Visualisatie en analyse van faryngeale boogslagaders met behulp van Whole-mount Immunohistochemie en 3D Reconstructie

Met deze methode kan elke faryngeale boog worden gecompartimenteerd. Endotheelcelnummers kunnen dan in elke boog worden gekwantificeerd als een middel om de ontwikkeling van de faryngeale boogslagader te bestuderen. De belangrijkste voordelen van deze aanpak zijn het vermogen om de relatie tussen verschillende vasculaire structuren te visualiseren en het vermogen om kwantitatief te bepalen hoe de structuren de mutanten beïnvloedden.

Aorta boog slagaders worden vaak gemuteerd in aangeboren hart-en vaatziekten. Onze methode maakt het mogelijk om te bestuderen hoe mutaties het fysiologische proces van vaatvorming en remodellering veranderen. Hoewel we deze methode gebruiken om inzicht te krijgen in de mechanismen van aangeboren hartziekten, kan het worden toegepast op andere systemen, met name met de komst van lichtbladige microscopie.

Begin met het gebruik van een glazen pipet om elke embryonale dag 9.5 of 10.5 embryo over te brengen in individuele twee milliliter buizen met één milliliter PBS. Gebruik na fixatie fijne tangen om het embryo voorzichtig net boven de achterpoot te knijpen en een dwarse snede te maken om de achterste helft van het embryo te verwijderen. Om de embryo's te doordrenken, vervang de PBS door PBST en plaats de embryo's op vier graden Celsius met zachte agitatie 's nachts.

De volgende dag, vervang de PBST met 600 microliters van het blokkeren buffer zonder het aanraken van de embryo's voor een 16 tot 18-uur incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie. De volgende ochtend, vervang de blokkerende buffer met 600 microliters van het primaire antilichaam van belang per buis voor een vier tot vijf-daagse incubatie bij vier graden Celsius met zachte agitatie. Aan het einde van de incubatie, was de embryo's in een milliliter PBST gedurende vier tot vijf uur met zachte agitatie bij kamertemperatuur het veranderen van de PBS elk uur, gevolgd door een nachtelijke incubatie in verse PBST op vier graden Celsius en vier tot vijf extra een uur wast de volgende dag.

Vervang na de laatste wasbeurt de PBST in elke buis door 600 microliters van de juiste secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van vier tot vijf dagen bij vier graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de embryo's in een milliliter verse PBST per was, zoals net aangetoond en gebruik een glazen pipet om elk embryo voorzichtig over te brengen in individuele plastic paraffinemallen. Verwijder zorgvuldig elke PBST uit elk embryo en oriënteer elk embryo in een sagittale positie.

Voeg dan snel ongeveer 500 microliters van hete agarose aan elke mal toe tot elk embryo enkel wordt behandeld en plaats de vormen op ijs dat met aluminiumfolie wordt behandeld tot agarose is gestold. Voor uitdroging van de embryonale monsters, gebruik een schone scalpel om een blok agarose rond elk embryo te snijden en gebruik tangen om de agarose te grijpen voor overdracht in een gelabelde twee milliliter buis met een milliliter van 25%methanol. Na een incubatie van een uur met zachte agitatie in het donker, vervang 25% methanol door een milliliter van 50% methanol per buis voor een extra incubatie van een uur in het donker.

Na het einde van de uitdroging, vervang de 100% methanol met een milliliter van 50%BABB voor een incubatie van een uur met zachte agitatie in het donker. Vervang aan het einde van de incubatie de 50%BABB door één milliliter van 100%BABB per buis voor een incubatie van een uur met zachte agitatie in het donker, gevolgd door een tweede incubatie met 100%BABB zoals net aangetoond. Om de embryo's te monteren voor beeldvorming, verwijder de lijm uit een snelle goed bumper en plaats de bumper op een 24 bij zes milliliter nummer 1.5 glazen coverslip.

Breng zachte druk op de lijm om eventuele luchtbellen tussen de coverslip en de bumper te verwijderen en gooi de 100%BABB voorzichtig uit elke buis. Gebruik vervolgens fijne tangen om het embryo zorgvuldig over te brengen in de snelle put zonder het embryo aan te raken en plaats een tweede coverlip op de bumper. Om het endotheel in de gehele derde faryngeale boog aan de oppervlakte te brengen, opent u het beeld van interesse in de software en klikt u op het toevoegen van een nieuw oppervlak.

Dubbelklik op oppervlak één en hernoemen het nieuwe oppervlak naar de derde faryngeale boog. Selecteer automatisch maken overslaan, bewerk handmatig en stel de oppervlakteoriëntatie in op het YZ-vlak. Gebruik de slicepositie om het derde faryngeale boogvlak te plaatsen waar de derde PAA en rugaorta met elkaar verbonden zijn.

Draai de afbeelding zo dat het derde faryngeale boogvlak in beeld is en schakel de orthosnijmachine uit. Selecteer onder de tekencontourmodus de functie afstandstekenmodus en pas de parameterinstellingen zo nodig aan. Wanneer alle parameters zijn ingesteld, drukt u op de Escape-toets en klikt u op tekenen om de omtrek van de derde faryngeale boog te traceren met de muiscursor.

Gebruik vervolgens de slicepositie om 10 tot 25 plakjes te verplaatsen en de omtrek van de keelholteboog te traceren. Wanneer de hele boog is getraceerd, klikt u op oppervlak maken om het oppervlak van het getraceerde gebied te genereren. Selecteer in het bewerkingsmenu de selectie van maskeren voor de derde PAA en DAPI en klik op OK voor het maskeren van de opgedoken structuren. Wijzig vervolgens de naam van het nieuwe kanaal als PAA DAPI.

Herhaal deze stap voor de overige kanalen. Als u de endotheelplexus afzonderlijk van de PAA wilt visualiseren, selecteert u maskerselectie voor de derde PAA en selecteert u DAPI. Schakel de optie selecteer voxels buitenoppervlak uit en controleer selecteer voxels binnenoppervlak aan.

Stel geselecteerde voxels binnenoppervlak op nul en klik op OK. Wijzig de naam van het nieuwe kanaal als niet-PAA DAPI. Herhaal deze stap voor de overige kanalen. Selecteer maskerselectie voor de derde PA en selecteer niet-PAA DAPI en klik op OK. Wijzig de naam van het nieuwe kanaal als plexus DAPI.

Herhaal deze stap voor de overige kanalen. Als u de afzonderlijke endotheelcellen binnen elke interessestructuur wilt kwantificeren, schakelt u in het deelvenster weergaveaanpassingen alle kanalen uit, behalve het PAA ERG-kanaal. Klik onder het eigenschappenmenu op Nieuwe plekken toevoegen en klik om de naam van een AANTAL ENdotheelcellen van paa's te wijzigen.

Klik op de blauwe pijl en selecteer het PAA ERG-kanaal voor het bronkanaal. Pas de geschatte XY-diameter aan op vier micrometer en klik op de blauwe pijl om door te gaan naar het volgende deelvenster. Gebruik de glijdende schaal om het aantal vlekken aan te passen om ervoor te zorgen dat elke ERG positieve endotheelcelkern wordt vertegenwoordigd door één plek.

Klik vervolgens op de groene dubbele pijl en schakel het PAA ERG-kanaal uit in het deelvenster Weergaveaanpassing. Schakel het PAA VEGFR2-kanaal in om het PAA-endotheel te visualiseren en klik op bewerken en toevoegen/verwijderen om het oppervlak van het object te selecteren. Druk vervolgens op Escape en houd Shift ingedrukt om plekken te verwijderen die niet VEGFR2-positief zijn en klik op het tabblad statistieken om het totale aantal endotheelcellen te bepalen.

Hele mount immunofluorescentie produceert duidelijke en schone resultaten waardoor de 3D reconstructie van de keelholte boog endotheel. In dit beeld is de aanwezigheid van de grote heldere stippen het resultaat van deeltjes in het antilichaam of het blokkeren van bufferoplossingen. Na faryngeale boog en PAA oppervlakte vlekken, gebruik van het masker functie maakt het mogelijk de oppervlakte gebieden visueel worden gescheiden en onafhankelijk geanalyseerd.

Maskeren maakt het ook mogelijk de individuele analyse en kwantificering van endotheelcelnummers binnen elke structuur. Hier werd bijvoorbeeld de spotfunctie gebruikt om het totale aantal endotheelcellen in zowel de PAA als de plexus te kwantificeren door één plek toe te wijzen voor elke kern die ERG uitdrukt. In deze afbeelding kan een ERG positieve VEGFR2 negatieve plek worden waargenomen die is gegenereerd door de spotfunctie.

Daarom is het essentieel om te controleren of elke stip die door de software wordt herkend, eigenlijk een enkele endotheelcel vertegenwoordigt. Om schone en duidelijke beelden te verkrijgen, vergeet niet om alle oplossingen te draaien en elk embryo goed en grondig te wassen na antilichaam incubaties. Het is belangrijk om te onthouden dat BABB corrosief en giftig is.

Behandel en gooi het oplosmiddel goed weg en zorg ervoor dat u de gesmolten embryo's volledig afsluit om BABB-lekkage te voorkomen.