Ontwikkeling van een Larval Zebrafish Infection Model voor Clostridioides difficile

Deze methode kan antwoord geven op de belangrijkste vraag over de rol van aangeboren immuunsysteem in de Clostridium-infectie, zoals of en hoe macrofagen deze ziekteverwekker herkennen of phgocytose. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het kan worden toegepast op veel verschillende anaërobe bacteriën, dat de infectie tijd kan worden gemanipuleerd, en dat orale toediening vertegenwoordigt de normale menselijke infectie veel dichterbij. Breng na het kweken een milliliter van de cultuur over in een spectrofotometer cuvette en meet de OD600.

Breng het benodigde bedrag over in een verse buis van 1,5 milliliter om een laatste OD van 1 tot 1,2 in één milliliter eindvolume te bereiken. Was één keer met één milliliter 1X PBS en centrifuge drie minuten lang op kamertemperatuur op 5.000 g. Resuspend in een milliliter van 1X PBS.

Voeg drie microliter werkoplossing van de voorbereide fluorescerende kleurstof toe aan de bacteriële suspensie van één milliliter. Incubeer het monster gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Daarna, was de gekleurde Clostridioides difficile eenmaal met 1X PBS om resterende kleurstof te verwijderen, en resuspend in een milliliter van 1X PBS om een OD600 van 1.0 te bereiken.

Plaats eerst een druppel van 0,8%laag smeltende agarose op de zebravislarven in een petrischaaltje om te bedekken. Pas de larven voorzichtig aan een zijdelingse positie aan. Plaats de petrischaal 30 tot 60 seconden op ijs zodat de laagsmeltende agarose kan stollen.

Voeg 30% Danieau's medium met 0,02% tot 0,04% tricaine toe om de agarose te dekken. Om injectieoplossing voor te bereiden, voeg een microliter van 0,5% fenolrood in PBS-oplossing toe in negen microliter van de met kleurstof bevlekte Clostridioides difficile entmateriaal. Laad een gekalibreerde microinjectienaald met de injectieoplossing met behulp van een Microloader.

Monteer de geladen naald in een micromanipulator en plaats deze onder een stereomicroscoop. Pas de injectiedruk aan tussen 600 en 900 hectopascals. Stel de injectietijd in op 0,1 op 0,3 seconden om 0,5 tot 1,0 nanoliter te verkrijgen.

Plaats de naald in de micromanipulator in een hoek van ongeveer 45 graden, wijzend naar de ingebedde larven. Plaats de naaldpunt boven het maag-darmkanaal, dicht bij de urogenitale porie. Doorboor door de agarose, dan is de spier met de naald tip.

Steek het vervolgens in het darmlumen en injecteer 0,5 tot 1,0 nanoliter clostridioides difficile. Gebruik een fluorescentiemicroscoop om de geïnjecteerde larven te monitoren en gebruik een flexibele microloadertip om de goed geïnjecteerde larven op te pikken voor confocale beeldvorming. In een 1,5%agarose plaat met groeven, plaats een daling van 0,8%laag smeltende agarose op de zebravis larven te dekken.

Stel de larven voorzichtig aan met koppen rechtop gericht onder hoeken van 45 graden in de groef en staarten tegen de wand van de groef. Bedien de naald voorzichtig door de agarose, vervolgens in de mond van zebravislarven, door de slokdarm. Zodra de punt van de naald is in de voorste darmlamp, druk op de injectie pedaal om 0,5 release tot een nanoliter van bacteriën cultuur.

Vul het lumen van de darm. Laat het niet overlopen van de slokdarm of cloaca. Trek voorzichtig de naald uit de mond van de zebravis.

Na gavage, red de geïnfecteerde zebravislarven uit de agarose met een flexibele Microloader-tip door eerst de agarose weg te snijden, dan door de larven op te tillen. Breng deze larven over in het medium van 30% Danieau en spoel twee keer af. Voeg na het verdoven van de zebravissenlarven 200 tot 300 microliters van 1%laag smeltende agarose toe om de verdoofde larven te bedekken.

Plaats het besmette gebied van de larven zo dicht mogelijk tegen een glazen glijbaan. Laat de agarose stollen op ijs voor 30 tot 60 seconden. Dompel de agarose onder in 30%Danieau's medium met 0,02% tot 0,04%tricaine.

Ga over tot het beeld van de larven met een confocale laser scanning microscoop. Na het euthanaseren van de geïnfecteerde zebravislarven, steek een naald in de rugstam van zebravislarven dicht bij het hoofd om de zebravis te immobiliseren. Verwijder het hoofd achter de kieuwen met een lancet.

Steek een tweede naald in het midden van de rugboomstam. Steek een derde naald in de buik van de zebravis, en trek de darm uit de lichaamsholte. Gebruik een microinjectienaald om 10 tot 15 darmen over te brengen in een buis van 1,5 milliliter met 200 microliter steriele 1X PBS.

Homogeniseer de darmen met een stamper om het weefsel te verstoren en homogenaten voor te bereiden. Zorg ervoor dat de stamper de bodem van de buis bereikt om alle darmen volledig te verstoren. Voeg in de homogenaten Clostridioides difficile opfokmedium toe dat D-cycloserine en cefoxitine bevat, met of zonder taurocholaat, en incubeer in een anaerobe kamer.

In deze studie bereiken zowel neutrofielen als macrofagen de infectielocaties. Het voorbeeld van een geactiveerde macrofaag fagocytizing twee bacteriën toont de clearing door fagocytose en de spijsvertering van de gelabelde Clostridioides difficile. De microgavage om fluorescentie-gelabelde Clostridioides difficile leveren in het darmlumen van macrofaag en neutrofiele reporter lijnen op vijf dagen na de bevruchting bootst het natuurlijke pad van Clostridioides difficile infectie.

Echter, neutrofielen en macrofagen niet duidelijk migratie naar het maag-darmkanaal voor maximaal 12 uur na microgavage. In de tussentijd, fluorescentie van de gelabelde Clostridioides difficile verdwenen na ongeveer vijf uur post-microgavage. Darmmonsters 24 uur na infectie werden ontleed en toonden bacteriële groei.

Er groeiden geen bacteriën in de controlegroep. Op latere punten groeiden geïncubeerde monsters alleen in het medium met TCA, wat suggereert dat de totale Clostridioides difficile in de darm sporen had gevormd. 16S rDNA PCR identificeerde de gekweekte bacterie als Clostridioides difficile, die specifieke PCR amplicons van voorspelbare grootte rond 800 basisparen produceren.

De culturen die van de bacteriën op een CHROMIDplaat worden gekweekt verschenen als typische zwarte kolonies, die verder wezen erop dat de bacteriën van de zebravisd darmen Clostridioides difficile waren. Werken met anaërobe bacteriën vereist dat de aërobe stappen kort worden gehouden, want dat beïnvloedt de biologie van de bacteriën natuurlijk. Aangeboren immuuncel in zebravissen kan worden gemanipuleerd.

Ze kunnen bijvoorbeeld het mechanisme van de aangeboren immuuncelreacties op de infectie ontcijferen. Onze methode gaf aan dat zebravissen een hulpmiddel kunnen zijn om anaerobe pathogene uit menselijke darmen te bestuderen. Het werken met multiresistente ziekteverwekkers vereist dat passende veiligheidsmaatregelen worden genomen.