In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Ons protocol maakt het mogelijk om restrictieenzymen te maken met gewijzigde, strengere sequentiespecificiteiten met behulp van in vitro compartimentering en een unieke selectiestrategie in gerichte evolutie. Potentieel is het vrij universeel, aangezien het op om het even welke beperking van toepassing zou moeten zijn endonuclease en de selectie naar om het even welke striktere versie van een originele cognateopeenvolging kan worden geleid. Als nieuw gecreëerde varianten worden uitgedrukt door in vitro transcriptie-vertaling, is het protocol niet alleen geschikt voor het beperken van specificiteit, maar ook voor het wijzigen van specificiteit.

Om sites voor subsaturatie mutagenesis te beslissen, kies mutagenesis frequenties op basis van het hypothetische belang van de sites, waarbij grenzen aan de algehele complexiteit van de bibliotheek in het achterhoofd. Om de synthese te beginnen, voeg kolommen die zijn verpakt met nieuwe hars in de synthesizer. Synthetiseer oligonucleotiden in alle kolommen tot aan de triplet, onmiddellijk voorafgaand aan de tweede subsaturatie mutagenesis site tellen van de drie-prime einde.

Synthetiseren, het verlaten van een vijf-prime trityl groep aan het eind. De beschermende groep wordt verwijderd aan het begin van de volgende synthesecyclus. Open de synthesekolommen en vercentrifugeer kort in droge 1,5 milliliter buizen om de hars te verzamelen.

Trek de CPG synthese ondersteuning en meng door vortexing. Herscheiden van de gemengde CPG hars in nieuwe synthese kolommen. Vermijd de invoering van vochtigheid, omdat het de totale opbrengst zal verminderen.

Zet de synthese voort, vanaf de subsaturatie mutagenesis site triplet. Wijs kolommen toe aan gerandomiseerde NNS-drieling of wild-type drieling volgens de gewenste mutagenesisfrequentie. Als er extra subsaturatielocaties aanwezig zijn, gaat u alleen verder met de triplet die voorafgaat aan de volgende subsaturatiemutagenesissite.

Als er niet meer subsaturatie sites zijn stroomafwaarts aanwezig, vul de synthese, waardoor een vijf-prime trityl groep aan het einde. Gebruik brede boring pipet tips om een olie oppervlakteactieve mengsel te bereiden door het toevoegen van 225 microliter van Span 80 en 25 microliter van Tween 80 tot vijf milliliter minerale olie in een 15 milliliter conische buis. Meng grondig door zachte inversie 15 keer.

Het mengsel bij deze stap moet doorschijnend zijn. Breng voor elke bibliotheek 950 microliter van het olie-oppervlakteactieve mengsel over op een cryogene flacon met twee milliliter ronde bodem. Label met een bibliotheeknaam en overdracht naar ijs.

Doe een kleine cilindrische roerbar in elke flacon. Bereid een in vitro transcriptie-vertaling reactie mengsel volgens de suggesties van de fabrikant. Vul het mengsel aan met magnesiumchloride tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 millimolar.

Doe 50 microliter aliquots van het reactiemengsel in 1,5 milliliter buizen op ijs. Voeg 1,7 femtomoles van de bibliotheek toe aan het reactiemengsel op ijs. Bereid water-in-olie emulsie achtereenvolgens voor elke bibliotheek door eerst het plaatsen van een klein bekerglas gevuld met ijs op een magnetische roerder met de roersnelheid ingesteld op 1150 RPM.

Breng vervolgens een cryogene flacon met 950 microliter olieafdrijvingsmengsel en een kleine roerstaaf over naar een ijskoud bekerglas op de magneetroerder. Controleer of de roerbar draait. Voeg vijf 10-microliter aliquots van de in vitro bibliotheek transcriptie-vertaling mengsel over een periode van twee minuten in 30 seconden intervallen en blijven roeren voor een extra minuut.

Breng de flacon met de emulsie over naar een ijscontainer. Op dit punt moet de vloeistof ondoorzichtig zijn, niet doorschijnend. Ga dan verder met de volgende bibliotheek.

Nadat alle bibliotheken zijn verwerkt, start de incubatie van alle bibliotheken volgens de aanbevelingen van de kitfabrikant. Breng de flesjes op de temperatuur optimaal voor de ontworpen endonuclease voor een extra twee uur voordat ze op ijs voor ten minste 10 minuten. Breng de emulsies van de cryogene flesjes over in buizen van 1,5 milliliter.

Voeg een microliter van 5 molaire EDTA toe. En centrifugeren ze op 13.000 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Als u na het centrifugeren de waterolie-interface niet duidelijk zien, bevriest u het mengsel voor de aspiratie van de bovenste oliefase.

Verplaats de bovenste oliefase met een pipet en gooi het weg. Voer onmiddellijk extractie uit door 150 microliter fenolchloroform en 100 microliter van 10 millimolar Tris-HCl toe te voegen aan de waterige fase. Vortex en voer dan fasescheiding uit via 30-seconden centrifugatie op 13.000 keer g.

Verzamel de bovenste waterige fase. Precipitate het DNA door toevoeging van 15 microliters van drie-molaire natriumacetaat, 2,5 tot vijf microgram glycogeen, en 375 microliter ethanol. Na het uitbroeden van de monsters bij min-20 graden Celsius gedurende een uur, centrifuge gedurende 15 minuten op 13.000 keer g, vier graden Celsius.

Gooi de supernatant weg en was de pellet kort met een milliliter koude 70%-ethanol. Droog de DNA glycogeen pellet in een snelheid vac of luchtdroger voor langer dan vijf minuten. Los vervolgens de pellet op in 50 microliter van 10 millimolar Tris-HCl.

Voeg vervolgens vijf microliters van streptavidin magnetische kralen, bereid volgens de instructies van de fabrikant. Meng gedurende een uur bij kamertemperatuur, bij voorkeur in een carrouselmixer of door zachte vortexing. Breng de buizen naar een magnetische standaard om de kralen te scheiden.

Verzamel vervolgens de vloeistof verrijkt in DNA zonder biotine. Dit protocol is een hulpmiddel om de frequentie van de gewenste varianten van engineered restriction endonucleases te verhogen door inactieve enzymen en endonucleases uit te putten met ongewijzigde wild-type sequentiespecificiteit. Succesvolle screening kan tot 20% van de veelbelovende varianten identificeren.

Varianten worden aangeduid als veelbelovende varianten als ze produceren een decolleté patroon onderscheiden van de wilde-type enzym. Varianten die mogelijk de voorkeur voor volgorde hebben gewijzigd, worden ook gelabeld. Hier getoond is een mislukte screening met de meerderheid van variantie inactief en een variant met schijnbaar ongewijzigd decolleté patroon.

In dit geval worden de bibliotheken waarschijnlijk gedomineerd door inactieve varianten die ontsnapten aan de streptavidin-selectiestap. Het is van cruciaal belang om de geselecteerde en tegengekozen sequenties zorgvuldig te ontwerpen en de diversiteit van de bibliotheek te beperken door mutagenesis-strategie die vervangingen genereert in slechts een paar geselecteerde posities. De beste geselecteerde varianten moeten grondig worden gekarakteriseerd voor binding en decolleté kinetiek op voorkeur en niet splijtde sequenties op basis van de resultaten van de eerste screening.

In onze testcase werden mutagenesissites geselecteerd op basis van een homologiemodel. Verrassend, een kristalstructuur later bleek dat sommige veranderde residuen zijn waarschijnlijk niet in direct contact met DNA.