Name: Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Leer immunofluorescentie voor visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Deze methode ondersteunt onderzoek naar de rol van oestrogeen in darmontstekingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd gepubliceerd dankzij de financiële steun van de autoriteiten van de Universiteit van Lodz: vicerector wetenschappelijk onderzoek, vicerector nationale en internationale samenwerking en decaan van de faculteit Biologie en Milieubescherming. Damian Jacenik werd ondersteund door subsidies (2017/24/T/NZ5/00045 en 2015/17/N/NZ5/00336) van National Science Centre, Polen.

Dierstudies werden uitgevoerd met toestemming van het Lokaal Ethisch Comité (28/ŁB29/2016) overeenkomstig Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad van 22 september 2010 en institutionele aanbevelingen.
1. TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn
OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van mannelijke BALB/C muizen met een gewicht van 25-28 g. Dieren zijn gehuisvest bij een constante temperatuur (22-24 °C) en, relatieve vochtigheid 55 ± 5%, en onderhouden in een 12 uur licht/donker cyclus met gratis toegang tot standaard chow pellets en kraanwater ad libitum.
<ol><li>Plaats de muis in de inductiekamer en sluit het deksel stevig. Verdoven de muis kort met isoflurane (25% O2 met O2-stroomsnelheid bij 1,5-2 L/min). OPMERKING: Ademhalingsfrequentie moet ritmisch en langzamer blijven dan normaal en mag niet veranderen in reactie op een schadelijke stimulus.</li>
	<li>Breng 4 mg TNBS in 0,1 mL van 30% ethanol in 0,9% NaCl of 0,1 mL van 30% ethanol in 0,9% NaCl als voertuigcontrole in de distale dikke darm via een katheter. OPMERKING: De katheter moet zorgvuldig worden ingevoerd ongeveer 3 cm in de anus.</li>
	<li>Controleer de muis dagelijks van dag twee tot acht op klinische parameters, waaronder lichaamsgewicht, rectale bloedingen, ontlastingconsistentie en mortaliteit.</li>
	<li>Op dag acht, euthanaseren de muis door cervicale dislocatie.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60813/60813fig1.jpg"> Figuur 1: Tijdlijn voor TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60813/60813fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
2. Scheiding en macroscopische evaluatie van de dikke darm
LET OP: Verdun een dag voor de scheiding van de dikke darm 100 μL antibioticum in 1 mL fosfaatbufferzout (PBS) en laat bij 4 °C 's nachts.
<ol><li>Reinig de huid over de buik met 75% ethanol en steriel gaas.</li>
	<li>Snijd de buikwand van borstbeen tot anus met behulp van steriele schaar en pincet.</li>
	<li>Snijd de dikke darm zo dicht mogelijk bij de anus en cecum.</li>
	<li>Leg de dikke darm op de petrischaal. Snijd de dikke darm mee van de anus in het cecum einde. Reinig en was de dikke darm 2-4 keer in koude antibioticum-PBS oplossing.</li>
	<li>Macroscopische evaluatie uitvoeren met behulp van een remklauw volgens tabel 1. OPMERKING: Weefselhechting* en erythema / bloeding#, fecale bloed# en diarree# zijn onderworpen aan visuele beoordeling. * Weefselhechting evalueren met behulp van een drie-puntschaal (0: dikke darm zonder weefselhechting, 1: dikke darm met matige weefselhechting, 2: dikke darm met uitgebreide weefselhechting); #gebaseerd op afwezigheid (0) of aanwezigheid (1) van erythema / bloeding, fecale bloed en diarree.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hechting*</td>
			<td>Erythema/ bloeding#</td>
			<td>Fecale bloed#</td>
			<td>Diarree#</td>
			<td>Lengte van de zweer</td>
			<td>Dikke darmdikte</td>
			<td>Colonlengte</td>
		</tr>
<tr>
<td>punten (0 – 2)</td>
			<td>punten (0 – 1)</td>
			<td>punten (0 – 1)</td>
			<td>punten (0 – 1)</td>
			<td>cm/punten</td>
			<td>mm/punten</td>
			<td>cm/punten</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 – afwezig</td>
			<td>0 – afwezig</td>
			<td>0 – afwezig</td>
			<td>0 – afwezig</td>
			<td rowspan="3">0,5 cm = 0,5 punt</td>
			<td rowspan="3">
n mm = n punten</td>
			<td>0 – <10% korter dan de besturing</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 – matig</td>
			<td>1 – aanwezig</td>
			<td>1 – aanwezig</td>
			<td>0,5 – lichte/losse ontlasting</td>
			<td>1 – van 10 tot 20% korter dan de controle</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 – aanwezig</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 – aanwezig</td>
			<td>2 – meer dan 20% korter dan de controle</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Macroscopische score van de darm van muizen met TNBS-geïnduceerd model van de ziekte van Crohn.
<ol start="6"><li>Zet de lengte van de zweer in centimeters om in een puntschaal, d.w.z. elke 0,5 cm zweer wordt geteld als 0,5 punt. Zet de dikte van de dikke darm in millimeters om in een puntschaal, d.w.z. elke n mm komt overeen met n punten.</li>
	<li>Zet de lengte van de dikke darm in centimeters op een schaal van drie punten. De lengte van de dikke darm verkregen van elke muis met TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn wordt geëvalueerd in relatie tot de gemiddelde dubbele puntlengte voor de controlegroep (0: <10% korter dan de controle, 1: van 10 tot 20% korter dan de controle, 2: meer dan 20% korter dan de controle).</li>
	<li>Bereken de totale macroscopische score volgens de vergelijking: Totale macroscopische score = hechting (punten) + erythema/bloeding (punten) + fecal bloed (punten) + diarree (punten) + lengte van de zweer (punten) + dikke darmdikte (punten) + colonlengte (punten).</li>
</ol>3. Colon monster voorbereiding
<ol><li>Snijd de dikke darm in fragmenten van 1-2 cm en leg ze elk op spons in een passend gelabelde histologische cassette. LET OP: Sponzen voor histologische cassettes voorkomen dat dikke darm vouwen tijdens uitdroging en incubatie in vloeibare paraffine.</li>
	<li>Plaats het darmfragment in 4% formaldehyde en uitbroed gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid en programmeer de weefselprocessor op 1 uur incubatie in 50%, 70%, 90%, 95%, 100% ethanol, xyleen/100% ethanol (1:1; v/v), en xyleen alleen, evenals voor ten minste 3 uur incubatie in vloeibare paraffine. OPMERKING: Uitdroging moet worden uitgevoerd in toenemende concentraties ethanol en xyleen, maar de concentratie ethanol kan worden gewijzigd. Het xyleen/ethanolmengsel wordt aanbevolen, maar niet vereist.</li>
	<li>Breng het dikke darmfragment over naar een histologische doos en plaats in de voorgeprogrammeerde weefselverwerker.</li>
	<li>Voer de weefselprocessor uit.</li>
	<li>Na incubatiestappen, plaats de dikke darm fragment in een metalen mal, zodat de twee uiteinden van de dikke darm zijn in een rechte positie en vul een derde van de mal met vloeibare paraffine.</li>
	<li>Plaats de mal in het koelgebied (-5 °C) gedurende een paar seconden en verplaats de mal naar het opwarmende gebied (70 °C). Plaats in het onderste deel van de histologische doos en bedek het hele dikke darmfragment met vloeibare paraffine.</li>
	<li>Laat de metalen mal met de dikke darm fragment in paraffine voor een paar minuten in het koelgebied. Verwijder de metalen mal uit het paraffineblok en uitbroed gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder overtollige paraffine uit het blok en steek het in een volledig geautomatiseerde roterende microtoom. LET OP: Het paraffineblok kan enkele minuten voor deze stap bij -20 °C worden opgeslagen.</li>
	<li>Snijd het dikke darmfragment in secties van 5 μm.</li>
	<li>Breng de puntsectie over op een voorverwarmd waterbad tot 40 °C.</li>
	<li>Gebruik de gelabelde glazen schuif om de puntsectie uit het waterbad te verwijderen. LET OP: De dikke darm secties drijven op het water. Zet de gelabelde glazen schuif in het water onder de puntsectie en trek de glazen schuif voorzichtig terug.</li>
	<li>Laat de glazen glijbaan 24 uur bij kamertemperatuur. Voor langdurige opslag houdt u de glazen schuif na 24 uur incubatie bij kamertemperatuur op 4 °C.</li>
</ol>4. Immunohistochemie met immunofluorescentiekleuring
OPMERKING: Laat de puntsectie niet in de loop van de procedure drogen.
<ol><li>Verwijder paraffine door het uitbroeden van de glazen schuif in xyleen gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Plaats de glasplaat in xyleen/100% ethanol (1:1; v/v) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Rehydrateer de puntsectie in een reeks afnemende ethanolconcentraties, d.w.z. 70%, 50%, 30% en 10% ethanol gedurende 5 minuten. Herhaal elke stap drie keer.</li>
	<li>Spoel de glazen schuif 5 min onder stromend water.</li>
	<li>Verwarm antigeenterugwinningsbuffer (10 mM natriumcitraat; 0,05% Tween 20, pH 6,0) tot 95-98 °C en verwarm de glasplaat in kokende antigeenophaaloplossing gedurende 10 min. OPMERKING: De antigeen ophaalstap is optioneel, maar aanbevolen. De ontmaskeringsoplossing moet worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het antilichaam dat in het experiment wordt gebruikt.</li>
	<li>Teken een cirkel rond de puntpuntsectie met behulp van een hydrofobe pen. OPMERKING: Deze stap is optioneel, maar aanbevolen. De hydrofobe pen voorkomt verspilling van reagentia door de vloeistof in een klein volume binnen te houden, de cirkel gemarkeerd.</li>
	<li>Incubeer de sectie in 3% wateroplossing van waterstofperoxidase gedurende 10 min.</li>
	<li>Was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) gedurende 5 min.</li>
	<li>Incubeer in blokkerende oplossing (5% normaal geitenserum; 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl; 0,05% Triton X-100) voor 1 uur bij kamertemperatuur. OPMERKING: In de blokkeringsoplossing moet het normale serum van dezelfde soort zijn als het secundaire antilichaam. Plaats de glazen schuif in een vochtigheidskamer in fasen waar incubatie nodig is om overmatige verdamping te voorkomen.</li>
	<li>Verwijder de blokkeringsoplossing en voeg 20-50 μL primair antilichaam toe tegen ERα, ERβ of GPER verdund in 1% runderserumalbumine met 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100. OPMERKING: Aanbevolen verdunningen van primaire antilichamen worden weergegeven in tabel 2.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antilichaamtype</td>
			<td>Antilichaam tegen</td>
			<td>Clonaliteit</td>
			<td>Gastheersoorten</td>
			<td>Reactiviteit van soorten</td>
			<td>Verdunning</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="13">Primaire</td>
			<td rowspan="4">ERα ERα</td>
			<td rowspan="4">Polyclonal</td>
			<td rowspan="4">Konijn</td>
			<td>Menselijke</td>
			<td rowspan="13">1:100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Muis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Turtle</td>
		</tr>
<tr>
<td>Capibara Capibara</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="6">ERβ ERβ</td>
			<td rowspan="6">Polyclonal</td>
			<td rowspan="6">Konijn</td>
			<td>Menselijke</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aap</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Muis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Schapen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Varken</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">GPER</td>
			<td rowspan="3">Polyclonal</td>
			<td rowspan="3">Konijn</td>
			<td>Menselijke</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Muis</td>
		</tr>
<tr>
<td>Secundaire</td>
			<td>DyLight 650</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Geit</td>
			<td>Konijn</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2: Kenmerken van antilichamen.
<ol start="11"><li>Incubeer met primair antilichaam 's nachts bij 4 °C in duisternis.</li>
	<li>Verwijder de antilichaamoplossing en was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl; 0,05% Tween 20) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Voeg 20-50 μL DyLight 650 secundaire antilichaam verdund in 1% runderserumalbumine toe (met 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100). Incubeer met secundaire antilichaam geconjugeerd met kleurstof voor 1 uur bij kamertemperatuur in het donker. OPMERKING: De aanbevolen verdunning van het secundaire antilichaam wordt weergegeven in tabel 2.</li>
	<li>Verwijder de antilichaamoplossing en was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Voeg 2% DiOC6(3) verdund in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl en incubeer gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker.</li>
	<li>Verwijder de oplossing en was in wasoplossing (50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,05% Tween 20) gedurende 5 min. Herhaal deze stap drie keer.</li>
	<li>Voeg een paar druppels glycerol-gebaseerde vloeistof met DAPI direct op de dikke darm sectie en zorgvuldig bedekken met een cover slide. Bebroed de puntsectie gedurende ten minste 24 uur bij 4 °C. LET OP: Vermijd luchtbellen bij het bedekken van het weefsel met de dekselschuif.</li>
	<li>Analyseer de dubbele punt sectie onder confocale microscoop met 20x of 63x doelstellingen en olie onderdompeling met behulp van speciale software. OPMERKING: Tabel 3 bevat kenmerken van de fluorchroom die in deze studie wordt gebruikt.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">Fluorochome type</td>
			<td colspan="2">Golflengte (nm)</td>
			<td rowspan="2">Kleurstof</td>
		</tr>
<tr>
<td>Excitatie</td>
			<td>Emissie</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI DAPI</td>
			<td>405</td>
			<td>460 – 480</td>
			<td>Blauwe</td>
		</tr>
<tr>
<td>DiOC6 (3)</td>
			<td>485</td>
			<td>538 – 595</td>
			<td>Groene</td>
		</tr>
<tr>
<td>DyLight 650</td>
			<td>654</td>
			<td>660 – 680</td>
			<td>Rode</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3: Kenmerken van fluorchroom.

<ol><li>Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%3A+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease: pathogenesis.</a> World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).</li>
<li>Morris, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten-induced+model+of+chronic+inflammation+and+ulceration+in+the+rat+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.</a> Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).</li>
<li>Okayasu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+in+the+induction+of+reliable+experimental+acute+and+chronic+ulcerative+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice.</a> Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).</li>
<li>Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone+colitis%3A+a+murine+model+of+T+helper+cell+type+2+colitis+treatable+with+antibodies+to+interleukin+4%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4.</a> Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).</li>
<li>Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cells+that+express+high+levels+of+CD45RB+induce+wasting+disease+when+transferred+into+congenic+severe+combined+immunodeficient+mice.+Disease+development+is+prevented+by+cotransfer+of+purified+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).</li>
<li>Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-10-deficient+mice+develop+chronic+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis.</a> Cell. 75 (2), 263-274 (1993).</li>
<li>Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous%2C+heritable+colitis+in+a+new+substrain+of+C3H%2FHeJ+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice.</a> Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).</li>
<li>Harnish, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effects+of+estrogen+treatment+in+the+HLA-B27+transgenic+rat+model+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease.</a> American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).</li>
<li>Pierdominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+estrogen+receptor+%CE%B2+expression+with+inflammatory+bowel+disease+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity.</a> Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).</li>
<li>Włodarczyk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+receptor+30+%28GPR30%29+expression+pattern+in+inflammatory+bowel+disease+patients+suggests+its+key+role+in+the+inflammatory+process.+A+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+and+Liver+Diseases%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study.</a> Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).</li>
<li>Mohammad, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+contributes+to+T+cell-mediated+autoimmune+inflammation+by+promoting+T+cell+activation+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation.</a> Science Signaling. 11 (526), eaap9415(2018).</li>
<li>Jacenik, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G+protein-coupled+estrogen+receptor+mediates+anti-inflammatory+action+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn's disease.</a> Scientific Reports. 9 (1), 6749(2019).</li>
<li>Prossnitz, E. R., Barton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+G+protein-coupled+estrogen+receptor+GPER+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease.</a> Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).</li>
<li>Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+estrogen-estrogen+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling.</a> Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).</li>
<li>Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+for+the+study+of+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mouse models for the study of Crohn's disease.</a> Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).</li>
<li>Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+interleukin+12+abrogate+established+experimental+colitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).</li>
<li>Ikeda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simvastatin+attenuates+trinitrobenzene+sulfonic+acid-induced+colitis%2C+but+not+oxazalone-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).</li>
<li>Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+basics+of+routine+formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Maxillofacial+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation.</a> Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn tal van diermodellen voor IBD pathofysiologie onderzoek, met inbegrip van genetische, immunologische of spontane modellen, evenals chemisch geïnduceerde modellen15. Onder de verschillende soorten diermodellen van colitis, chemisch geïnduceerde modellen zoals de TNBS-geïnduceerde model beschreven in dit protocol, zijn relatief goedkoop en gemakkelijk te verkrijgen. Het tnbs-geïnduceerde murinemodel van colitis heeft verschillende klinische symptomen gerelateerd aan de pathologische basis va...

De ziekte van Crohn (CD) is een inflammatoire darmziekte (IBD) die zich manifesteert als chronische darmontsteking. De etiologie van CD is slecht begrepen, maar er zijn een paar belangrijke factoren die verantwoordelijk lijken te zijn voor de ontwikkeling van cd's, waaronder darmmicrobiota, en genetische en omgevingsfactoren, zoals dieet of stress1. Voor een beter begrip van de pathogenese van de ziekte van Crohn zijn verschillende modellen van darmontsteking gebruikt2,3,4,5,6,7. In dit artikel presenteren we resultaten verkregen uit een 2,4,6-trinitrobenzeensulfoonzuur (TNBS)-geïnduceerde murinemodel van CD.
Het is gedocumenteerd dat oestrogenen in staat zijn om chronische darmontsteking te moduleren8,,9,10,11,12. De biologische activiteit van oestrogenen wordt bemiddeld door cognate receptoren, waaronder nucleaire oestrogeenreceptoren (ERs), d.w.z. ERα (gen ESR1) en ERβ (gen ESR2), evenals G-eiwit-gekoppeldoestrogeenreceptor, d.w.z. GPER (gen GPER1),aangeduid als membraangebonden ER13,14. Er zijn verschillende methoden voor het bepalen van het niveau van oestrogeen receptoren, maar slechts een paar kunnen worden gebruikt om ze te visualiseren in de darm.
Immunohistochemie (IHC) is een veelgebruikte methode in klinische en basisstudies voor de detectie van bepaalde antigenen in cellen of weefsels met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen. IHC lijkt een belangrijke methode in weefselstructuur visualisatie, evenals in de identificatie en lokalisatie van specifieke eiwitten, die van cruciaal belang kunnen zijn voor het begrijpen van de ontwikkeling van colitis. Hier presenteren we een compleet en gevalideerd protocol voor immunohistochemische visualisatie van oestrogeenreceptoren in de darm met behulp van immunofluorescentie.

<table><tbody><tr><td>Dieren</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BALB/C muizen</td><td>University of Lodz</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calliper</td><td>VWR</td><td>62379-531</td><td></td></tr><tr><td>Kartonblok</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Confocale microscoop - TCS SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Volautomatische roterende microtoom - RM2255</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Glijplaatje</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800BMNT</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmd paraffine-inbeddingsmodule - EG1150 H</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Histologisch doosje</td><td>Marfour</td><td>LN.138747</td><td></td></tr><tr><td>Hydrofobe pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoriumweegschaal</td><td>Radwag</td><td>WL-104-0048</td><td></td></tr><tr><td>LAS X software</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Metaalvorm</td><td>Marfour</td><td>CP.5105</td><td></td></tr><tr><td>Steriele gaas</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Steriele schaar</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Steriele pincet</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Weefselprocessor - TP1020</td><td>Leica Biosystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2, 4, 6-trinitrobenzeensulfonzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92822</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DiOC6 (3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>318426</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 650 secundair antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab96886</td><td></td></tr><tr><td>ER&alpha; primair antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab75635</td><td></td></tr><tr><td>ER&beta; primair antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab3576</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>396480111</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>432173111</td><td></td></tr><tr><td>GPER primair antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab39742</td><td></td></tr><tr><td>Zoutzuur</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>575283421</td><td></td></tr><tr><td>Waterstofperoxide</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>885193111</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan (forane)</td><td>Baxter</td><td>1001936040</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Leica Biosystems</td><td>39602012</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>Nest Scientific</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat bufferoplossing met natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>Fysiologische zoutoplossing</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>Primocin (antibioticum)</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifage Mountant met DAPI (glycerine-gebaseerde vloeistof met DAPI)</td><td>Invitrogen</td><td>P36971</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Chempur</td><td>WE/231-598-3</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitraat</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>795780429</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>853470115</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>XYleen</td><td>Avantor Performance Materials Poland</td><td>BA0860119</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van crohn met behulp van immunofluorescentie

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

De ziekte van Crohn is het meest gediagnosticeerde type inflammatoire darmziekte. Chronische ontsteking zich ontwikkelt in de darm leidt tot peristtiek stoornis en schade van intestinale slijmvlies en lijkt te worden geassocieerd met een verhoogd risico op darmneoplastische transformatie. Accumuleren bewijs geeft aan dat oestrogenen en oestrogeen receptoren invloed hebben op niet alleen hormoon-gevoelige weefsels, maar ook andere weefsels niet direct gerelateerd aan oestrogenen, zoals de longen of dikke darm. Hier beschrijven we het protocol voor de succesvolle immunofluorescentie kleuring van oestrogeenreceptoren in de dikke darm verkregen uit een murinemodel van de ziekte van TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Een gedetailleerd protocol voor de inductie van de ziekte van Crohn bij muizen en darmpreparaat wordt verstrekt, evenals een stapsgewijze immunohistochemische procedure met behulp van formaline-vaste paraffine-ingebedde darmsecties. De beschreven methoden zijn niet alleen nuttig voor oestrogeen receptor detectie en oestrogeen signalering onderzoek in vivo, maar kan ook worden toegepast op voor andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis.

Macroscopische kenmerken van dikke darmen bij muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn Representatieve beelden van de uit de controle genomen dikke darmen en met TNBS behandelde muizen worden weergegeven in figuur 2. Bij muizen met een TNBS-geïnduceerd model van de ziekte van Crohn wordt de lengte van de dikke darm verminderd terwijl de breedte van de dikke darm wordt verhoogd.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

Het protocol presenteert een volledig gevalideerd TNBS-geïnduceerde murine model van de ziekte van Crohn en methoden voor visualisatie van oestrogeenreceptoren door immunohistochemie met behulp van immunofluorescentie van formaline-vaste darm secties ingebed in paraffine.

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Toenemende bewijs suggereert de impact van oestrogeen signalering op het colonische deel van de fysiologie, immunohistochemie is een veelbelovende techniek voor het identificeren van oestrogeenreceptoren in de dikke darm en ze evolueren in colitis. We presenteren een compleet en gevalideerd protocol voor immunohistochemische visualisatie van oestrogeenreceptoren in de dikke darm, met behulp van immunofluorescentie. Samen met Dr.Sylwia Michlewska van Laboratory of Microscopische Beeldvorming van de Universiteit van Lodz, zullen we de procedure demonstreren.Plaats de dikke darm in een petrischaaltje. Snijd de dikke darm in een tot twee centimeter fragmenten. Plaats elk fragment op een spons in een op de juiste wijze gelabelde histologische cassette.Plaats een cassette met een dikke darmfragment in 4%paraformaldehyde. Incubeer voor ten minste 24 uur op vier graden Celsius. Bereid en programmeer de weefselprocessor voor een uur incubatie in 50%70%90%95% en 100% ethanol, xyleen 100% ethanol en xyleen alleen, evenals gedurende ten minste drie uur incubatie in vloeibare paraffine.Breng het dikke darmfragment over naar een histologische doos. Plaats de doos in de voorgeprogrammeerde weefselprocessor en voer de processor uit. Na incubatie in de weefselprocessor verwijder de dikke darm uit de histologische doos en plaats het dikke darmfragment in een metalen mal, zodanig dat de twee uiteinden van de dikke darm rechtop staan.Vul een derde van de mal met vloeibare paraffine. Plaats de mal in het koelgebied op min vijf graden Celsius voor een paar seconden en dan verplaatsen van de mal naar de opwarming gebied op 70 graden Celsius. Plaats vervolgens de mal in het onderste deel van de histologische doos en bedek het hele colonfragment met vloeibare paraffine.Plaats de metalen mal met de dikke darm fragment en paraffine in het koelgebied voor een paar minuten. Verwijder vervolgens de metalen mal uit de dikke darm en paraffine blok. Incubeer de dikke darm en paraffine blok voor ten minste 24 uur op vier graden Celsius.Na incubatie, verwijder overtollige paraffine uit het blok. Plaats de dikke darm en paraffine blok in een volledig geautomatiseerde roterende microtome. Snijd de dikke darm fragment in vijf micrometer secties.Breng een dikke darm sectie naar een waterbad, voorverwarmd tot 40 graden Celsius. Gebruik de gelabelde glazen schuif om de dikke darm sectie te verwijderen uit het waterbad en de glazen glijbaan in te broeden op kamertemperatuur gedurende 24 uur. Verwijder eerst de paraffine door de glazen schuif in xyleen gedurende vijf minuten uit te broeden.Herhaal deze stap drie keer. Plaats vervolgens de glazen schuif in een een-op-een mengsel van xyleen en 100% ethanol gedurende vijf minuten. Herhaal deze stap drie keer.Gebruik een reeks van afnemende ethanol concentraties om de dikke darm sectie rehydrateren. Dompel de glijbaan gedurende vijf minuten onder in de ethanol. Herhaal dit drie keer bij elke concentratie voordat u doorgaat naar de volgende concentratie.Spoel de glazen glijbaan onder stromend water gedurende vijf minuten. Verwarm de antigeen retrieval buffer op tot 95 tot 98 graden Celsius. Verwarm vervolgens de glazen schuif in kokende antigeenophaaloplossing gedurende 10 minuten.Om verspilling van reagentia te voorkomen, gebruikt u een hydrofobe pen om een cirkel rond de dikke darmsectie te tekenen. Vervolgens, incubeer de glijbaan gedurende 10 minuten in een 3%-oplossing van waterstofperoxidase en water. Was de glijbaan vijf minuten in wasoplossing.Vervolgens de glijbaan in het blokkeren van oplossing voor een uur bij kamertemperatuur. Verwijder de blokkeringsoplossing en voeg 20 tot 50 microliter primair antilichaam toe tegen E-R alpha, E-R bèta of G-P-E-R verdund. Incubeer het primaire antilichaam 's nachts bij vier graden celsius in het donker.Verwijder de antilichaamoplossing. Was de glijbaan drie keer in wasoplossing gedurende vijf minuten per keer. Voeg vervolgens verdund secundair antilichaam toe.Broed de glijbaan met secundaire antilichaam geconjugeerd met kleurstof gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder de secundaire antilichaamoplossing van de dia. Was de glijbaan drie keer in wasoplossing gedurende vijf minuten per keer.Voeg verdund fluorchroom toe voor membraanvisualisatie en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Verwijder de oplossing en was de glijbaan drie keer in wasoplossing gedurende vijf minuten per keer. Voeg een paar druppels glycerol-gebaseerde vloeibare DAPI, een fluorchrome voor celkernen visualisatie, direct op de dubbele punt sectie.Bedek het voorzichtig met een afdekplaat. Incubeer de dikke darm sectie voor ten minste 24 uur op vier graden Celsius. Analyseer de dikke darm sectie onder een confocale microscoop met 20x of 63x doelstellingen en olie onderdompeling.De specificiteit van de antilichamen die in de studie werden gebruikt, werd gevalideerd met mcf-7-cellen. De oestrogeen receptor antilichamen ingeschakeld detectie van nucleaire oestrogeen receptoren E-R alpha en E-R beta evenals het membraan gebonden oestrogeen receptor G-P-E-R. Er werd ook een negatieve controle uitgevoerd waarbij MCF-7 cellen alleen werden bevlekt met secundair antilichaam geconjugeerd met fluorchrome en een vloeistof op basis van glycerol met DAPI.Een sterk cytoplasmatisch signaal van E-R alpha werd gevonden in de dikke darmsecties verkregen van controlemuizen en van muizen met de ziekte van TNBS-geïnduceerde Crohn. Echter, alleen de dikke darmen verkregen van controle muizen had E-R alpha gelokaliseerd in de bekercel cytoplasma. Confocale microscopie onthulde ook cytoplasmatische lokalisatie van E-R beta in de dikke darm secties van zowel de controle en de TNBS-behandelde muizen.Op dezelfde manier werd cytoplasmalokalisatie van G-P-E-R gedocumenteerd in de dikke darmsecties verkregen van controlemuizen en de met TNBS behandelde muizen. De juiste positionering van de dikke darm in de mal is essentieel om de juiste dwarsdoorsnede te genereren. Fluorchroom moet worden gekozen door zijn eigen excitatie- en emissiespectrum.Deze methode kan ook worden toegepast op andere eiwitten die betrokken kunnen zijn bij de ontwikkeling van colitis. Immunohistochemie detectie door immunofluorescentie kan worden uitgebreid tot vlekken andere eiwitten in eiwit-eiwit richting status.

visualization-estrogen-receptors-colons-mice-with-tnbs-induced-crohn

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video demonstrates the assessment of chemical-induced colitis via immunohistochemical staining of mouse colon tissue. In a stained tissue section, the presence of a large number of immune-responsive cells in the damaged tissue represents the infiltration of immune cells during colitis.

Assessment of Chemical-Induced Colitis via Immunohistochemical Analysis of Colon Tissue Sections

This video demonstrates a technique for assessing intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using fluorescence-mediated tomography (FMT). Upon inducing colitis in a mouse via dextran sodium sulfate (DSS), the animal is injected with antibodies that recognize the F4/80 glycoprotein marker on infiltrated macrophages in the colon. The mouse is then imaged in an FMT device where the fluorescence and reflectance signals are reconstructed into a three-dimensional image to...

Using Fluorescence-Mediated Tomography to Assess Murine Intestinal Inflammation

Klein dier beeldvormende technieken laten seriële diagnostische onderzoeken en therapeutische interventies in vivo. Onlangs heeft de reikwijdte van de toepassingen aanzienlijk verbreed en omvat momenteel de beoordeling van het colon tumor ontwikkeling, wondgenezing en de monitoring van de ontsteking. Dit protocol illustreert deze diverse mogelijke toepassingen van muizen endoscopie.

Muizen Endoscopie voor In Vivo Multimodal Imaging van Carcinogenese en Evaluatie van intestinale wondgenezing en ontsteking

Nauwkeurige identificatie en locatie van epitheelcellen langs de intestinale slijmvlies essentieel verschillende cellijnen definiëren. Een goede beeldvorming van darmweefsel is van cruciaal belang voor de identificatie van eiwit expressie patronen met maximale resolutie. Dit onderzoek heeft als doel om de optimale methoden en voorwaarden voor de verwerking van de muis intestinale weefsels af te bakenen.

Verbeterde Swiss-rolling Techniek voor darmweefsel Voorbereiding voor Immunohistochemische en Immunofluorescentie Analyses

In dit antigeengedreven colitismodel werden OT-II CD4+ T-cellen die een rood fluorescent eiwit tot expressie brengen adoptief overgebracht naar RAG-/- muizen die een groen fluorescent eiwit tot expressie brengen in mononucleaire fagocyten (MP's). De gastheren werden uitgedaagd met Escherichia coli (E.coli) die het ovalbumine-eiwit (OVA) tot expressie brengt, gefuseerd met een cyaan fluorescent eiwit (CFP).

Ontwikkeling van een antigeen-gedreven Colitis Model naar Presentatie van antigenen te bestuderen door antigen presenterende cellen om T-cellen

We beschrijven hier een transgenisch reportermuismodel om de IL-22-producerende cellen in verschillende muisweefsels te visualiseren. Deze methode kan worden gebruikt om de locatie van andere cytokinen of secretoire eiwitten in de muis te volgen.

Visualisatie van IL-22-uiting van lymfocyten Met behulp van Reporter Muizen

Doelgroepen gerichte sondes vertegenwoordigen een vernieuwend hulpmiddel voor het analyseren van de moleculaire mechanismen, zoals eiwituitdrukking in verschillende soorten ziekten (b.v., ontsteking, infectie en tumorvorming). In deze studie beschrijven we een kwantitatieve driedimensionale tomografische beoordeling van intestinale macrofaag infiltratie in een lymfkliertest model van colitis met F4/80-specifieke fluorescentie-gemedieerde tomografie.

Fluorescentie-gemedieerde tomografie voor de detectie en kwantificering van macrofaag-gerelateerde lymfkliertest darmontstekingen

In deze studie beschrijven we een gedetailleerde procedure van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose, die vergelijkbare pathofysiologie vertoont voor de fibrose van Crohn. We bespreken deze aanpak ook in het licht van rapamycine vergemakkelijkt remmende effecten op intestinale fibrose.

Mechanistisch inzicht in de ontwikkeling van TNBS-gemedieerde intestinale fibrose en evaluatie van de remmende effecten van Rapamycine

Het huidige protocol beschrijft de ontwikkeling van een Crohn-achtig colitismodel bij knaagdieren. Transmurale ontsteking leidt tot stenose op de TNBS-instillatieplaats en mechanische vergroting wordt waargenomen in het segment proximaal met de stenose. Deze veranderingen maken het mogelijk om mechanische stress bij colitis te bestuderen.

Een TNBS-geïnduceerd knaagdiermodel om de pathogene rol van mechanische stress bij de ziekte van Crohn te bestuderen

We beschrijven een protocol dat de isolatie van murine coloncrypten beschrijft voor de ontwikkeling van 3-dimensionale colonoïden. De gevestigde colonoïden kunnen vervolgens terminaal worden gedifferentieerd om de cellulaire samenstelling van het gastheerepitheel weer te geven voordat ze een ontstekingsuitdaging krijgen of worden gericht op het vaststellen van een epitheliale monolaag.

Het bestuderen van de epitheliale effecten van darmontsteking in vitro op gevestigde murine colonoïden

Leer immunofluorescentie voor visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met TNBS-geïnduceerde ziekte van Crohn. Deze methode ondersteunt onderzoek naar de rol van oestrogeen in darmontstekingen.

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie (Video) | JoVE Journal

Visualisatie van oestrogeenreceptoren in colons van muizen met tnbs-geïnduceerde ziekte van Crohn met behulp van immunofluorescentie

Meer video's verkennen