High-Throughput Identificatie van resistentie tegen Pseudomonas syringae pv. Tomaat in Tomaat met seedling Flood Assay
10 maart 2020
De zaailing overstromingstest vergemakkelijkt een snelle screening van wilde tomaten toetredingen voor de weerstand tegen de Pseudomonas syringae bacterie. Deze test, gebruikt in combinatie met de zaailing bacteriële groei test, kan helpen bij het verder karakteriseren van de onderliggende weerstand tegen de bacterie, en kan worden gebruikt om het scherm mapping populaties om de genetische basis van resistentie te bepalen.
Dit hoge doorvoerprotocol maakt een snelle screening van tomatenzaailingen mogelijk van wilde toetredingen tot de bacteriële ziekteverwekker Pseudomonas syringae. De zaailing overstromingstest minimaliseert de groeitijd van planten en de groei kamer behoeften, maakt een snelle omzet van planten, en maakt het mogelijk grote steekproef maten worden getest. Deze test is een krachtig instrument dat kan worden gebruikt om te screenen op weerstand in wilde toetredingen en andere lijnen met complexe genetische achtergronden.
Het protocol biedt specifieke aanwijzingen voor overstromingsinenoculatie van twee Pseudomonas spuitstammen. Het is echter veelzijdig en kan worden aangepast om gastheerresistentie tegen andere bacteriële pathogenen te detecteren. Het aantonen van de procedure zal Zijn Yana Hasan, een onderzoeksspecialist in mijn laboratorium.
Begin met het kweken van de tomatenzaailingen. Doe tomatenzaden in een 2,2 milliliter microcentrifugebuis en voeg twee milliliter bleekmiddeloplossing van 50% toe. Rock de buis gedurende 25 minuten en verwijder vervolgens de bleekmiddeloplossing met een pipet.
Voeg twee milliliter ultra zuiver water toe en was de zaden door de buis vijf keer om te keren. Aspirate de vloeistof uit de buis, en herhaal de was nog vier keer. Voeg na de laatste wasbeurt twee milliliter ultrazuiver water toe en giet de zaden in een steriel petrischaaltje.
Steriliseren tangen door ze te vlammen in ethanol dan gebruiken om vijf tot zeven zaden over te dragen op een 100 bij 25 milliliter plaat met 0,5 XMS plus 0,8 procent agar media. Verzegel de randen van de plaat met chirurgische tape. Zorg ervoor dat de platen plat en naar boven worden gestapeld.
Stratificeer de gesteriliseerde zaden op vier graden Celsius in het donker gedurende ten minste drie dagen om de ontkieming te synchroniseren. Na drie dagen, verticaal oriënteren van de platen, zodat de wortels naar beneden groeien langs het oppervlak van de plaat en de lijn van zaden is horizontaal georiënteerd. Breng de zaden naar een groeikamer ingesteld op 22 graden Celsius met een 16-uurs licht, 8-uurs donkere cyclus.
Kweek de zaailingen tien dagen in de kamer, op welk punt ze meestal volledig te zien en uitgebreid cotyledons en opkomende eerste echte bladeren. Streep verse bacteriën op de juiste KB agar met een platte, steriele tandenstoker. Voor PstT1, incubeer de plaat op 28 graden Celsius gedurende 48 uur voorafgaand aan het gebruik van de bacteriën in de overstroming experiment.
Om het entmateriaal voor te bereiden, aseptisch resuspend de bacteriën in steriel, tien millimolar magnesiumchloride aan een optische dichtheid van 0.1. Maak vervolgens twee seriële verdunningen om een werkconcentratie te verkrijgen met een OD600 van 0075. Bereid ook een een tot tien verdunning van niet-ionische organosilicone oppervlakteactieve copolymeer in tien millimolar magnesiumchloride.
Vortex het en voeg het toe aan de bacteriën, wervelende de buis te mengen. Breng de platen met de tien dagen oude zaailingen van de groeikamer naar de bioveiligheidskast en verwijder de chirurgische tape. Breng vervolgens zes milliliter inoculum over op elke plaat.
Duw de zaailingen voorzichtig in het entmateriaal met een pipetpunt en start een timer gedurende drie minuten. Houd een plaat in elke hand en kantel de voorkant van de plaat naar beneden om de cotyledons en bladeren van de zaailingen onder te dompelen. Swish de entmateriaal kant aan de zijkant vijf tot zeven keer, dan tip de platen terug naar de wortels te dekken met het entmateriaal.
Kantel de platen weer naar beneden en herhaal de cyclus gedurende een totaal van drie minuten. Giet het entmateriaal van de platen, zet ze neer op een vlakke ondergrond en giet het resterende entmateriaal voor een tweede keer af. Wikkel de platen opnieuw en plaats ze terug in de groeikamer.
Moneymaker-PtoR en Moneymaker-PtoS cultivars werden overspoeld met PSTDC3000 en phenotyped zeven tot tien dagen na overstromingen. Moneymaker-PtoR zaailingen dragen de PtoPRF gencluster en waren resistent tegen de PSTDC3000. Terwijl bijna-isogene Moneymaker-PtoS zaailingen, die niet kunnen herkennen de PSTDC3000 effectors AVRPto of AVRPto-B snel stierf, binnen zeven dagen na overstromingen.
Tien dagen oude zaailingen werden overspoeld met PstT1 en fenotyped ten minste tien dagen na overstromingen. Gevoelige toetredingen waren dood, hadden bruine apicale meristems en misten nieuwe groei. Resistente zaailingen vertoonden daarentegen een hoog niveau van nieuwe groene groei en overleefden infectie met PstT1.
Bacteriële groeitesten werden uitgevoerd om kwantitatief te bevestigen PstT1 weerstand en Solanum NeoRici LA1329. Er was een 1.7 log verschil in bacteriële groei tussen resistente en gevoelige LA1329 en een 1.6 log verschil tussen resistente LA1329 en Moneymaker-PtoS, die gecorreleerd met de fenotypische resultaten. Bij het uitvoeren van deze test, de belangrijkste dingen om te onthouden zijn om veel aandacht te besteden aan aseptische techniek in het protocol en ervoor te zorgen dat alle zaailingen op de plaat grondig worden overstroomd.
Zorg ervoor dat u geïnfecteerd plantenweefsel en bacteriën autoclave en verwijdering van materialen in overeenstemming met de juiste regelgeving.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
De zaailing-overstromingsassay maakt snelle screening van wilde tomatenaccessies mogelijk op resistentie tegen de Pseudomonas syringae bacterie. Dit high-throughput protocol minimaliseert de groeitijd van de plant en maakt het mogelijk om grote steekproefgroottes efficiënt te testen.
Belangrijke onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Plantenpathologie
- Genetica
- Microbiologie
Achtergrond
- De seedling flood assay is ontworpen voor het screenen van tomatenkiemplanten.
- Pseudomonas syringae is een belangrijke bacteriële pathogeen die tomaten treft.
- Deze assay kan worden aangepast voor andere bacteriële pathogenen.
- Het ondersteunt de identificatie van genetische resistentie in wilde tomatenaccessies.
Doel van de studie
- Om wilde tomatenaccessies te screenen op resistentie tegen Pseudomonas syringae.
- Om de genetische basis van resistentie in kaartbrengingspopulaties te karakteriseren.
- Om een high-throughput methode te bieden voor het testen van grote steekproefgroottes.
Gebruikte methoden
- Overstromingsinoculatie van tomatakiemplantjes met Pseudomonas syringae-stammen.
- Beoordeling van de bacteriële groei in de kiemplantjes.
- Vergelijking van resistentieniveaus tussen verschillende accessies.
- Gebruik van groeikamercondities om de plantengroei te optimaliseren.
Belangrijkste resultaten
- De assay identificeert effectief resistente tomatenaccessies.
- Het maakt een snelle doorloop en het testen van grote steekproefomvangen mogelijk.
- Aantoonbare veelzijdigheid bij het detecteren van resistentie tegen diverse bacteriële pathogenen.
- Faciliteert verdere genetische analyse van resistentiekenmerken.
Conclusies
- De overstromingsassay voor zaailingen is een krachtig instrument voor het screenen van resistentie bij tomaten.
- Deze kan worden aangepast voor bredere toepassingen binnen de plantpathologie.
- Deze methode verhoogt de efficiëntie van resistentiescreening in onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Snelle identificatie van pathogeenresistentie in plantensystemen ondersteunt vroege targetvalidatie bij de ontdekking van agrochemicaliën en biopesticiden. De seedling flood assay maakt high-throughput fenotypische screening van wild kiemplasma mogelijk, wat de ontdekking van resistentiekenmerken met voorspellende waarde voor gewasbeschermingspipelines versnelt. Deze aanpak vermindert het biologische risico door resistentiemechanismen functioneel te valideren vóór resource-intensieve veldproeven.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt mechanismen van gastheer-pathogeeninteracties om resistentiepaden in tomaten te verduidelijken.
- Operationele waarde: Maakt functionele validatie van genetische loci mogelijk met behulp van discrete overlevingsfenotypes of kwantitatieve groeimetrieken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt de prioritering van resistentiekandidaten door fenotypische resultaten te correleren met bacteriële groeianalyses.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert reproduceerbare resistentiefenotypes in 10 dagen oude zaailingen, wat grootschalige evaluatie van kiemplasma mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Standaardiseert inoculatie- en overstromingsprocedures om een consistente blootstelling aan pathogenen over alle monsters te waarborgen.
- Schaalbaarheid: Vermindert de groeitijd en de benodigde ruimte in de groeikamer, waardoor een snelle doorloop en het testen van diverse accessies mogelijk is.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Koppel kiemlingresistentie-fenotypes aan veldrelevante resultaten via correlatie met gegevens over bacteriële proliferatie.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt onderscheid tussen effector-getriggerde gevoeligheid (bijv. AvrPto-herkenning) en breedspectrumresistentie met behulp van bijna-isogene lijnen.
- Preklinische continuïteit: Biedt een schaalbare primaire screening die ten grondslag ligt aan daaropvolgende genetische mapping en kenmerkvalidatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De assay past binnen het ontdekkingscontinuüm van kiemplasmashcreening tot lead-identificatie, waardoor vroege detectie van resistentiekenmerken mogelijk is vóór genetische mapping of veldvalidatie.
- Discovery Biology: Test effecten van het genotype van de gastheer op de overleving van pathogenen en de vitaliteit van zaailingen na gecontroleerde inoculatie door overstroming.
- Screening: Levert kwantitatieve (meting van nieuwe groei) en kwalitatieve (overleving/dood) outputs voor resistentiescoring.
- Analytics: Maakt correlatie van fenotypische resistentie met verschillen in bacteriële groei mogelijk (bijv. 1,6–1,7 log reductie) om hits te valideren.
- Translational Research: Verbindt zaailingassays met validatie van resistentiegenen via vergelijkingen van bijna-isogene lijnen.
- Enterprise Reuse: Aanpasbaar voor meerdere Pseudomonas syringae-stammen en andere bacteriële pathogenen met minimale aanpassingen aan het protocol.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door resistentiefenotypes te koppelen aan gedefinieerde genetische achtergronden (bijv. aanwezigheid/afwezigheid van Pto/Prf).
- Operationele waarde: Verhoogt de doorvoer via een geminimaliseerde groeicyclus en gestandaardiseerde flood-inoculatie.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de verdere ontwikkeling van resistentiekenmerken door vroege fenotypische en kwantitatieve bevestiging te bieden.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van wilde accessies mogelijk op basis van gevalideerde resistentisterkte en genetische hanteerbaarheid.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in aseptische technieken, de omgang met pathogenen en plantengroei onder gecontroleerde omstandigheden.
- Afhankelijk van een biologische veiligheidskabinet, groeikamers met precieze licht-/temperatuurcycli en spectrofotometrie voor de standaardisatie van het inoculum.
- Kruis-team standaardisatie van het tijdstip van overstroming, kantcycli en inoculumvolume is noodzakelijk voor de reproduceerbaarheid tussen experimenten.
- Aanpassing aan nieuwe pathogene stammen vereist optimalisatie van de bacteriële OD600 en surfactantconcentratie, terwijl de levensvatbaarheid van de zaailingen behouden moet blijven.
- De nauwkeurigheid van de fenotypische score hangt af van consistente incubatieperioden na overstroming en een objectieve beoordeling van nieuwe groene groei.
