisparen produceren.De culturen die van de bacteriën op een CHROMIDplaat worden gekweekt verschenen als typische zwarte kolonies, die verder wezen erop dat de bacteriën van de zebravisd darmen Clostridioides difficile waren. Werken met anaërobe bacteriën vereist dat de aërobe stappen kort worden gehouden, want dat beïnvloedt de biologie van de bacteriën natuurlijk. Aangeboren immuuncel in zebravissen kan worden gemanipuleerd.Ze kunnen bijvoorbeeld het mechanisme van de aangeboren immuuncelreacties op de infectie ontcijferen. Onze methode gaf aan dat zebravissen een hulpmiddel kunnen zijn om anaerobe pathogene uit menselijke darmen te bestuderen. Het werken met multiresistente ziekteverwekkers vereist dat passende veiligheidsmaatregelen worden genomen.

development-larval-zebrafish-infection-model-for-clostridioides

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

De snelle ontwikkeling, de kleine oppervlakte en de transparantie van de zebravis zijn enorme voordelen voor de studie van aangeboren immuunsysteem controle op...

Niet-invasieve beeldvorming van gedissemineerde candidiasis in de zebravis Larven

Source: Li, J. et al. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the microinjection-based delivery of fluorescently labeled Clostridioides difficile into the intestinal lumen of an anesthetized zebrafish larva. It outlines the steps involved in larval preparation, bacterial injection, and fluorescence microscopy–based confirmation of bacterial localization within the intestine.

Localized Delivery of Bacteria into the Intestinal Lumen of a Zebrafish Larva Using Microinjection

Source: Li, J., et. al., Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation and culturing of Clostridioides difficile bacteria from the intestine of larval zebrafish. The infected intestine is dissected, homogenized, and incubated in selective anaerobic media containing antibiotics. These conditions suppress competing microbes and promote the growth of viable cells.

Isolation and Culture of Clostridioides difficile Bacteria from Larval Zebrafish Intestine

Source: Flores, E., et al. Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the method of establishing a foodborne bacterial intestinal infection model in zebrafish larvae by feeding them paramecia infected with fluorescent E. coli.

Modeling Intestinal Infection in Zebrafish Larvae Using Foodborne Bacteria

Source: Winston, J. A., et al. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the procedure for inoculating antibiotic-pretreated mice with Clostridium difficile spores to establish a murine model of infection for studying pathogenesis and host responses.

Establishing a Mouse Model of Clostridium difficile Infection

Source: Li, J., et al. Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the microgavage procedure, where an anesthetized zebrafish larva is immobilized in agarose and orally injected with a pathogenic bacterium using a tracer-guided needle. The non-invasive delivery mimics natural infection, enabling analysis of bacterial replication, toxin release, and intestinal epithelial damage.

Development of a Zebrafish Larval Infection Model Using Microgavage

In vivo ruimte-tijdelijke interacties van pathogeen en immuunafweer op het mucosale niveau zijn niet gemakkelijk in beeld te brengen in bestaande gewervelde gastheren. De hier gepresenteerde methode beschrijft een veelzijdig platform om mucosale candidiasis bij levende gewervelden te bestuderen door gebruik te maken van de zwemblaas van de juveniele zebravis als een infectieplaats.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Optisch transparante zebravis embryo's worden veel gebruikt om in realtime de interacties tussen pathogene micro-organismen en de aangeboren immuuncellen te bestuderen en te visualiseren. Micro-injectie van Mycobacterium abscessus, gecombineerd met fluorescentiebeeldvorming, wordt gebruikt om essentiële pathogene kenmerken zoals koordvorming in zebravis embryo's te onderzoeken.

Ontcijferen en Imaging Pathogenese en Cording van<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In zebravis embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft de cefoperazon muismodel van Clostridium difficile infectie (CDI) met een klinisch relevante en genetisch handelbaar stam, R20291. Nadruk op klinische ziekte monitoring, C. difficile bacteriële opsomming, toxine cytotoxiciteit en histopathologische veranderingen in heel CDI in een muismodel worden beschreven in het protocol.

-Cefoperazone behandelde muismodel van klinisch relevante<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; Strain R20291

De huidige studie beschrijft een zebravis embryo model voor in vivo visualisatie en intravital analyse van biomaterial-geassocieerde infectie na verloop van tijd op basis van fluorescentie microscopie. Dit model is een veelbelovende aanvulling op zoogdieren dierlijke modellen zoals Muismodellen voor het bestuderen van de biomaterial-geassocieerde infecties in vivo.

Een zebravis Embryo Model voor In Vivo visualisatie en Intravital analyse van Biomaterial-geassocieerde goudhoudende Stafylokok infectie

Leer een veilig infectiemodel voor Clostridioides difficile in zebrafishlarven via microinjectie en microgavage. Deze methode maakt real-time studie van de aangeboren immuunrespons tegen anaerobe pathogenen mogelijk.

Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Meer video's verkennen