Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Deze methode is handig om meerdere biomarkers in één cryosection te detecteren en te colokaliseren, inclusief markeringen die normaal gesproken niet detecteerbaar zijn in paraffinesecties. Met behulp van deze experimentele kleuringsmethode wordt de kleuringstijd aanzienlijk verkort en kan de methode in elk laboratorium worden uitgevoerd. Het demonstreren van deze methode zal Dinesh Jaishankar zijn.

Hij is een ervaren postdoc uit het lab, en ook de Immunotherapy Assessment Core, Facilities Manager. Houd bij het selecteren van antilichamen voor de analyse rekening met de excitatie- en emissiefiltersets die beschikbaar zijn op het semi-geautomatiseerde beeldvormingssysteem. En na het testen van verschillende combinaties van fluorofofoër geconjugeerde primaire antilichamen, bereiden fluoroforen worden gebruikt, zodat u minimale spectrale overlap zoals voorgesteld in de tabel.

Voor multiplex kleuring, bereiden een cocktail van antilichamen met compatibele fluoroforen bij vooraf bepaalde optimale wanen, en voeg de cocktail aan de weefselsecties van belang. Voor enkele marker kleuring, voeg de primaire geconjugeerde antilichaam alleen aan de dia. Voor alle kleuringen, omvatten een controle onbevlekte dia die dezelfde kleuring procedure ondergaat zonder de toevoeging van een primaire geconjugeerde antilichaam.

Na een incubatie van een uur bij kamertemperatuur beschermd tegen licht, was de glijbanen twee keer met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, teller vlek de multiplex bevlekte dia's met DAPI gedurende zeven minuten op kamertemperatuur beschermd tegen licht, gevolgd door twee vijf minuten wasbeurten in PBS. Als u een spectrale bibliotheek wilt maken, stelt u de lampkracht van het multispectrale beeldvormingssysteem in op 100% en opent u de bedieningssoftware voor de microscoop.

Selecteer Protocol en nieuw protocol bewerken. Voer een protocolnaam in en selecteer Fluorescentie onder de beeldmodus. Geef vervolgens een studienaam op en laad de enkele gekleurde dia's op het podium.

Klik op Belichting bewerken en gebruik de opties voor automatisch scherpstellen en automatisch blootleggen om de belichtingstijden aan te passen en momentopnamen voor de enkele gekleurde dia's te verkrijgen. Sla na het beeldvorming van de enkele gekleurde dia's het protocol op. En laad in de machine learning-software onder het tabblad Build Library elke enkele gekleurde afbeelding.

Selecteer de juiste vloer en klik op Uitpakken. De software zal automatisch het fluorescerende signaal dat in de vloer wordt geselecteerd, extraheren. Als u de geëxtraheerde kleur wilt opslaan, klikt u op Opslaan om op te slaan.

Er kan een nieuwe groep worden gemaakt of de geëxtraheerde kleur kan worden opgeslagen in een bestaande groep. Voor multispectrale beeldvorming, zodra de spectrale bibliotheek is gemaakt en geverifieerd, pas de focus en belichtingstijden op de multiplex gekleurde dia zoals aangetoond, en opent gescande dia's om een nieuwe taak te maken. Geef een dia-id op en selecteer een protocol.

Selecteer onder taak de hele diascan om een hele diascan uit te voeren op de met meerdere stained dia's. Selecteer in de hele diascanafbeelding interessegebieden in de afbeelding. Deze gebieden worden gescand met behulp van de eerder ingestelde belichtingstijden op de multiplexdia die moet worden gebruikt voor spectrale niet-mengen en analyseren.

Selecteer in de microscoopbesturingssysteemsoftware de optie MSI-velden onder taak aanschaffen en klik vervolgens op Dia verwerken om interessegebieden te verwerven bij een vergroting van 20x. Zodra de interessegebieden zijn verworven, klikt u in de machine learning-software op Bestand en Openen onder het tabblad handmatige analyse om de multiplex gekleurde afbeeldingen te laden. Selecteer de spectrale bibliotheekbron en klik op Vloeren selecteren om de eerder opgeslagen spectrale bibliotheek te kiezen.

Klik op Bestand en Openen om de niet-bevlekte afbeelding te laden. Klik vervolgens op het pictogram autofluorescentieinktmarkering en teken een lijn of gebied op de niet-gekleurde dia om autofluorescentie in het weefsel te identificeren. Wijs vervolgens onder het tabblad Markeringen en kleuren bewerken namen toe voor elke markering en klik op Alles voorbereiden.

Selecteer in de machine learning-software de cytoplasmamemmembraan- en markeropties in het paneel nadat u het spectrally unmixed-afbeelding hebt geverifieerd. En met behulp van de ellipsknop, selecteert u gebruik maken van dit signaal te vinden, om de marker te configureren om ofwel de kernen, cytoplasma of membraan te detecteren. wanneer een cytoplasma- of membraanmarkering is gekozen, selecteert u de optie Signaal gebruiken om te helpen bij het splitsen van kernsplitsing.

De software detecteert en creëert automatisch individuele maskers voor de kern, cytoplasma en membraan. Gebruik de pathologieweergave voor een specifieke markering en de configuratieopties in de software om de maskers aan te passen en klik op Alles segmenteren om een celsegmentatiekaart te maken. Selecteer na celsegmentatie de markeringen om de positieve cellen te fenotyperen.

Selecteer bovendien ten minste vijf cellen die niet zijn gekleurd met de gekozen marker om de negatieve cellen te fenotypeeren. Klik vervolgens op Classificatie trainen om de software te trainen om automatisch alle cellen te detecteren die zijn gekleurd met de geselecteerde markeringen in de afbeelding. Er wordt een fenotypekaart gemaakt.

Zoals deze beelden aantonen, antilichamen gevalideerd voor flow cytometrie kan worden gebruikt om weefsel vlekken visualiseren met behulp van de vloeibare kristal tunable filter in de semi-geautomatiseerde imaging systeem. Hier kan een spectraal ongemengde afbeelding van bevroren menselijke amandel worden waargenomen die etikettering van B-cellen en Prolifererende cellen binnen het folliculaire kiemvormige centrum, en het inter folliculaire T-celgebied omvat. De pathologieweergavenoptie maakt visualisatie van het individuele kleurpatroon voor elke marker in het weefsel van belang mogelijk, wat suggereert dat de multiplexkleuringsmethode en spectrale beeldvorming werken op bevroren weefsel.

Zoals aangetoond op een bevroren muis tumor sectie, multispectrale beeldvorming kan ook worden gebruikt om tumor infiltreren T-cellen, en andere myeloïde cel lijntjes met inbegrip van tumor geassocieerde macrofagen visualiseren. Celsegmentatie en fenotype kaarten, en het aantal gekleurde cellen voor elke marker geanalyseerd door de software kan worden gegenereerd, waaruit blijkt dat de software kan worden gebruikt voor kwantificering van de multispectrale vlekken op bevroren weefsels. Voor iemand die nieuw is 6to de techniek, is het belangrijk om de specifieke kenmerken van uw fluorchromes te leren kennen en kwaliteitsbibliotheekdia's voor te bereiden op spectrale unmixing met minimale spectrale overlapping.

Het is ook belangrijk om antilichaam titratie uit te voeren. Naar onze mening kan deze methode informatie aan het bed geven over de werkzaamheid van immunotherapie voor kanker en andere therapeutische toepassingen, vooral wanneer timing van essentieel belang is.