Hoge nauwkeurigheid correctie van 3D Chromatische verschuivingen in het tijdperk van super-resolutie biologische beeldvorming met behulp van Chromagnon

Marsh koraal microscopie beelden bevatten Chromatic Shift in drie dimensies. Dat schaadt de colocalisatie-analyse van beelden met hoge resolutie. Het is over het algemeen moeilijk om Chromatic Shift afkomstig van een biologisch monster zelf te verwijderen, onze methode kan chromatische verschuiving in een biologisch monster corrigeren met behulp van afzonderlijk verworven referentiebeelden.

Het aantonen van de procedure zal Takako Koujin een technicus van mijn groep. Begin met het zaaien van 2,5 keer 10 tot de vijfde genezer cellen op een 35 millimeter glazen bodem schotel en groeien ze in een koolstofdioxide incubator. Na 24 uur incubatie vervang het medium door twee milliliter van 3,7% formaldehyde in PBS en meng zachtjes.

Bevestig de verkoop gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur op een roterend platform. Was de cellen drie keer met twee milliliter PBS gedurende vijf tot tien minuten. Permeabiliseren ze met twee milliliter van punt 1%probeer de volgende 100 in PBS tijdens het draaien en herhaal de wasbeurten met PBS.

Bevlek vervolgens de cellen met behulp van een standaard antilichaam kleuring protocol zoals beschreven in de tekst manuscript. Om een referentiebeeld van crosstalk referentie voor widefield microscopie te verkrijgen, voeg twee milliliter van punt vijf microgram per milliliter Dappy om te verblijven in het DNA. Laat de cellen 30 minuten op het roterende platform staan.

Vervang vervolgens de oplossing door 100 microliters van montagemedium Om een referentiebeeld te verkrijgen van biologische kalibratiereferentie voor elke vorm van microscopie, inclusief confocale en superresolutie microscopie. Fix de cellen zoals eerder beschreven, en bereid de voorraad oplossing een fluorescerende kleurstof geconjugeerde phalloïdine in 1,5 milliliter methanol. Voeg de phalloidin in PBS bij een verdunning van een tot 100 voor Alexa vloer 405 een tot 1000 voor Alexa vloer 488 en een tot 200 voor Alexa vloer 594.

Voeg een milliliter van de oplossing aan de cellen en uitbroed ze gedurende 30 minuten tijdens het draaien. Was de cellen drie tot vijf keer met twee milliliter PBS. Vervang vervolgens de PBS door 100 microliter montagemedium.

Om fluorescentiebeelden te verkrijgen met behulp van widefield microscopie plaats het doelmonster op de microscoop in de beeldsoftware, open het ontwerp en voer experiment venster, stel de juiste Z stap en selecteer de blauwe, groene en rode kanalen. Voeg op het tabblad Uitvoeren de naam van het afbeeldingsbestand toe en begin met beeldvorming. Als u kruistalkreferentiebeelden wilt verkrijgen voor het meten van Chromatische verschuivingen in het monster, selecteert u alleen het excitatielicht voor Dappy en gebruikt u exact dezelfde fasepositie en Z-hoogte als voor het doelmonster.

U ook een helder veldbeeld gebruiken als referentieplaats naar het doelmonster op de brede veldmicroscoop en een fluorescentiebeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen verwerven. Verwerf vervolgens heldere veldbeelden van het doel in blauwe, groene en rode kanalen in exact dezelfde fasepositie en met dezelfde Z-hoogte. Om fluorescentiebeelden te verkrijgen met behulp van microscopie met superresolutie, zoals 3D Sim, plaats het doelmonster op de microscoop en krijgt u een fluorescentiesimbeeld van het doel in blauwe, groene en rode kanalen.

Reconstrueren vervolgens de super opgeloste afbeelding. Plaats vervolgens het monster vlek met veelkleurige phalloidin op een 3D sim microscoop. En het verwerven van meerdere fluorescentie sim beelden als de biologische kalibratie referentie beelden in punt fase posities, dan reconstrueren de super opgeloste beelden.

Gebruik een webbrowser om de nieuwste binaire release van Chromagnon te downloaden. Haal het programma eruit en plaats het uitvoerbare bestand op een handige locatie. Sleep en drop de referentiebestanden van het rechterveld crosstalk of biologische kalibratieverwijzingen naar het referentievak of klik op referentiebestanden om een dialoogvenster voor bestandskiezer te openen.

Als het programma vraagt om een Java Development Kit te installeren, drukt u op Ja en navigeert u naar de gedownloade pagina. Download en installeer vervolgens de JDK voor het besturingssysteem zoals geïnstrueerd. Sleep en laat de doelbestanden van antilichaamvlekken in de doeldoos vallen.

Kies een uitvoerafbeeldingsindeling en geef het achtervoegsel op voor de uitvoerbestandsnaam. Voor crosstalk referentiebeelden met een hoge signaal-ruisverhouding. Kies projectie uit de keuzelijst van lokaal uitlijnen en gebruik een minimale venstergrootte van 60.

Controleer voor een meervoudig biologisch kalibratiereferentieafbeeldingen de optie gemiddelde verwijzingen En kies er geen voor lokaal uitlijnen en klik vervolgens op alles uitvoeren om metingen te starten. Als u ervoor wilt zorgen dat de meting correct is uitgevoerd, sleept en zet u de referentieafbeeldingen in het referentievak en het doelvak. Voer vervolgens het programma uit en controleer of de afbeeldingen perfect overlappen.

Chromatische Shift Correctie in widefield microscopie kan worden uitgevoerd met behulp van een crosstalk referentieafbeelding. Dit beeld werd verkregen met een breedveldmicroscoop die met één enkele camera wordt uitgerust. Fluorescentie-emissie van Dappy werd gebruikt als een verwijzing naar de blauwe, groene en rode kanalen te corrigeren.

Na uitlijning met Chromagnon werd de Chromatische Verschuiving en het referentiebeeld gecorrigeerd. Wanneer de uitlijningsparameter door Chromagnon op het doelbeeld werd toegepast, worden het DNA en de anafasebrug, die verkeerd buiten de nucleaire envelop wordt gezien voordat de uitlijning in de envelop wordt weergegeven, verkeerd weergegeven. Chromatische Shift Correctie van een 3D sim afbeelding kan worden uitgevoerd met behulp van een biologische kalibratie referentieafbeelding.

Drie 3D sim beelden van HeLa cellen bevlekt met phalloidins vervoegd aan blauwe, groene en rode kleurstoffen werden veredolen en de Chromatische Verschuiving werd gemeten door Chromagnon. Na uitlijning werd de Chromatische Shift en de referentieafbeelding gecorrigeerd. De uitlijnparameter is toegepast op een doelafbeelding.

De XZ-weergave toont een onjuiste kanaalpositie langs de Z en iets langs de X-richtingen, die na uitlijning zijn gecorrigeerd. Voor de beste prestaties is het belangrijk om referentiebeelden te verkrijgen onder dezelfde omstandigheden en de timing als een doelafbeeldingen.