Effect van kunstmatige traanformuleringen op de metabolische activiteit van menselijke cornea-epitheelcellen na blootstelling aan uitdroging

Het doel van dit protocol is om in een in vitro-model te evalueren of formuleringen van kunstmatige traanvloeistoffen menselijke hoornvlies-epitheelcellen kunnen beschermen tegen uitdroging. Deze methode kan worden gebruikt om formuleringen voor droge ogen te identificeren die kunnen helpen bij de bescherming van het oog voor personen met symptomen van droge ogen. Deze test maakt gebruik van een zeer gevoelige meting van het detecteren van metabolische activiteit van hoornvlies-epitheelcellen.

Als gevolg hiervan kunnen kleine veranderingen in de gezondheid van de hoornvliescellen als gevolg van uitdroging worden gedetecteerd. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Parisa Mirzapour, Nijani Nagaarudkumaran en Adeline Suko. Begin door geïmmortaliseerde menselijke hoornvlies-epitheelcellen te kweken in met collageen gecoate flesschen met 20 milliliter DMEM/F12 bevattend 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline/streptomycine bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide, waarbij het medium elke twee tot drie dagen wordt ververst.

Zodra de cellen bijna confluent zijn, verwijdert u het celkweekmedium en voegt u vier tot zes milliliter celdissociatiemedium toe aan elke fles. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius totdat ze loslaten, waarbij u ze periodiek onder de microscoop controleert. Voeg twee tot zes milliliter DMEM/F12 met 10%FBS toe aan elke fles en breng de inhoud over naar een centrifugebuis van 50 milliliter.

Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 450 tot 500 keer g. Aas vervolgens de supernatant en resuspendeer de cellen in voorverwarmd medium. Bepaal de celconcentratie met een hemocytomeeter en bereken het volume dat 100.000 cellen bevat.

Voeg medium toe aan elke put van een 48-well, collageen I-gecoate kweekplaat, samen met het berekende volume cellen, en zorg ervoor dat het uiteindelijke volume in elke put 0,5 milliliter is. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 24 uur. Voor de controleprocedure verwijdert u het kweekmedium uit de putten en behandelt u de cellen onmiddellijk met 150 microliters van een testformulering of mediacontrole-oplossing.

Incubeer vervolgens de cellen gedurende 30 minuten. Verwijder de testoplossing van de cellen en voeg 0,5 milliliter 10% metabole kleurstoffoplossing toe. Incubeer de cellen nog eens vier uur.

Na de incubatie verwijdert u 100 microliters kleurstoffoplossing uit elke put en brengt u deze over naar een 96-well plaat. Gebruik een platenlezer om de fluorescentie van elke put te meten, waarbij de excitatie op 540 nanometer en emissie op 590 nanometer wordt ingesteld. Om de herstelprocedure uit te voeren, incubeer de cellen met de testoplossingen of controles zoals eerder beschreven.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter DMEM/F12-medium toe aan elke put. Incubeer de cellen gedurende 18 uur. Verwijder vervolgens het medium en test op metabolische activiteit.

Om de controleprocedure uit te voeren, verwijdert u het kweekmedium van de cellen in de 48-well plaat en behandelt u ze onmiddellijk met de testformulering of mediacontrole-oplossing. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na de incubatie verwijdert u de testoplossingen van de cellen en plaatst u ze vijf minuten in een kamer met een temperatuur van 37 graden Celsius en 45% vochtigheid om uit te drogen.

Voeg vervolgens 0,5 milliliter 10% metabole kleurstoffoplossing toe en incubeer de cellen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Na de incubatie brengt u 100 microliters van de metabole kleurstoffoplossing van elke put over naar een 96-well plaat en meet u de fluorescentie. Om de herstelprocedure uit te voeren, herhaalt u het eerder beschreven protocol en neemt u een incubatie van 18 uur met DMEM/F12-medium op na de uitdrogingsstap.

Voer vervolgens statistische analyse uit op de gegevens zoals beschreven in het tekstmanuscript. Drie formuleringen voor droge ogen werden vergeleken op hun effect op de levensvatbaarheid van menselijke hoornvlies-epitheelcellen. Oplossingen één en twee hadden een significant effect op de metabolische activiteit van de cellen vóór uitdroging.

Cellen blootgesteld aan oplossing één vertoonden een extra daling in cellulaire metabolische activiteit na een herstel van 18 uur, wat betekent dat ze aanvankelijk waren gewond en dat de verwonding niet werd hersteld. In vergelijking had oplossing drie slechts een mild effect op de metabolische activiteit van de epitheelcellen. Bij het vergelijken van het vermogen van deze lipide-bevattende formuleringen voor droge ogen om de cellen te beschermen, werd gevonden dat oplossingen één en twee de cellen niet beschermden tegen uitdrogingsstress.

Oplossing drie bood echter enige bescherming. Bij het zaaien van de cellen in met collageen gecoate platen, zorg ervoor dat de celsuspensie cellen bevat die uniform gemengd zijn, zodat elke put met gelijke celnummers wordt gezaaid. Oplossing drie toonde statistisch significante verbetering in cellevensvatbaarheid en bescherming tegen uitdrogingsstress ten opzichte van de andere twee lipide-bevattende producten.

Het is mogelijk dat minerale olie met fosfolipiden, samen met HP-guar en propyleenglycol, oplossing drie in staat stellen om hydratatiebescherming te bieden aan de hoornvliescellen en verminderde verdamping onder uitdroging.