Kraaktemporale parameters van cellulaire exocytose in micropatterned cellen kwantificeren

Dit protocol laat zien hoe celsecretie te onderzoeken met behulp van live imaging door TOF-microscopie en biedt tools voor het detecteren van clustergebeurtenissen of regio's met een hoge activiteit. Met behulp van dit protocol kunnen we celculturen genereren op micropatronen die de celdeling normaliseren en zo de speciale reeksen secretoire gebeurtenissen vergemakkelijken. Cellen scheiden een verscheidenheid aan macromoleculen af die een belangrijke rol spelen bij immuunregulering.

Bij kanker, gedereguleerde afscheiding beïnvloedt de vrijlating van proteolytische enzymen die invasie te vergemakkelijken. De kwantificering van de afscheiding zal ons in staat stellen om beter te begrijpen gedegradeerde afscheiding in kanker en andere dynamische processen zoals antigeen presentatie heeft. Hoewel ons beeldvormings- en analyseprotocol eenvoudig is, vereist het het genereren van enkele cellen die goed verspreid zijn op een stuk micropatroon.

In deze video laten we zien hoe cellen op micropatroon coverslips kunnen worden gekweekt en hoe ze secretoire gebeurtenissen kunnen visualiseren en analyseren met behulp van ruimtelijke statistische tools. Om coverslips voor te bereiden op micropatronen, activeert u ethanol gesteriliseerd 25 millimeter diameter glazen coverslips onder diep ultraviolet licht gedurende vijf minuten. Terwijl de coverslips worden geactiveerd, voeg een 30 microliter druppel van polylysine graft polyethyleenglycol per coverslip op een stuk paraffine film binnen een vochtige kamer.

Plaats aan het einde van de activering de opdekken geactiveerde oppervlaktezijde naar beneden op de druppels en bedek de vochtige kamer voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de covers twee keer in gedestilleerd water. Terwijl de covers drogen, was een kwarts foto masker een keer met gedestilleerd water en een keer met alcohol.

Droog het fotomasker met gefilterde luchtstroom en stel het fotomasker chromen gecoate kant gedurende vijf minuten bloot tot diep ultraviolet licht. Voeg aan het einde van de verlichting een druppel water van 10 microliter toe aan de met chroom beklede kant van elk fotomasker en plaats de polyethyleenglycolzijde van elke coverslip op elke druppel water. Na het verwijderen van overtollig water, plaats een film deksel over de dia's om uitdroging te voorkomen.

Stel de niet-verchroomde zijkanten van de fotomaskers gedurende nog eens vijf minuten bloot aan diep ultraviolet licht voordat u overtollig water toevoegt aan de fotomaskers om de coverslips te verwijderen. Deze stap zal de micropatroonafdrukken op het oppervlak produceren. Vervolgens incubeer de coverslips in een extracellulaire matrix eiwit oplossing op paraffine film in een vochtige kamer voor een uur onder een laminaire flow hood.

Voor celzaaien op het voorbereide micropatroonoppervlak, aan het einde van de incubatie, plaats de coverslips in een magnetische coverslip houder micropattern kant omhoog en voeg onmiddellijk patroon medium aan de coverslips. Na toevoeging van de afdichting, immobiliseren van de coverslips met het magnetische apparaat voor het vullen van de coverslip houder met extra patroon medium. Sluit vervolgens de houder met een glazen deksel.

Wanneer de cellen klaar zijn, voeg 5 keer 10 toe aan de 5e van de doorfecteerde vereeuwigde netvliespigmenteppitheelcellen aan de coverslips en broed de cellen in de houder gedurende 10 minuten in de celkweek incubator. Gebruik aan het einde van de incubatie één pipet om het oude medium aan tezuigen terwijl u een tweede pipet gebruikt om de cellen vijf maal te wassen met vers medium per wasbeurt om de niet-bevestigde cellen en eventuele resterende foetale runderserum te verwijderen. Na de laatste wasbeurt keert u de houder gedurende drie uur terug naar de couveuse om volledige cel verspreiding mogelijk te maken.

Om exocytose-gebeurtenissen in beeld te brengen, plaatst u de coversliphouder onder een totale interne reflectiefluorescentiemicroscoop en zoekt u naar een cel die VAMP7-pHluorine uitdrukt die volledig is verspreid. Verander de hoek van de laser tot een totale interne reflectie fluorescentiehoek die het mogelijk maakt de visualisatie van VAMP7-pHluorine exocytose gebeurtenissen wordt bereikt en het uitvoeren van een vijf minuten durende acquisitie op een frequentie die compatibel is met de exocytose snelheid en tijdschaal. Om de exocytosecoördinaten te verkrijgen, opent u de verworven exocytose-gebeurtenisfilm in Fiji en identificeert u handmatig de exocytosegebeurtenissen door het verschijnen van een helder signaal dat zich naar buiten verspreidt.

Gebruik het puntgereedschap om het midden van de exocytosegebeurtenis te markeren en gebruik analyseren en meten om de x- en y-coördinaten en de temporele coördinaat te meten. Sla de metingen van één cel op in één tekstbestand. Open tekstbestand in een spreadsheet en verwijder alle, behalve de kolommen segment x en y-coördinaat.

Gebruik vervolgens het ovale gereedschap en meet om het midden en de diameter te meten en om de x- en y-coördinaten en Feret's diameter van elke cel te verkrijgen. Sla de metingen van alle cellen op in één tekstbestand. Open het tekstbestand in een spreadsheet en verwijder alle, behalve de x- en y-coördinaat en de diameterkolommen van Feret.

Voeg vervolgens de straalmeting voor elke cel toe en verkrijg vervolgens de straal van de diameter van de Feret voor elke cel. Gebruik het rechte lijngereedschap om de dikte van de micropatroonring van elke cel te meten. Sla deze meting op voor alle cellen in één tekstbestand en verdeel vervolgens de hechtingslengte door de celstraal om de genormaliseerde hechtingslengte te berekenen.

Installeer eerst het pakket RStudio voor eencellige ruimtelijke analyse en laad het pakket in RStudio. Voer het pakket uit met de FUNCTIE ESA. Er wordt een gebruikersinterface geopend en vervolgens de map voor de TXT-bestanden voor de gegevensset en een map voor de uitvoerplots geselecteerd.

Het script start en voert automatisch de analyse uit, waarbij PDF-bestanden worden weergegeven van de bijbehorende plots en TXT-bestanden met de numerieke resultaten. In de cel wordt de vloer in sonde gedoofd door de lage pH van het lysosoom, maar tijdens exocytose begint pHluorine een signaal uit te zenden als de pH toeneemt als gevolg van protonafgifte. Het pHluorine-signaal vertoont een piek tijdens exocytose die de snelle afgifte van lysosomale protonen vertegenwoordigt, gevolgd door een exponentieel signaalverval dat de 2D-diffusie van de sonde bij het plasmamembraan vertegenwoordigt.

Typisch, transfect vereeuwigd menselijke retinale gepigmenteerde epitheelcellen vertonen een belangrijke lysosomale afscheiding activiteit met een gemiddelde exocytose snelheid van 0,28 Hertz. Het is mogelijk om de 2D-verdeling van exocytose te visualiseren door schatting van de kerneldichtheid om verschillen in lokale dichtheden te onthullen. Er zijn drie mogelijke afwijkingen van volledige ruimtelijke willekeur: clustering, dispersie, of een mengsel van clustering en dispersie.

Ripley's K-functie kan worden gebruikt om deze afwijkingen te beoordelen. Van nota, exocytose gebeurtenissen in de niet-lijm gebied zijn ook geclusterd waaruit blijkt dat hechting moleculen zijn niet de enige structuren die secretoire hotspots induceren bij plasmamembranen. Het uitzetten van het histogram van exocytosegebeurtenissen volgens de modulus voor een representatieve cel onthult een piek rond de grens tussen de lijm- en niet-kleefgebieden.

Gekoppelde analyse toont aan dat de oppervlaktedichtheid lager is in het hechtingsgebied dan in het niet-hechtingsgebied, mogelijk als gevolg van de sterke afname van exocytose aan de celperiferie. Het combineren van celhechting op micropatronen met statistische analyse vergemakkelijkt de mogelijkheid om aan te geven hoe complexe cellulaire processen zoals afscheiding in de ruimte worden gereguleerd. Meer toekomstig werk is nodig om te bepalen welk moleculair mechanisme dat ten grondslag ligt aan de clustering van secretoire activiteit.