Name: Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Leer celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9-genetische schermen. Deze methode identificeert onbevooroordeeld receptor-ligand-interacties zonder voorafgaande kennis van receptorbiologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Wellcome Trust subsidienummer 206194 toegekend aan GJW. Wij danken de Cytometry Core faciliteit: Bee Ling Ng, Jennifer Graham, Sam Thompson, en Christopher Hall voor hulp met FACS.

<ol><li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5 (12), 1405-1412 (2009).</li>
<li>van der Merwe, P. A., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+intercellular+adhesion%3A+the+importance+of+weak+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Transient intercellular adhesion: the importance of weak protein-protein interactions.</a> Trends in Biochemical Sciences. 19 (9), 354-358 (1994).</li>
<li>Wood, L., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+identify+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to identify extracellular receptor-ligand interactions.</a> Current Opinion in Structural Biology. 56, 28-36 (2019).</li>
<li>Bushell, K. M., Söllner, C., Schuster-Boeckler, B., Bateman, A., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome Research. 18 (4), 622-630 (2008).</li>
<li>Visser, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+biochemical+screen+reveals+that+FLRTs+and+Unc5s+mediate+neuronal+subtype+recognition+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An extracellular biochemical screen reveals that FLRTs and Unc5s mediate neuronal subtype recognition in the retina.</a> eLife. 4, e08149(2015).</li>
<li>Özkan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+interactome+of+immunoglobulin+and+LRR+proteins+reveals+receptor-ligand+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extracellular interactome of immunoglobulin and LRR proteins reveals receptor-ligand networks.</a> Cell. 154 (1), 228-239 (2013).</li>
<li>Martinez-Martin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Unbiased+Screen+for+Human+Cytomegalovirus+Identifies+Neuropilin-2+as+a+Central+Viral+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An Unbiased Screen for Human Cytomegalovirus Identifies Neuropilin-2 as a Central Viral Receptor.</a> Cell. 174 (5), 1158-1171 (2018).</li>
<li>Bianchi, E., Doe, B., Goulding, D., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juno+is+the+egg+Izumo+receptor+and+is+essential+for+mammalian+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Juno is the egg Izumo receptor and is essential for mammalian fertilization.</a> Nature. 508 (7497), 483-487 (2014).</li>
<li>Mullican, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFRAL+is+the+receptor+for+GDF15+and+the+ligand+promotes+weight+loss+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">GFRAL is the receptor for GDF15 and the ligand promotes weight loss in mice and nonhuman primates.</a> Nature Medicine. 23 (10), 1150-1157 (2017).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+malaria+is+associated+with+parasite+binding+to+endothelial+protein+C+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Severe malaria is associated with parasite binding to endothelial protein C receptor.</a> Nature. 498 (7455), 502-505 (2013).</li>
<li>Frei, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+identification+of+ligand-receptor+interactions+on+living+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Direct identification of ligand-receptor interactions on living cells and tissues.</a> Nature Biotechnology. 30 (10), 997-1001 (2012).</li>
<li>Sobotzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HATRIC-based+identification+of+receptors+for+orphan+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">HATRIC-based identification of receptors for orphan ligands.</a> Nature Communications. 9 (1), 1519(2018).</li>
<li>Sharma, S., Petsalaki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+CRISPR-Cas9+Based+Genome-Wide+Screening+Approaches+to+Study+Cellular+Signalling+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of CRISPR-Cas9 Based Genome-Wide Screening Approaches to Study Cellular Signalling Mechanisms.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), (2018).</li>
<li>Gebre, M., Nomburg, J. L., Gewurz, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+Genetic+Analysis+of+Virus-Host+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 Genetic Analysis of Virus-Host Interactions.</a> Viruses. 10 (2), (2018).</li>
<li>Zotova, A., Zotov, I., Filatov, A., Mazurov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+antigen+specificity+of+a+monoclonal+antibody+using+genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Determining antigen specificity of a monoclonal antibody using genome-scale CRISPR-Cas9 knockout library.</a> Journal of Immunological Methods. 439, 8-14 (2016).</li>
<li>Puschnik, A. S., Majzoub, K., Ooi, Y. S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+toolbox+to+study+virus-host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR toolbox to study virus-host interactions.</a> Nature Reviews. Microbiology. 15 (6), 351-364 (2017).</li>
<li>Kerr, J. S., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Avidity-based+extracellular+interaction+screening+%28AVEXIS%29+for+the+scalable+detection+of+low-affinity+extracellular+receptor-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Avidity-based extracellular interaction screening (AVEXIS) for the scalable detection of low-affinity extracellular receptor-ligand interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (61), e3881(2012).</li>
<li>Tzelepis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR+Dropout+Screen+Identifies+Genetic+Vulnerabilities+and+Therapeutic+Targets+in+Acute+Myeloid+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A CRISPR Dropout Screen Identifies Genetic Vulnerabilities and Therapeutic Targets in Acute Myeloid Leukemia.</a> Cell Reports. 17 (4), 1193-1205 (2016).</li>
<li>Sharma, S., Bartholdson, S. J., Couch, A. C. M., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+identification+of+cellular+pathways+required+for+cell+surface+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Genome-scale identification of cellular pathways required for cell surface recognition.</a> Genome Research. 28 (9), 1372-1382 (2018).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+pooled+CRISPR+genetic+screens+using+MAGeCKFlute%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of pooled CRISPR genetic screens using MAGeCKFlute.</a> Nature Protocols. 14 (3), 756-780 (2019).</li>
<li>R Core team. A language and environment for statistical computing. , http://www.R-project.org (2013).</li>
<li>Hart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Design+of+Genome-Wide+CRISPR%2FSpCas9+Knockout+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Design of Genome-Wide CRISPR/SpCas9 Knockout Screens.</a> G3. 7 (8), 2719-2727 (2017).</li>
<li>Kuleshov, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichr%3A+a+comprehensive+gene+set+enrichment+analysis+web+server+2016+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Enrichr: a comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update.</a> Nucleic Acids Research. 44 (W1), W90-W97 (2016).</li>
<li>Crosnier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480 (7378), 534-537 (2011).</li>
<li>Kirk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD147+is+tightly+associated+with+lactate+transporters+MCT1+and+MCT4+and+facilitates+their+cell+surface+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">CD147 is tightly associated with lactate transporters MCT1 and MCT4 and facilitates their cell surface expression.</a> The EMBO Journal. 19 (15), 3896-3904 (2000).</li>
<li>Chong, Z. S., Ohnishi, S., Yusa, K., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled+extracellular+receptor-ligand+interaction+screening+using+CRISPR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled extracellular receptor-ligand interaction screening using CRISPR activation.</a> Genome Biology. 19 (1), 205(2018).</li>
<li>van der Meer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Model+Passports-a+hub+for+clinical%2C+genetic+and+functional+datasets+of+preclinical+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cell Model Passports-a hub for clinical, genetic and functional datasets of preclinical cancer models.</a> Nucleic Acids Research. 47 (D1), D923-D929 (2019).</li>
<li>Bausch-Fluck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric-derived+cell+surface+protein+atlas%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric-derived cell surface protein atlas.</a> PloS One. 10 (3), e0121314(2015).</li>
<li>Behan, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prioritization+of+cancer+therapeutic+targets+using+CRISPR-Cas9+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prioritization of cancer therapeutic targets using CRISPR-Cas9 screens.</a> Nature. 568 (7753), 511-516 (2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een CRISPR-gebaseerde screeningstrategie om genen te identificeren die cellulaire componenten coderen die betrokken zijn bij cellulaire herkenning wordt beschreven. Een soortgelijke aanpak met crispr-activering biedt ook een genetisch alternatief om direct interagerende receptoren van recombinanteiwitten te identificeren zonder dat grote eiwitbibliotheken hoeven te worden gegenereerd26. Echter, een groot voordeel van deze aanpak is dat het van toepassing is op interacties bemiddeld door oppervlaktemoleculen native weergegeven op de cel en is niet afhankelijk van de overexpressie van receptoren, die de bindende avidity van de receptor kan beïnvloeden. In tegenstelling tot andere methoden, daarom, deze techniek maakt geen veronderstellingen met betrekking tot de biochemische aard of celbiologie van de receptoren en biedt een kans om interacties bemiddeld door eiwitten die normaal gesproken moeilijk te bestuderen met behulp van biochemische benaderingen, zoals zeer grote eiwitten, of die het membraan meerdere keren doorkruisen of vormen complexen met andere eiwitten, en moleculen anders dan eiwitten zoals eiwitten zoals glycanen, glycolipids, en fosfolifoïden te bestuderen. Gezien de genoom-schaal aard van de methode, deze aanpak heeft ook het voordeel van niet alleen het identificeren van de receptor, maar ook extra cellulaire componenten die nodig zijn voor de bindende gebeurtenis, waardoor inzicht in de celbiologie van de receptor.
Een van de belangrijkste beperkingen van deze methode bij het gebruik ervan om de receptor van een weeseiwit te identificeren, is de eerste vereiste om eerst een cellijn te identificeren die zich bindt aan het eiwit. Dit is niet altijd eenvoudig en het identificeren van een cellijn die een bindend fenotype weergeeft dat ook tolerant is voor genetische schermen kan de tijdbeperkende stap zijn voor het implementeren van deze test. Sommige cellijnen hebben de neiging om te binden aan meer eiwitten dan anderen. Dit is vooral relevant voor eiwitten die GS binden, omdat deze eiwitten de neiging hebben om zich te binden aan elke cellijn die HS-zijketens weergeeft, ongeacht de oorspronkelijke bindingscontext. Daarnaast hebben we geconstateerd dat upregulatie van syndecanen (d.w.z. proteoglycanen die GS bevatten) in cellijnen leidt tot verhoogde binding van HS-bindende eiwitten26. Dit kan een factor zijn om rekening mee te houden bij het selecteren van de cellijn voor screening. Echter, ook belangrijk op te merken is dat de additieve binding van GS niet interfereert met de binding aan een specifieke receptor. Dit betekent dat als binding wordt nageleefd, het mogelijk is dat het uitsluitend door GS wordt bemiddeld omdat de binding die GS in deze test bemiddeld heeft, eerder additief is dan codeafhankelijk19. In een dergelijk scenario kan de beschreven heparineblokkeringsbenadering dergelijk gedrag identificeren zonder dat u een volledig genetisch scherm hoeft uit te voeren.
Een nuttige bron voor het kiezen van cellijnen is Cell Model Passport, die genomics, transcriptomics, en cultuur conditie informatie voor ~ 1.000 kanker cellijnen27bevat. Afhankelijk van de biologische context kunnen cellen worden gekozen op basis van hun expressieprofielen. Om de selectie van cellijnen te bevorderen, hebben we ~1.000 cellijnen geclusterd in Cell Model Passport volgens de expressie van ~1.500 vooraf geannoteerde menselijke celoppervlak glycoproteins28 (Aanvullende figuur 2; clusterinformatie voor elke cellijn samen met groeiomstandigheden zijn opgenomen in aanvullende tabel 2). Bij het testen van de binding van een eiwit met onbekende functie, is het nuttig om een paneel van representatieve cellijnen uit elk cluster te selecteren om de kans op het bedekken van een breed scala aan receptoren te vergroten. Gezien een keuze, is het raadzaam om cellijnen die gemakkelijk te cultuur en gemakkelijk te transduceren kiezen. Aangezien deze cellijnen zullen worden gebruikt in genoom-schaal screening, is het beter dat ze gemakkelijk kunnen worden geteeld in grote hoeveelheden en zijn tolerant voor lentivirale transductie, want het is de meest voorkomende methode voor de levering van sgRNA voor CRISPR-gebaseerde genetische screening in de latere stappen.
Over het algemeen worden de fenotypeselecties in één soort uitgevoerd. Dit wordt echter bepaald door de helderheid van de gekleurde celpopulatie in vergelijking met de besturing. Iteratieve selectierondes kunnen worden aangenomen voor scenario's waarin de signaal-ruisverhouding van het gewenste fenotype laag is, of wanneer het doel van het scherm is om mutanten te identificeren die sterke fenotypes hebben. Bij het gebruik van een iteratieve selectiebenadering voor FACS-gebaseerde schermen is het belangrijk om te overwegen dat het sorteerproces celdood kan veroorzaken, voornamelijk als gevolg van de enorme kracht van de sorteerder. Zo zullen niet alle verzamelde cellen worden vertegenwoordigd in de volgende ronde van het sorteren.
De complexiteit van de bibliotheek is een zeer belangrijke factor bij het uitvoeren van succesvolle genetische schermen, vooral voor negatieve selectieschermen, omdat de mate van uitputting in deze schermen alleen kan worden bepaald door resultaten te vergelijken met wat er aanwezig was in de startbibliotheek. Voor negatieve selectieschermen is het gebruikelijk om bibliotheken met een complexiteit van 500-1.000 x te onderhouden. Positieve selectieschermen zijn echter robuuster voor bibliotheekgroottes, omdat in dergelijke schermen naar verwachting slechts een klein aantal mutanten voor een bepaald fenotype zal worden geselecteerd. Daarom kan in het hier beschreven positieve selectiescherm de grootte van de bibliotheek worden verlaagd tot 50-100x complexiteit zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van het scherm. Bovendien is het in deze schermen ook mogelijk om een controlebibliotheek voor een bepaalde cellijn op een bepaalde dag te gebruiken als een "algemene controle" voor alle monsters die op de dag voor die bepaalde cellijn zijn gesorteerd. Dit vermindert het aantal controlebibliotheken dat moet worden geproduceerd en gesequenced.
Een andere belangrijke overweging voor het gebruik van deze aanpak is de beperkingen van verlies-van-functie schermen bij het identificeren van genen die essentieel zijn voor in vitro cel groei. De timing van de schermen is daarbij cruciaal, naarmate hoe langer de gemuteerde cellen in de cultuur worden gehouden, hoe groter de kans dat cellen met mutaties in essentiële genen niet levensvatbaar worden en niet langer vertegenwoordigd zijn in de gemuteerde bibliotheek. De recente genetische schermen uitgevoerd als onderdeel van het Project Score initiatief in meer dan 300 cellijnen tonen aan dat meerdere genen in de KEGG-geannoteerde eiwitafscheiding en N-glycosylation traject vaak worden geïdentificeerd als essentieel voor een aantal cellijnen (Aanvullende figuur 3)29. Hiermee kan bij het ontwerpen van schermen rekening worden gehouden als het effect van genen die nodig zijn voor proliferatie en levensvatbaarheid moet worden onderzocht in het kader van het cellulaire herkenningsproces. In dit geval zou het in het algemeen passend zijn om schermen in een vroeg tijdstip uit te voeren (bijvoorbeeld dag 9 na de transmissie). Als de aanpak echter wordt gebruikt om een paar doelen met sterke grootteeffecten te identificeren in plaats van algemene cellulaire trajecten, kan het passend zijn om schermen op een later tijdstip uit te voeren (bijvoorbeeld dag 15-16 na de transmissie).
De resultaten van de screening zijn zeer robuust; in acht recombinant eiwitbindingsschermen die in het verleden werden uitgevoerd, was de celoppervlakreceptor de hoogste hit in elk geval19. Bij het gebruik van deze benadering om de interactiepartner te identificeren, moet men daarom verwachten dat de receptor en de factoren die bijdragen aan de presentatie op het oppervlak worden geïdentificeerd met een hoog statistisch vertrouwen. Zodra het scherm is uitgevoerd en een hit wordt gevalideerd met behulp van een enkele gRNA knock-out, verdere follow-ups kunnen worden uitgevoerd met behulp van bestaande biochemische methoden zoals AVEXIS4 en directe saturable binding van gezuiverde eiwitten met behulp van oppervlakte plasmon resonantie. De hier beschreven aanpak is toepasbaar voor alle eiwitten waarvoor het mogelijk is om een oplosbare recombinant bindingssonde te genereren.
Samengevat is dit een genoom-schaal CRISPR knock-out benadering om interacties te identificeren bemiddeld door celoppervlakte eiwitten. Deze methode is over het algemeen van toepassing om cellulaire paden te identificeren die nodig zijn voor celoppervlakkenherkenning in een breed scala van verschillende biologische contexten, waaronder tussen de eigen cellen van een organisme (bijvoorbeeld neurale en immunologische herkenning), evenals tussen gastheercellen en pathogene eiwitten. Deze methode biedt een genetisch alternatief voor biochemische benaderingen ontworpen voor receptor identificatie, en omdat het geen voorafgaande veronderstellingen met betrekking tot de biochemische aard of celbiologie van de receptoren vereist, heeft het een groot potentieel om volledig onverwachte ontdekkingen te doen.

Extracellulaire interacties door celoppervlak receptor eiwitten directe belangrijke biologische processen zoals weefsel organisatie, gastheer-pathogene erkenning, en immuun regulering. Het onderzoeken van deze interacties is van belang voor de bredere biomedische gemeenschap, omdat membraanreceptoren bruikbare doelwitten zijn van systematisch geleverde therapieën zoals monoklonale antilichamen. Ondanks hun belang blijft het bestuderen van deze interacties technisch uitdagend. Dit komt vooral omdat membraan-embedded receptoren amphipathisch zijn, waardoor ze moeilijk te isoleren zijn van biologische membranen voor biochemische manipulatie, en hun interacties worden gekenmerkt door de zwakke interactieaffinities(KDs in het μM-mM-bereik)1. Daarom zijn veelgebruikte methoden ongeschikt om deze klasse van eiwitinteracties1,2te detecteren .
Een reeks methoden is ontwikkeld om specifiek te onderzoeken extracellulaire receptor-ligand interacties die hun unieke biochemische eigenschappen in aanmerking nemen3. Een aantal van deze benaderingen omvatten het uitdrukken van het gehele ectodomein van een receptor als een oplosbaar recombinant eiwit in zoogdier- of insectcelgebaseerde systemen om ervoor te zorgen dat deze eiwitten posttranslationele wijzigingen bevatten die structureel belangrijk zijn, zoals glycanen en disulfidebindingen. Om de binding met lage affiniteit te overwinnen, worden de ectodomeinen vaak oligomeriseerd om hun bindingsbidheid te vergroten. Fervent eiwit ectodomains zijn met succes gebruikt als bindende sondes om interactiepartners te identificeren in directe recombinante eiwit-eiwit interactie schermen4,5,6,7. Hoewel in grote lijnen succesvolle, recombinante eiwitgebaseerde methoden vereisen dat het ectodomein van een membraanreceptor wordt geproduceerd als een oplosbaar eiwit. Daarom is het in het algemeen alleen van toepassing op eiwitten die een aaneengesloten extracellulaire regio bevatten (bijvoorbeeld single-pass type I, type II of GPI-verankerd) en is over het algemeen niet geschikt voor receptorcomplexen en membraaneiwitten die het membraan meerdere keren overspannen.
Expressie klonen technieken waarin een bibliotheek van complementaire SMA's (cDNAs) wordt omgezet in cellen en getest op een gain-of-binding fenotype zijn ook gebruikt om extracellulaire eiwit-eiwit interacties te identificeren8. De beschikbaarheid van grote collecties gekloonde en gesequencede cDNA-expressieplasmids in de afgelopen jaren heeft methoden vergemakkelijkt waarbij cellijnen die cDNAs-coderingsceloppervlakreceptoren overdrijven, worden gescreend op de binding van recombinante eiwitten om interacties9,10te identificeren . De cDNA overexpression-gebaseerde benaderingen bieden, in tegenstelling tot recombinante eiwitgebaseerde methoden, de mogelijkheid om interacties in de context van het plasmamembraan te identificeren. Het succes van het gebruik van cDNA-expressieconstructies hangt echter af van het vermogen van de cellen om het eiwit in de juiste gevouwen vorm te overexpresseren, maar dit vereist vaak cellulaire accessoirefactoren zoals transporters, chaperonnes en correcte oligomeric assemblage. Het transfecteren van één cDNA is daarom misschien niet voldoende om een expressie van het celoppervlak te bereiken.
Screening technieken met behulp van cDNA constructies of recombinant eiwit sondes zijn resource-intensieve en vereisen grote collecties van cDNA of recombinant eiwit bibliotheken. Speciaal ontworpen massaspectrometrie gebaseerde methoden zijn onlangs gebruikt om extracellulaire interacties die niet vereisen de montage van grote bibliotheken te identificeren. Deze technieken vereisen echter chemische manipulatie van het celoppervlak, wat de biochemische aard van de moleculen op het oppervlak van de cellen kan veranderen en momenteel alleen van toepassing is op interacties die worden gemedieerd door glycosylated eiwitten11,12. De meerderheid van de momenteel beschikbare methoden ook sterk richten op de interacties tussen eiwitten, terwijl grotendeels het negeren van de bijdrage van het membraan micro-omgeving, met inbegrip van moleculen zoals glycanen, lipiden, en cholesterol.
De recente ontwikkeling van zeer efficiënte bialleleic targeting met behulp van CRISPR-gebaseerde benaderingen heeft genoom-schaal bibliotheken van cellen zonder gedefinieerde genen in een enkele pool die kan worden gescreend in een systematische en onpartijdige manier om cellulaire componenten die betrokken zijn in verschillende contexten te identificeren, inclusief het ontleden van cellulaire signaleringsprocessen, identificatie van verstoringen die resistentie tegen geneesmiddelen, toxines en ziekteverwekkers verlenen, en het bepalen van de specificiteit van antilichamen13,14,15,16. Hier beschrijven we een op genoomschaalfelijke CRISPR-gebaseerde knock-outcelscreeningtest die een alternatief biedt voor de huidige biochemische benaderingen om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren. Deze benadering van het identificeren van interacties bemiddeld door membraanreceptoren door genetische schermen is bijzonder geschikt voor onderzoekers die een gerichte interesse hebben op individuele liganden, omdat het vermijdt de noodzaak om grote bibliotheken van cDNAs of recombinante eiwitten samen te stellen.
Deze test bestaat uit drie belangrijke stappen: 1) Zeer gretige recombinant eiwitbindingssondes bestaande uit de extracellulaire gebieden van een receptor van belang worden geproduceerd en gebruikt in fluorescentie-gebaseerde flow cytometrie gebaseerde bindende testen; 2) De bindende tests worden gebruikt om een cellijn te identificeren die de interactiepartner van de recombinant eiwitsonde uitdrukt; 3) Een Cas9-expressing versie van de cellijn die interageert met het eiwit van belang wordt geproduceerd en een genoom-schaal CRISPR / Cas9-gebaseerde knock-out scherm wordt uitgevoerd (Figuur 1). In dit genetische scherm wordt binding van een recombinant eiwit aan cellijnen gebruikt als meetbaar fenotype waarbij cellen binnen de knock-outbibliotheek die het vermogen hebben verloren om de sonde te binden worden gesorteerd met behulp van op fluorescentie gebaseerde geactiveerde celsorde (FACS) en de genen die het verlies veroorzaakten van het bindende fenotype dat door sequencing is geïdentificeerd. In principe worden de genen geïdentificeerd die de receptor coderen die verantwoordelijk is voor het binden van de fanatieke sonde en die welke nodig zijn voor het display van het celoppervlak.
De eerste stap van dit protocol omvat de productie van enthousiaste recombinante eiwitsondes die het ectodomein van de membraangebonden receptoren vertegenwoordigen. Van deze receptoren is bekend dat ze vaak hun extracellulaire bindingsfuncties behouden wanneer hun ectodomeinen worden uitgedrukt als een recombinant oplosbaar eiwit1. Voor een eiwit van belang, oplosbare recombinant eiwitten kunnen worden geproduceerd in een geschikte eukaryotische eiwit expressie systeem in elk formaat, op voorwaarde dat het kan oligomerized voor verhoogde binding avidity, en het bevat tags die kunnen worden gebruikt in fluorescentie-gebaseerde flow cytometrie gebaseerde bindende testen (bijvoorbeeld, FLAG-tag, biotine-tag). Gedetailleerde protocollen voor de productie van oplosbare ectodomeinen van membraanreceptoren met behulp van het HEK293-eiwitexpressiesysteem,evenalsverschillende multimerisatietechnieken en de eiwitexpressieconstructies voor de productie van zowel pentamerische eiwitten als monomeereiwitten zijn eerder beschreven 1,17. Het protocol hier zal beschrijven de stappen voor het genereren van fluorescerende enthousiaste sondes van monomerische biotinylated eiwitten door ze te conjugating tot streptavidin geconjugeerd tot een fluorchrome (bijvoorbeeld, fycoerythrin, of PE), die direct kan worden gebruikt in celgebaseerde bindende testen en heeft het voordeel van het niet vereisen van een secundaire antilichaam voor detectie. Algemene protocollen voor het uitvoeren van genoom-schaal schermen zijn al beschreven20,21, dus het protocol vooral gericht op de specifieke kenmerken van het uitvoeren van flow cytometrie-gebaseerde recombinant eiwit binding schermen met behulp van de CRISPR / Cas9 knock-out screening systeem met behulp van de Human V1 ("Yusa") bibliotheek18.

<table><tbody><tr><td>Anti-muis alkaline fosfatase</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>Blood &amp; Cell Culture DNA Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Diethanolamine</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood and Tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T packaging cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX with PLUS reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP cell sorter</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA agarose beads</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 antilichaam</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenylfosfaat</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 ontzoutingskolommen</td><td>GE healthcare</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybreen</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleen buizen met 5 mL bedvolume</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2&times; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SCFA filter</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>Sony Cell sorter</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI beads (Agencourt AMPure XP beads)</td><td>Beckman</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-gecoate microtiterplaten</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal crispr/cas9 genetische schermen

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

Intercellulaire communicatie bemiddeld door directe interacties tussen membraan-embedded celoppervlak receptoren is cruciaal voor de normale ontwikkeling en werking van meercellige organismen. Het detecteren van deze interacties blijft technisch uitdagend, echter. Dit manuscript beschrijft een systematische genoom-schaal CRISPR / Cas9 knock-out genetische screening aanpak die cellulaire trajecten die nodig zijn voor specifieke cel oppervlak erkenning gebeurtenissen onthult. Deze test maakt gebruik van recombinant eiwitten geproduceerd in een zoogdier eiwit expressie systeem als fervent bindende sondes om interactie partners te identificeren in een cel-gebaseerde genetische scherm. Deze methode kan worden gebruikt om de genen te identificeren die nodig zijn voor celoppervlak interacties gedetecteerd door recombinant bindende sondes die overeenkomen met de ectodomains van membraan-embedded receptoren. Belangrijk, gezien de genoom-schaal aard van deze aanpak, het heeft ook het voordeel van niet alleen het identificeren van de directe receptor, maar ook de cellulaire componenten die nodig zijn voor de presentatie van de receptor aan het celoppervlak, waardoor waardevolle inzichten in de biologie van de receptor.

Dit manuscript beschrijft een genoom-schaal celgebaseerde screening benadering om extracellulaire receptor-ligand interacties te identificeren.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

De detectie van interacties met het cellenoppervlak met behulp van de momenteel beschikbare biochemische benaderingen brengt nog steeds technische uitdagingen met zich mee. Dit protocol biedt een genetisch alternatief met behulp van de genoomschaal cel screening aanpak om de receptor ligand interacties te identificeren op het celoppervlak. In tegenstelling tot de meeste andere bestaande methoden, deze methode maakt geen veronderstellingen met betrekking tot de biologie van de receptoren.Het biedt mogelijkheden om de interacties te identificeren die door een breed scala aan celoppervlakmoleculen worden bemiddeld. Celoppervlakmoleculen zijn direct toegankelijk voor geneesmiddelen zoals monoklonale antilichamen. Daarom kan de identificatie van interacties die door deze moleculen worden bemiddeld belangrijke therapeutische implicaties hebben.Deze methode is over het algemeen van toepassing op onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het verkennen van de cellulaire signalering en herkenning processen is in een breed scala van biologische contexten, met inbegrip van neurale en immunologische interacties, alsmede gastheer pathogen interacties. Het protocol vereist een hoge doorvoercelsorteermachine en sequencingmachines van de volgende generatie. Zorg ervoor dat deze faciliteiten beschikbaar zijn voordat u met het protocol begint.Begin met het maken van acht seriële verdunningen van de biotinylated eiwitmonsters in een 96-putplaat die ervoor zorgt dat het uiteindelijke volume van elke verdunning ten minste 200 microliter is en dat een tag-only controle wordt opgenomen. Maak een dubbele plaat van de monsters door het verwijderen van 100 microliters uit elke put en de overdracht van het in een nieuwe 96-well plaat. Neem een tag-only eiwit controle die zal worden gebruikt als een controle sonde in alle bindende essays.Voeg 100 microliter van 0,1 microgram per milliliter streptavidin-PE toe aan de putten in een van de platen en 100 microliters verdunningsbuffer aan de putten van de andere plaat. Incubeer de plaat gedurende 20 minuten op kamertemperatuur. Ondertussen, blok de putten van de streptavidin gecodeerde plaat met de verdunning buffer gedurende 15 minuten.Zorg er na het wassen van de plaat voor dat deze droog is. Breng vervolgens het totale volume van het monster van beide platen over naar afzonderlijke putten van de met streptavidin gecodeerde plaat en broed het gedurende een uur bij kamertemperatuur. Na de incubatie was je de plaat drie keer met 200 microliters wasbuffer.Voeg 100 microliter muis anti-rat Cd4d3+4 IgG toe en broed de plaat nog een uur uit. Herhaal de wasbeurten. Voeg 100 microliter van een anti-muis alkalische fosforconjugaat toe en laat de plaat een uur op kamertemperatuur.Was vervolgens de putten drie keer met wasbuffer en eenmaal met verdunningsbuffer. Bereid p-nitrofenylfosfaat op een milligram per milliliter in kleurstof ethanolamine buffer en voeg 100 microliter aan elke put. Na een incubatie van 15 minuten, meet de absorptie hebben elk goed op 405 nanometer.Gebruik de minimale verdunning waarbij er geen signaal op de plaat is als de juiste verdunningsfactor om tetrameren te creëren. Incubeer streptavidin-PE en de juiste biotinylated eiwitverdunning gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar vervolgens geconjugeerde eiwitten in een licht beschermde buis bij vier graden Celsius tot verder gebruik.Draai de conische buizen met de behandelde en controlemonsters op 200 keer G gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant en vries een van de buizen bij min 20 graden Celsius voor later gebruik. Stel de pellet in de andere buis opnieuw op in 10 milliliter PBS met 1%BSA en zet 100 microliter cellen opzij als negatieve controle op een 96-putplaat.Voeg vervolgens het voorgevoegde recombinant eiwit toe aan de celsuspensie in de conische buis en in de 96-putplaat. Voer celvlekken gedurende ten minste een uur bij vier graden Celsius uit op een benchtop rotor met zachte rotatie. Dan pellet de cellen op 200 keer G gedurende vijf minuten en verwijder de supernatant.Na het wassen van de cellen twee keer, opnieuw opschorten ze in vijf milliliter pbs. Zeef de cellen door een zeef van 30 micrometer om celclusters te verwijderen. Analyseer ze dan met een stroom Sodor.Gebruik het negatieve controlemonster om te poort voor BFP-positieve en PE-negatieve cellen. Sorteer vervolgens het monster en verzamel 500.000 tot 1 miljoen BFP-positieve en PE-negatieve cellen in een 1,5 milliliter centrifugatiebuis. De zere kooi zal afhangen van de binding van de cellen aan het eiwit, maar normaal gesproken wordt een tot 5% van de PE-negatieve monsters verzameld.Laat nu de gesorteerde cellen door centrifugeren voor 500 keer G gedurende vijf minuten, dan voorzichtig verwijderen van de supernatant. De pellet kan maximaal zes maanden worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius. Gebruik de telfunctie van magie om sequenties van de ongesorteerde en gesorteerde populatie in kaart te brengen in de referentiebibliotheek, waardoor een onbewerkt tellingsbestand wordt opgeleverd.Voer de testfunctie van magie uit met ruwe tellingen van het ongesorteerde controlemonster als controle en de tellingen van het gesorteerde monster als behandeling. Open het gegenereerde genoverzichtsbestand en rangschik de kolom pauzerang in oplopende volgorde. Identificeer vervolgens hits met een vals detectiepercentage van minder dan punt 0,05.De receptor wordt meestal zeer vaak gerangschikt in de eerste positie. Ten slotte gebruik maken van R of een gelijkwaardige software om de robuuste ranking algoritme score plot voor positieve selectie. Genoomschaal knockdown schermen voor de identificatie van de bindende partner van menselijke TNFSF9 en P falciparum of H5 van de menselijke TNFSF9 en P falciparum Rh5 werden uitgevoerd in NCI-SNU-1 en HEC-293 cellen respectievelijk.Het bindingsgedrag van Rh5 werd beïnvloed door zowel heparan sulfaat als het bekende receptor BSG terwijl TN-FRSF-9 niet verloor binding aan de bekende receptor TN-FSF-9. Bij pre-incubatie met oplosbare heparine. De GNA-distributie in de controle mutant bibliotheek bleek dat de bibliotheek complexiteit werd gehandhaafd in de loop van het experiment.De technische kwaliteit van de schermen werd beoordeeld door de verdeling van de waargenomen vouwveranderingen van G-RNA's gericht op een referentieset van niet-essentiële genen te onderzoeken, vergeleken met de verdeling voor een referentieset van essentiële genen. Bovendien bleek uit de verrijking van het trajectniveau dat de verwachte essentiële trajecten werden geïdentificeerd en aanzienlijk werden verrijkt bij de uitval van de bevolking. Bij het vergelijken van het controlemonster met de oorspronkelijke plasmid bibliotheek.Het robuuste rangalgoritme of de RRA-score biedt een maat waarvan G-RNA's consistent hoger scoren dan verwacht. In het scherm voor TNFRSF9, de top hit was TNFSF9, dat is een bekende binding partner. Daarnaast werden ook een aantal genen met betrekking tot het TP53-traject geïdentificeerd.In het geval van RH5, naast de bekende receptor, en het gen dat nodig is voor de productie van sulfated gags, werd ook het SLC16A1-gen geïdentificeerd. De screening benadering is meestal zeer robuust en de direct interagerende receptor moet sterk worden gerangschikt op de lijst van genen verrijkt in deze volgorde van de bevolking. Het is van cruciaal belang om de hits verkregen van het scherm te valideren.Als de interactie wordt bemiddeld door eiwitten, kunnen biochemische benaderingen die zijn ontworpen om binaire eiwitinteracties te bestuderen, bijvoorbeeld worden gebruikt voor verdere validatiestudies. Vanwege de onbevooroordeelde genoomschaal aard van deze aanpak, verwachten we dat het zal helpen bij het verkennen van de interacties bemiddeld door moeilijk te bestuderen celmoleculen zoals lipiden, multipass membraan eiwitten en glycanen. Het kan ook onthullen nieuwe trajecten die nodig zijn voor receptor handel en biologie.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Genotypering techniek beschreven voor koppeling fluorescent polymerasekettingreactie (PCR) met capillaire gelelektroforese, maakt genotypering van nuclease-gemedieerde knockout klonen. Het omzeilt beperkingen geconfronteerd met andere genotyperingstechnieken en kosteneffectiever is dan sequencing methoden.

Gebruikmaking van een fluorescentie PCR-capillaire gelelektroforese techniek voor CRISPR Genotype / Cas9-gemedieerde knockout mutanten in een High-throughput Format

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het ontwerpen en uitvoeren multiplexed targeting van versterkers met de deactivering fusieproteïne SID4X-dCas9-KRAB, ook bekend als enhancer interferentie (Enhancer-i). Dit protocol stelt de identificatie van versterkers die regelen van genexpressie en vergemakkelijkt de dissectie van de relaties tussen de versterkers van regulering van een gemeenschappelijk doel-gen.

Dissectie van Enhancer functie met behulp van Multiplex CRISPR gebaseerde Enhancer inmenging in cellijnen

Hier presenteren we een protocol voor het optimaliseren van CRISPR-Cas9 om een hogere specificiteit zonder verlies van aan-target activiteit. We een gerichte evolutie aanpak genoemd Sniper-scherm gebruiken om te zoeken een mutant Cas9 met de gewenste kenmerken. Sniper-Cas9 compatible met afgekapte single-gids RNAs en levering in een ribonucleoprotein formaat, bekende strategieën voor het bereiken van hogere specificiteit.

Met behulp van Sniper-Cas9 te minimaliseren Off-target effecten van CRISPR-Cas9 zonder verlies van On-target activiteit Via gerichte evolutie

Een CRISPR/sgRNA-bibliotheek is toegepast op het ondervragen van eiwit-codeert genen. De haalbaarheid van een bibliotheek van de sgRNA aan het licht brengen van de functie van een scheidingswand CTCF in genregulatie blijft echter onontgonnen. Hier beschrijven we een HOX loci specifieke sgRNA bibliotheek te verhelderen van de functie van CTCF grenzen in HOX loci.

HOX Loci gericht CRISPR/sgRNA bibliotheek Screening identificeren kritische CTCF grenzen

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

AviTag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylatie (ALIBi) is een nieuwe optogenetisch geactiveerde methode ontwikkeld voor het labelen en affiniteitszuiveren van subcellulaire populaties van ribosomen voor downstream sequencing en proteomische analyse.

Isolatie van subcellulaire ribosoomsubpopulaties op basis van recombinante peptide-tag-specifieke locatie-beperkte verlichtingsversterkte biotinylering

Een belangrijke barrière voor technologieën zoals CRISPR zijn de off-target gebeurtenissen die vitale genen kunnen verstoren. 'Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by Sequencing' (CIRCLE-seq) is een techniek die is ontworpen om onbedoelde splitsingsplaatsen te identificeren. Deze methode brengt de genoombrede activiteit van CRISPR-Cas9 met hoge gevoeligheid en zonder bias in kaart.

CIRCLE-Seq voor ondervraging van off-target genbewerking

Het artikel beschrijft een protocol voor de toepassing van een in vitro model voor uitputting om een genoombrede CRISPR-knockoutscreening te voltooien in gezonde chimere antigeenreceptor-T-cellen van de donor.

Uitvoeren van een in vitro genoombrede CRISPR-knock-outscreening in chimere antigeenreceptor-T-cellen

Hier presenteren we een protocol dat CRISPR/Cas9-technologie integreert met de Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-test om kandidaatgenen te identificeren die cruciaal zijn voor de abnormale proliferatieve capaciteit van hematopoëtische stam- en voorlopercellen.

Evaluatie van abnormale groeigerelateerde genen van hematopoëtische stam- en voorlopercellen door CRISPR/Cas9-technologie te combineren met celtelling

Er wordt een nauwgezette en gestructureerde aanpak gegeven om resistente en gevoelige stralingsgenen te selecteren door de toepassing van een genoomwijde CRISPR/Cas9-screeningsmethode. Dit protocol heeft ook het potentieel om te dienen als een veelzijdig kader voor andere onderzoeksinspanningen die de mechanismen van resistentie tegen klinisch toegediende chemische geneesmiddelen onderzoeken.

Genoombrede CRISPR-screening voor het onthullen van stralingsgevoelige en radioresistente genen

We ontwikkelden een geoptimaliseerd CRISPR-Cas9 knockout-screeningsprotocol voor primaire CAR T-cellen. Door de gDNA-overdracht via enzymatische vertering en sgRNA-cassette pulldown te verminderen, minimaliseert deze aanpak PCR-artefacten, waardoor nauwkeurige sgRNA-detectie en robuuste identificatie van functionele gendoelen worden gegarandeerd.

Verbetering van CRISPR-Cas9-schermen in CAR T-cellen: Een verfijnde methode voor bibliotheekvoorbereiding

Leer celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9-genetische schermen. Deze methode identificeert onbevooroordeeld receptor-ligand-interacties zonder voorafgaande kennis van receptorbiologie.

Celoppervlakreceptoridentificatie met genoomschaal CRISPR/Cas9 genetische schermen

Meer video's verkennen