Name: Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Leer hoe je een extracellulaire flux-analyzer gebruikt om glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens capacitatie van muizensperma. Deze methode biedt real-time inzicht in metabole veranderingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de steun van Dr. Lavoisier Ramos-Espiritu op het Rockefeller High throughput en spectroscopy Resource Center bevestigen.

Sperma worden verzameld van 8-16-week-oude CD-1 mannelijke muizen. Dierproeven werden goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité van Weill Cornell Medicine (IACUC).
1. dag voorafgaand aan de test
<ol><li>
Voorbereiding van de sensor cartridge en de extracellulaire flux Analyzer kalibrant
	<ol>
<li>Om de sensor cartridge te hydrateren, verwijdert u de sensor cartridge uit de XFe96 extracellulaire flux assay kit en plaatst u de sensor cartridge ondersteboven naast de Utility Plate.</li>
		<li>Vul een oplossing reservoir met 25 mL dubbel gedestilleerd H2o met behulp van een meerkanaalspipet, voeg 200 μL H2o toe aan elk goed van de Utility plaat. Plaats de sensor cartridge weer in de gebruiks plaat en incuuter 's nachts in een incubator van niet-CO2 van 37 °c. Opmerking: de cartridge moet minstens 4 uur lang gehydrateerd zijn.</li>
		<li>Aliquot 25 mL van de extracellulaire flux Analyzer Kalibreer in een conische buis van 50 mL en incuberen het 's nachts in een incubator van 37 °C (niet-CO2 ).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de door ConA gecoate microplaten
	<ol>
<li>Los 2,5 mg ConA op in 5 mL dubbel gedestilleerd H2O om een 0,5 mg/ml (w/v) kolf te bereiden.</li>
		<li>Vul met behulp van een multikanaalspipet elke put van een extracellulaire flux Analyzer 96-well plate met 50 μL van de 0,5 mg/mL con een oplossing. Laat het deksel open en laat de plaat 's nachts op kamertemperatuur drogen. Opmerking: meerdere platen kunnen in één keer worden gecoat en gedurende maximaal vier weken bij 4 °C worden bewaard tot ze klaar zijn voor gebruik.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiding van de sperma buffer
	<ol>
<li>Bereid 250 mL van de extracellulaire flux Analyzer TYH-buffer met lage HEPES met 138 mm nacl, 4,7 mm kcl, 1,7 mm CACL2, 1,2 mm KH2po4, 1,2 mm MgSO4, 5,6 mm glucose en 1 mm Hepes. Verwarm de buffer tot 37 °C en stel de pH in op 7,4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dag van de test
<ol><li>Voorbereiding voor patroon kalibratie
	<ol>
<li>Vervang de H2O in de gebruiks plaat door 200 μL van het XF-ijkmiddel per put en incut gedurende ten minste 1 uur in een incubator met een niet-CO2 37 °c. Opmerking: in plaats van kalibrant, steriel gefilterde PBS, kan pH 7,4 worden gebruikt.</li>
		<li>Verhit 50 mL TYH buffer bij 37 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Een wavesjabloon genereren voor de extracellulaire flux Analyzer
	<ol>
<li>Zet de extracellulaire flux Analyzer aan en laat de temperatuur stabiliseren tot 37 °C.</li>
		<li>Open de Wave software en ontwerp een nieuwe sjabloon door een lege sjabloon te openen (Zie aanvullend bestand 1, wavesjabloon).</li>
		<li>Open het tabblad groepsdefinities . testmedia definiëren als TYH; pH 7,4 en celtype als muis sperma, laat injectie strategieën en voor behandelingen blanco. Maak verschillende groepen voor elke testvoorwaarde; in dit voorbeeld zijn er 6 verschillende groepen (TYH, TYH + DB-cAMP/IBMX, 2-DG, 2-DG + DB-cAMP/IBMX, Ant/rot, Ant/rot + DB-cAMP/IBMX); dibutyryl-kamp (DB-Camp) en 3-isobutyl-1-methylxanthine (ibmx) voor het opwekken van capaciteit, 2-Deoxyglucose (2-DG) als glycolyse-remmer, antimycine A (antA) en rotenon (rot) als remmer van complex III en complex I van de elektronentransport keten. Opmerking: om rekening te kunnen maken met de variabiliteit tussen putten moeten ten minste 7-8 putjes per aandoening parallel worden gemeten.</li>
		<li>Open het tabblad plaat kaart en definieer de plaat kaart door groepen toe te wijzen aan specifieke putjes. Opmerking: de vierhoek putten (a1, A12, H1, H12) worden gevuld met TYH-buffer (geen sperma) en zullen later worden gebruikt voor aftrekken op de achtergrond.</li>
		<li>Open het tabblad protocol , Voeg 4 verschillende meetcycli toe, selecteer de betreffende poort en bewerk de meetgegevens (Figuur 2, tabel 1). Markeer maat na injectie en markeer evenwichtig niet .</li>
		<li>Sla de assay-sjabloon op, vul het project overzicht in en definieer de opslaglocatie voor het resultatenbestand.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van verbindingen om in sensor cartridge te laden
	<ol>
<li>Bereid 2 mL 50 mM DB-cAMP door het oplossen van 9,8 mg compound in TYH buffer en voeg IBMX toe aan een uiteindelijke concentratie van 5 mM. Opmerking: IBMX heeft de neiging om neer te slaan na te zijn verdund in TYH buffer. Precipitaten kunnen worden opgelost door grondig en incuberen de TYH/DB-Camp/ibmx-oplossing in een warmte blok van 37 °c gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Bereid 1 mL van 500 mM 2-DG door het oplossen van 82,1 mg samengestelde in TYH buffer.</li>
		<li>Bereid 1 mL van 5 μM AntA/rot door beide geneesmiddelen in de TYH-buffer te verdunen. Opmerking: verbindingen worden 10-voudige verdund met een injectie in de extracellulaire flux Analyzer cartridge; Zorg er daarom voor dat de injectie oplossingen 10x meer geconcentreerd zijn.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolatie van muis sperma
	<ol>
<li>Anesthetiseren 3 mannelijke muizen tussen 8 en 16 weken door Isofluraan en offeren de muizen door cervicale dislocatie na geen reactie op Teen knijpen werd gedetecteerd. Verwijder de Cauda epididymides en Vasa deferentia.</li>
		<li>Plaats elke Cauda in 500 μL van voorverwarmde TYH buffer in 24-goed plaat goed, immobiliseer de Cauda aan de onderkant van de plaat met behulp van een paar tang en open het weefsel door het maken van 5-7 kleine incisies met veer schaar.</li>
		<li>Breng de plaat onmiddellijk over in een incubator zonder CO2 37 °c en laat het sperma 15 minuten dispergeren.</li>
	</ol></li>
	<li>Het laden van de sensor cartridge
	<ol>
<li>De extracellulaire flux Kit voorziet in twee poortbelastingshandleidingen voor de poorten A en D en de poorten B en C. Voor het laden van een specifieke poort verwijdert u het deksel van de sensor cartridge en lijnt u de letter van de betreffende poort laad geleider uit met de linkerbovenhoek van de cartridge. Gebruik tijdens het injecteren de vingertoppen van de niet-injecterende hand om de laad geleider van de poort op zijn plaats te houden en de pipetpunten verticaal in de geleidings gaten van de poort belasting te plaatsen.</li>
		<li>Poort A: Injecteer 20 μL van de TYH-buffer in elke kolom met behulp van een multikanaalspipet.</li>
		<li>Poort B: Injecteer 22 μL TYH-buffer in kolom 1-4, Injecteer 22 μL 500 mM 2-DG in kolom 5-8 en 25 μL 5 μM AntA/rot in kolom 9-12.</li>
		<li>Poort C: Injecteer 25 μL TYH-buffer in elke kolom met oneven getallen, Injecteer 25 μL 10 mM DB-cAMP/500 μM IBMX in elke kolom met even getallen.</li>
		<li>Plaats de sensor cartridge met de kalibratie plaat in de extracellulaire flux Analyzer en start de test. Kalibratie duurt 10-15 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiding van sperma platen
	<ol>
<li>Los 45 mg BSA op in 15 mL TYH buffer (3 mg/mL w/v) en bereid drie aliquots van 3 mL BSA/TYH oplossing elk in 5 mL centrifugebuizen.</li>
		<li>Combineer twee sperma putten in één 1,5 mL centrifugebuis, Tel het sperma met behulp van een hematocytometer en Verdun het sperma tot een concentratie van 2 x 107 sperma/ml. Opmerking: gebruik de snij pipettips voor het pipetteren van sperma om beschadiging van de cellen te voorkomen.</li>
		<li>Centrifugeer het sperma gedurende 3 minuten bij 700 x g, verwijder het supernatant en voeg 1 ml TYH-buffer toe. Herhaal de Centrifugeer stap, verwijder het supernatant en breng elk sperma suspensie aliquot over in één centrifugebuis van 5 mL met 3 mL BSA/TYH.</li>
		<li>Plaats 180 μL TYH-buffer in elke hoek goed (a1, A12, H1, H12) van een met ConA beklede plaat. Plaats 180 μL sperma suspensie in elke lege put van de ConA-gecoate plaat (1,2 x 106 sperma/goed).</li>
		<li>Centrifugeer de sperma plaat gedurende 1 minuut bij 250 x g , draai de plaat met 180 ° en Centrifugeer gedurende 1 minuut opnieuw bij 250 x g (laagste remsnelheid 1).</li>
		<li>Verwijder de kalibratie plaat van de extracellulaire flux Analyzer en voeg de sperma plaat toe. Doorgaan met de assay.</li>
	</ol></li>
	<li>Extractie en analyse van gegevens
	<ol>
<li>Nadat u de test hebt voltooid, verwijdert u de cartridge, opent u het resultatenbestand, klikt u op het tabblad exporteren en exporteert u de voltooide uitvoering als een Graphpad Prism-bestand (aanvullend bestand 2: primaire voorbeeldgegevens die worden gebruikt voor Figuur 3).</li>
		<li>Dupliceer het ECAR-en OCR-bestand door op het nieuwe tabblad te klikken en vervolgens op de dubbele familie... tab (afbeelding 3A).</li>
		<li>Verwijder de eerste 7 rijen met gegevens (afbeelding 3B).</li>
		<li>Normaliseren tot het gegevenspunt vóór de injectie van cAMP/IBMX door Baseline af te trekken van rij 1. Klik op het tabblad analyseren en vervolgens op het tabblad basislijn en kolom wiskunde verwijderen . Markeer geselecteerde rij (en): eerste rij, berekening: verhouding: waarde/basislijnen subkolommen: subkolom negeren. Klik op OK (Figuur 3C).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+metabolic+analysis+reveals+a+close+link+between+attenuated+mitochondrial+bioenergetic+function+and+enhanced+glycolysis+dependency+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 292 (1), C125-C136 (2007).</li>
<li>Amo, T., Yadava, N., Oh, R., Nicholls, D. G., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+assessment+of+bioenergetic+differences+caused+by+the+common+European+mitochondrial+DNA+haplogroups+H+and+T%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Experimental assessment of bioenergetic differences caused by the common European mitochondrial DNA haplogroups H and T.</a> Gene. 411 (1-2), 69-76 (2008).</li>
<li>Choi, S. W., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> Journal of Neurochemistry. 109 (4), 1179-1191 (2009).</li>
<li>de Groof, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+OXPHOS+activity+precedes+rise+in+glycolytic+rate+in+H-RasV12%2FE1A+transformed+fibroblasts+that+develop+a+Warburg+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Increased OXPHOS activity precedes rise in glycolytic rate in H-RasV12/E1A transformed fibroblasts that develop a Warburg phenotype.</a> Molecular Cancer. 8, 54(2009).</li>
<li>Chao, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+and+altered+systemic+glucose+metabolism+in+mice+lacking+Nur77%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance and altered systemic glucose metabolism in mice lacking Nur77.</a> Diabetes. 58 (12), 2788-2796 (2009).</li>
<li>Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilizing+capacity+of+spermatozoa+deposited+into+the+fallopian+tubes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fertilizing capacity of spermatozoa deposited into the fallopian tubes.</a> Nature. 168 (4277), 697-698 (1951).</li>
<li>Austin, C. R., Bishop, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+rodent+acrosome+and+perforatorium+in+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Role of the rodent acrosome and perforatorium in fertilization.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 149 (935), 241-248 (1958).</li>
<li>Ishijima, S., Baba, S. A., Mohri, H., Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+flagellar+movement+in+hyperactivated+and+acrosome-reacted+golden+hamster+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of flagellar movement in hyperactivated and acrosome-reacted golden hamster spermatozoa.</a> Molecular Reproduction and Development. 61 (3), 376-384 (2002).</li>
<li>Suarez, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+hyperactivation+in+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Control of hyperactivation in sperm.</a> Human Reproduction Update. 14 (6), 647-657 (2008).</li>
<li>Goodson, S. G., Qiu, Y., Sutton, K. A., Xie, G., Jia, W., O'Brien, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+substrates+exhibit+differential+effects+on+functional+parameters+of+mouse+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Metabolic substrates exhibit differential effects on functional parameters of mouse sperm capacitation.</a> Biology of Reproduction. 87 (3), 75(2012).</li>
<li>Travis, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+relationships+between+capacitation-dependent+cell+signaling+and+compartmentalized+metabolic+pathways+in+murine+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (10), 7630-7636 (2001).</li>
<li>Urner, F., Leppens-Luisier, G., Sakkas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+tyrosine+phosphorylation+in+sperm+during+gamete+interaction+in+the+mouse%3A+the+influence+of+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Protein tyrosine phosphorylation in sperm during gamete interaction in the mouse: the influence of glucose.</a> Biology of Reproduction. 64 (5), 1350-1357 (2001).</li>
<li>Danshina, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoglycerate+kinase+2+%28PGK2%29+is+essential+for+sperm+function+and+male+fertility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2) is essential for sperm function and male fertility in mice.</a> Biology of Reproduction. 82 (1), 136-145 (2010).</li>
<li>Miki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase-S%2C+a+sperm-specific+glycolytic+enzyme%2C+is+required+for+sperm+motility+and+male+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase-S, a sperm-specific glycolytic enzyme, is required for sperm motility and male fertility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (47), 16501-16506 (2004).</li>
<li>Mori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+spermatogenic+cell-specific+type+1+hexokinase+%28mHk1-s%29+transcripts+are+expressed+by+alternative+splicing+from+the+mHk1+gene+and+the+HK1-S+protein+is+localized+mainly+in+the+sperm+tail%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mouse spermatogenic cell-specific type 1 hexokinase (mHk1-s) transcripts are expressed by alternative splicing from the mHk1 gene and the HK1-S protein is localized mainly in the sperm tail.</a> Molecular Reproduction and Development. 49 (4), 374-385 (1998).</li>
<li>Westhoff, D., Kamp, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceraldehyde+3-phosphate+dehydrogenase+is+bound+to+the+fibrous+sheath+of+mammalian+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase is bound to the fibrous sheath of mammalian spermatozoa.</a> Journal of Cell Science. 110 (15), 1821-1829 (1997).</li>
<li>Nevo, A. C., Rikmenspoel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+ATP+in+sperm+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Diffusion of ATP in sperm flagella.</a> Journal of Theoretical Biology. 26 (1), 11-18 (1970).</li>
<li>Adam, D. E., Wei, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+ATP+within+the+motile+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Mass transport of ATP within the motile sperm.</a> Journal of Theoretical Biology. 49 (1), 125-145 (1975).</li>
<li>Tombes, R. M., Shapiro, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+termini+of+a+phosphocreatine+shuttle.+Purification+and+characterization+of+two+creatine+kinase+isozymes+from+sea+urchin+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme termini of a phosphocreatine shuttle. Purification and characterization of two creatine kinase isozymes from sea urchin sperm.</a> Journal of Biological Chemistry. 262 (33), 16011-16019 (1987).</li>
<li>Gomendio, M., Tourmente, M., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+mammalian+lineages+respond+differently+to+sexual+selection%3A+metabolic+rate+constrains+the+evolution+of+sperm+size%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Why mammalian lineages respond differently to sexual selection: metabolic rate constrains the evolution of sperm size.</a> Proceedings of the Royal Society of Biological Sciences. 278 (1721), 3135-3141 (2011).</li>
<li>Tourmente, M., Villar-Moya, P., Rial, E., Roldan, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+ATP+generation+via+glycolysis+and+oxidative+phosphorylation+and+relationships+with+sperm+motility+in+mouse+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Differences in ATP generation via glycolysis and oxidative phosphorylation and relationships with sperm motility in mouse species.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (33), 20613-20626 (2015).</li>
<li>Visconti, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+II.+Protein+tyrosine+phosphorylation+and+capacitation+are+regulated+by+a+cAMP-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. II. Protein tyrosine phosphorylation and capacitation are regulated by a cAMP-dependent pathway.</a> Development. 121 (4), 1139-1150 (1995).</li>
<li>Buck, J., Sinclair, M. L., Schapal, L., Cann, M. J., Levin, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+adenylyl+cyclase+defines+a+unique+signaling+molecule+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cytosolic adenylyl cyclase defines a unique signaling molecule in mammals.</a> PNAS. 96 (1), 79-84 (1999).</li>
<li>Visconti, P. E., Bailey, J. L., Moore, G. D., Pan, D., Olds-Clarke, P., Kopf, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitation+of+mouse+spermatozoa.+I.+Correlation+between+the+capacitation+state+and+protein+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation.</a> Development. 121 (4), 1129-1137 (1995).</li>
<li>Morgan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+PKA+inhibition+using+a+chemical+genetic+approach+and+its+application+to+studies+on+sperm+capacitation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific PKA inhibition using a chemical genetic approach and its application to studies on sperm capacitation.</a> PNAS. 105 (52), 20740-20745 (2008).</li>
<li>Lybaert, P., Danguy, A., Leleux, F., Meuris, S., Lebrun, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+methodology+for+the+detection+and+quantification+of+the+acrosome+reaction+in+mouse+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Improved methodology for the detection and quantification of the acrosome reaction in mouse spermatozoa.</a> Histology and Histopathology. 24 (8), 999-1007 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het verlies van sperma capaciteit in de afwezigheid van bepaalde metabole substraten of kritische metabole enzymen onthulde energiemetabolisme als een belangrijke factor die succesvolle bevruchting ondersteunt. Een metabole schakelaar tijdens de activering van de cel is een gevestigde concept in andere celtypen, echter, we zijn net beginnen te begrijpen hoe sperma hun metabolisme aan te passen aan de toenemende energievraag tijdens de capacitatie. Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer ontwikkelden we een eenvo...

De toepassing van massaspectrometrie heeft een revolutie teweeggebracht in de studie van het metabolisme. Gerichte metabole profilering en metabolomic tracing zorgen voor nauwkeurige monitoring van veranderingen in het energiemetabolisme. Echter, het uitvoeren van metabolomica met succes vereist uitgebreide training, ervaren personeel, en dure, zeer gevoelige massaspectrometers niet gemakkelijk beschikbaar voor elk laboratorium. In de afgelopen jaren is het gebruik van een extracellulaire flux analysator, zoals de Seahorse XFe96, populair geworden als een surrogaat methode voor het meten van veranderingen in het energiemetabolisme in verschillende celtypen1,2,3,4,5.
Sperma zijn zeer gespecialiseerde beweeglijke cellen; waarvan de taak is om het vaderlijke genoom aan de eicel te leveren. Sperma dat het mannelijke voortplantingsstelsel na de ejaculatie verlaat, is nog steeds functioneel onrijp en kan de eicel niet bevruchten omdat ze niet in staat zijn om de vestments van de eicellen te penetreren. Sperma verwerven bemesting competentie als ze doorgeven door het vrouwelijke voortplantingskanaal in een rijpingsproces bekend als capacitatie6,7. Vers ejaculeerd sperma of sperma uit de Cauda epididymis kan in vitro worden bekwaam door incubatie in gedefinieerde capacitatiemedia met CA2 +, bicarbonaat (HCO3-) of een cel-permeabel kamp analoog (bijv. dibutyryl-Camp), een cholesterol acceptor (bv. Runderalbumine, BSA) en een energiebron (bijv. glucose). Tijdens de capaciteits wijziging wijzigt het sperma hun motiliteits patroon in een asymmetrische flagellar-beat, die een zwemmodus met de naam Hyper activatie8,9vertegenwoordigt, en ze worden bekwaam om de acrosome-reactie7te ondergaan, waar Proteolytische enzymen vrijkomen die de vesteringen van de eicellen verteren. Deze processen vereisen energie, en vergelijkbaar met somatische cellen, sperma genereren ATP en andere hoge energieverbindingen via glycolyse, alsmede mitochondriale TCA-cyclus en oxidatieve fosforylering (oxphos)10. Terwijl meerdere studies aantonen dat glycolyse noodzakelijk en voldoende is voor de ondersteuning van sperma capaciteit11,12,13,14, is de bijdrage van oxphos minder duidelijk. In tegenstelling tot andere celtypen waar glycolyse fysiek gekoppeld is aan de TCA-cyclus, worden sperma sterk gecompartialiseerd en wordt gedacht dat het deze processen in aparte flagellar-compartimenten handhaaft: het middenstuk concentreert de mitochondriale machines, terwijl de belangrijkste enzymen van glycolyse lijken te worden beperkt tot het hoofdstuk15,16. Deze compartimenging leidt tot een voortdurende discussie over de vraag of pyruvaat geproduceerd in het hoofdstuk door glycolyse mitochondriale oxphos in het middenstuk kan ondersteunen, en of ATP geproduceerd door oxphos in het middenstuk zou kunnen diffuus voldoende snel over de lengte van het flagellum ter ondersteuning van de energie-eisen in distale delen van het hoofdstuk17,18,19. Er is ook ondersteuning van een rol voor oxphos in sperma-capacitatie. Niet alleen is oxphos meer energetisch gunstiger dan glycolyse, het genereren van 16 keer meer ATP dan glycolyse, maar het middenstuk volume en de mitochondriale inhoud zijn direct gecorreleerd met reproductieve fitness in zoogdieren soorten die grotere mate van competitie tussen mannen voor mates20vertonen. Het aanpakken van deze vragen vereist methoden voor het onderzoeken van de relatieve bijdragen van glycolyse en oxphos tijdens de capaciteitstoewijzing van sperma.
Tourmente et al. paste een 24-Well extracellulaire flux Analyzer aan om het energiemetabolisme van nauw verwante muis soorten te vergelijken met significant verschillende sperma prestatieparameters21. In plaats van het rapporteren van de basale ECAR en OCR waarden van niet-bekwame sperma, hier, we passen hun methode met behulp van een 96-well extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in het energiemetabolisme tijdens de muis sperma capaciteit in real-time te bewaken. We ontwikkelden een methode die gelijktijdige controle van glycolyse en oxphos in real-time in sperma mogelijk maakt met het verslaan van flagella in maximaal twaalf verschillende experimentele omstandigheden door het meten van de flux van zuurstof (O2) en protonen (H+) (Figuur 1a). Als gevolg van de afbraak van pyruvaat tot lactaat tijdens de glycolyse en de productie van co2 via de TCA-cyclus, niet-bekwaam en bekwaam sperma extruderen H+ in de assay media die worden gedetecteerd door de extracellulaire flux Analyzer via H+-gevoelige fluor Foren geïmmobiliseerd tot de sondepunt van een sensor cartridge. Parallel, O2 verbruik door oxidatieve fosforylering wordt gedetecteerd via O2-gevoelige fluoroforen geïmmobiliseerd tot dezelfde sonde tip (Figuur 1b). Effectieve detectie van de vrijgegeven H+ en verbruikt O2 vereist een gemodificeerde sperma buffer met lage buffercapaciteit zonder bicarbonaat of fenolrood. Dus, om te induceren van de capaciteit in de afwezigheid van bicarbonaat, we adopteren het gebruik van een cel-permeabel kamp analoog geïnjecteerd samen met de breed-Range PDE inhibitor IBMX22. Drie extra onafhankelijke injectie poorten maken de injectie mogelijk van farmacologische activatoren en/of remmers, die real-time detectie van veranderingen in cellulaire ademhaling en glycolyse snelheid vergemakkelijkt als gevolg van experimentele manipulatie.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Deoxy-D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8375</td><td>2-DG</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>IBMX; bereid een 500 mM stockoplossing in DMSO (111,1 mg/ml) voor en bewaar in kleine aliquoten</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>AntA; bereid een 5 mM stockoplossing in DMSO (2,7 mg/ml) voor en bewaar in kleine aliquoten</td></tr><tr><td>Bovine serum albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1470</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Calciumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>Concanacalin A, leectin van Arachis hypogaea (pinda)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7381</td><td>ConA</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>1169567761</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td>MgSO4</td></tr><tr><td>N6,2'-O-Dibutyryladenosine 3',5'-cyclisch monofosfaat natriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>db-cAMP</td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>13995</td><td>Rot; bereid een 5 mM stockoplossing in DMSO (2 mg/ml) voor en bewaar in kleine aliquoten</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>NaHCO3-</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Equipment en materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12 kanaals pipet 10-100 &mu;L</td><td>eppendorf</td><td>ES-12-100</td><td></td></tr><tr><td>12 kanaals pipet 50-300 &mu;L</td><td>vwr</td><td>613-5257</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C, non-CO2 incubator</td><td>vwr</td><td>1545</td><td></td></tr><tr><td>5 mL centrifuge buizen</td><td>eppendorf</td><td>30119380</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conische centrifuge buizen</td><td>vwr</td><td>76211-286</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge met plate adapter</td><td>Thermo Scientific</td><td>IEC FL40R</td><td></td></tr><tr><td>Dissectieset</td><td>World Precision Instruments</td><td>MOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Inverteerde fasecontrastmicroscoop met 40X objectief</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OctaPool oplossingsreservoirs, 25 ml, verdeeld</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X93</td><td></td></tr><tr><td>OctaPool oplossingsreservoirs, 25 ml, verdeeld</td><td>Thomas Scientific</td><td>1159X95</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent</td><td>102416-100</td><td>Ook verkocht als XFe96 FluxPak mini (102601-100) met 6 in plaats van 18 cartridges.</td></tr></tbody></table>

met behulp van een extracellulaire flux analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Using an Extracellular Flux Analyzer to Measure Changes in Glycolysis and Oxidative Phosphorylation during Mouse Sperm Capacitation

Sperma van zoogdieren verkrijgt bevruchting in het vrouwelijke voortplantingsstelsel in een proces dat bekend staat als capaciteitsopbouw. Capacitatie-geassocieerde processen vereisen energie. Er blijft een voortdurende discussie over de bronnen genereren van de ATP die brandstoffen sperma progressieve beweeglijkheid, capacitatie, hyperactivation, en acrosome reactie. Hier beschrijven we de toepassing van een extracellulaire flux-analysator als een hulpmiddel om veranderingen in het energiemetabolisme te analyseren tijdens het gebruik van muis sperma capaciteit. Met behulp van H+-en O2-gevoelige fluoroforen, maakt deze methode het mogelijk om de glycolyse en oxidatieve fosforylering in real-time te monitoren in niet-bekwame versus capaciteit van sperma. Het gebruik van deze test in de aanwezigheid van verschillende energie substraten en/of farmacologische activatoren en/of remmers kan belangrijke inzichten geven in de bijdrage van verschillende metabole trajecten en het snijpunt tussen signalering van Cascades en metabolisme tijdens het gebruik van sperma.

Deze methode maakt gebruik van een extracellulaire flux Analyzer om real-time veranderingen in de snelheid van glycolyse en oxphos te monitoren tijdens het gebruik van muizen sperma. Figuur 4 toont een voorbeeldig experiment waarbij sperma was bekwaam in de aanwezigheid van glucose als het enige energie substraat en 2-DG en antimycine en rotenon als farmacologische modulatoren. Het energie substraat in de extracellulaire flux Analyzer TYH buffer en de farmaco...

We beschrijven de toepassing van een extracellulaire flux-Analyzer om real-time veranderingen in de glycolyse en oxidatieve fosforylering tijdens het gebruik van muis sperma te bewaken.

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Mammalian sperm acquire fertilization capacity in the female reproductive tract in a process known as capacitation. Capacitation-associated processes ...

Dit protocol kan worden gebruikt om een extracellulaire flux analyzer toe te passen om veranderingen in het energiemetabolisme tijdens spermacapacitatie te controleren. We ontwikkelden dit protocol om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylatie in real time te vergelijken tussen niet-capacitated en capacitated muissperma. Verwijder op de dag voor de test de sensorcartridge uit een extracellulaire fluxtestkit en plaats de cartridge ondersteboven naast de hulpplaat.Vul een oplossingsreservoir met 25 milliliter dubbel gedestilleerd water en voeg 200 microliter water toe aan elke put van de nutsplaat en plaats de sensorcartridge terug in de nutsplaat. Plaats de plaat in een 37 graden Celsius niet-kooldioxide incubator. Vervolgens aliquot 25 milliliter extracellulaire flux analyzer calibrant in een 50 milliliter conische buis en plaats de buis in de 37 graden Celsius niet-kooldioxide incubator.Om ConA gecoate microplaten voor te bereiden, los 2,5 milligram ConA op in vijf milliliter dubbel gedestilleerd water en gebruik een multichannel pipet om elke put van een extracellulaire flux analyzer 96-well plaat met 50 microliters van de ConA-oplossing te vullen en laat vervolgens het open deksel om de plaat 's nachts te laten drogen. Om de spermabuffer voor te bereiden, verwarmt u 250 milliliter extracellulaire fluxanalyler TYH-buffer tot 37 graden Celsius en past u de pH aan op 7,4. Vervang op de dag van de test het water in elke put van de hulpplaat door 200 microliter XF-calibrant per put en plaats de plaat minstens een uur terug in de couveuse zonder kooldioxide.Als u een golfsjabloon wilt genereren, schakelt u de extracellulaire fluxanalyzer in. Terwijl de temperatuur stabiliseert tot 37 graden Celsius, open de golf software en open een lege sjabloon. Definieer onder het tabblad groepsdefinities het testmedium als TYH en het celtype als muissperma, waardoor de injectiestrategieën en voorbehandelingen leeg zijn.Maak verschillende groepen voor elke testvoorwaarde en open de plaatkaart om elke groep toe te wijzen aan specifieke putten. Voeg onder het protocoltabblad het niveau niet in evenwicht, voeg elk van de vier verschillende meetcycli toe, selecteer de desbetreffende poort en bewerk de meetdetails zodat de meting wordt gemarkeerd, sla vervolgens de testsjabloon op, vul de projectsamenvatting in en sla de resultaten op. Voor het oogsten van het sperma, prewarme 50 milliliter TYH buffer op 37 graden Celsius.Na het oogsten van cauda's van volwassen mannelijke muizen, plaats elke cauda in 500 microliters van de voorverwarmde TYH buffer in individuele putten van een 24-put plaat. Gebruik tangen om elke cauda individueel immobiliseren aan de onderkant van elke put en snel vijf tot zeven kleine insnijdingen in elk weefsel met behulp van verenschaar. Wanneer alle cauda's zijn ingesneden, plaats de plaat onmiddellijk in de niet-koolstofdioxide incubator om het sperma te verspreiden gedurende 15 minuten.Als u de sensorcartridge wilt laden, verwijdert u het deksel van de sensorcartridge en lijnt u de letter van de desbetreffende poortbeladingshulplijn uit met de linkerbovenhoek van de cartridge. Houd de poortbeladingsgeleider op zijn plaats, plaats de pipettetips verticaal in de poortbelastinggeleidergaten van poort A en injecteer 20 microliters TYH-buffer in elke kolom. Voor poort B, injecteer 22 microliters van TYH buffer in kolommen een tot en met vier, 22 microliters van 500 millimolar 2-deoxyglucose in kolommen vijf tot en met acht, en 25 microliters van vijf micromolar antimycine A rotenone in kolommen negen tot en met 12.Voor poort C, injecteer 25 microliters van TYH buffer in elke kolom met oneven getallen en 25 microliter van 10 millimolar van dibutyryl-cyclische AMP 500 micromolar IBMX in elke kolom met even nummers, plaats dan de sensor cartridge met een kalibratie plaat in de extracellulaire fluxer en start de test. De kalibratie duurt 10 tot 15 minuten. Om de spermaplaten te bereiden, voeg drie milliliter van drie milligram per milliliter runderserum albumine in TYH buffer aan elk van drie vijf milliliter centrifuge buizen.Vervolgens, zwembad twee putten van sperma in elk van drie 1,5 milliliter centrifuge buizen. Verdun het sperma na het tellen twee keer tot een twee maal 10 tot de zeven zaadcellen per milliliterconcentratie per monster in verse TYH, aangevuld met runderserumalbumine. Sediment het sperma door centrifugatie en resuspend de spermakorrels in een milliliter TYH buffer.Centrifuge het sperma weer en verwijder de supernatants die ervoor zorgen niet om de pellets te verstoren. Breng elke spermasuspensie over in een van de bereide vijf milliliter centrifugebuizen en voeg 180 microliter TYH-buffer toe in elke hoekput van een ConA gecoate plaat. Voeg 180 microliter sperma toe in elke lege put van de ConA gecoate plaat en centrifugeer de plaat twee keer draaiend de plaat 180 graden tussen centrifugations, plaats dan de kalibratieplaat met de spermaplaat en zet de test voort.In dit representatieve experiment werd sperma in aanwezigheid van glucose als enige energiesubstraat en 2-deoxyglucose en antimycine en rotenone als farmacologische modulatoren gecapituleerd. De pijl geeft inductie van condensatie aan. In aanwezigheid van glucose ging de capaciteit gepaard met een zevenvoudige toename van de extracellulaire verzuring, die wordt geremd door het blokkeren van glycolyse met 2-deoxyglucose.Capacitated sperma toonde een 20-voudige toename van het zuurstofverbruik in vergelijking met niet-capacitated sperma waaruit blijkt dat de muis sperma verbeteren zowel glycolyse en oxidatieve fosforylatie ter ondersteuning van de toenemende vraag naar energie tijdens de capaciteit tijdens de capaciteit. De stijging van de extracellulaire verzuring tijdens de capacitatie van het sperma wordt niet beïnvloed door de oxidatieve fosforylatieremmers antimycine A en rotenone die aangeeft dat de verandering in dit tarief voornamelijk wordt veroorzaakt door waterstofafgifte van glycolyse. De toename van het zuurstofverbruik wordt echter geblokkeerd door antimycine A en rotenone en door 2-deoxyglucose waaruit blijkt dat de toename van OXPHOS tijdens spermacapacitatie afhankelijk is van glycolytische activiteit.De energiebron en farmacologische activators en remmers kunnen worden gevarieerd afhankelijk van het doel van het experiment en tot 12 verschillende omstandigheden kunnen parallel worden gemeten. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan andere soorten zoals mens of rund, waar de veranderingen in het energiemetabolisme tijdens de capaciteit even raadselachtig zijn.

using-an-extracellular-flux-analyzer-to-measure-changes-glycolysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This protocol provides a biochemical approach for measuring extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR) of primary leukemic cells with extracellular flux assay. The assessment of the metabolic profile of these cells helps to characterize their demands, leading to personalized therapy.

Extracellular Flux Assay: A Method for Measuring Metabolic Profile of Cells

Meten Intracellulaire Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Proteomische analyse van elk celtype is sterk afhankelijk van zowel de zuiverheid als de pre-fractionering van het uitgangsmateriaal om het monster te de-complexificeren vóór vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (MS). Door gebruik te maken van back-flushingtechnieken kunnen pure spermatozoa worden verkregen van knaagdieren. Na vertering kunnen fosfopeptiden worden verrijkt met behulp van TiO2.

Fosfopeptide Analyse van knaagdieren Epididymal Spermatozoa

Glycolyse is een bepalende metabolische marker in meerdere biologische systemen. Het monitoren van glycolyse door het meten van de extracellulaire flux van H+ is gebruikelijk, maar vereist correctie om kwantitatief en eenduidig te zijn. Hier laten we zien hoe je extracellulaire fluxgegevens kunt verzamelen en corrigeren om onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische bronnen van extracellulaire acidificatie.

Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

Deze techniek wordt beschreven real-time opname van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring tarieven in het netvlies weefsel transplanteren muis met behulp van een extracellulaire flux-analyzer.

Meting van de energie-stofwisseling in transplanteren retinale weefsel met behulp van extracellulaire Flux-analyse

Hier, twee medium-throughput assays voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma worden beschreven. Deze tests kunnen worden gebruikt om te sluiten snel en eenvoudig grote hoeveelheden compounds voor effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma.

Medium-throughput Screening tests voor de beoordeling van effecten op Ca2 +-signalering en Acrosoom reactie in het menselijk sperma

Hematopoietische stam voorlopercellen (Hspc's) overgang van een rusttoestand naar een differentiatie toestand als gevolg van hun metabole plasticiteit tijdens de bloedvorming. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van de mitochondriale ademhaling en glycolyse van Hspc's.

Analyse van hematopoietische stam voorlopercellen metabolisme

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

De analyse van de mitochondriale functie van sperma door middel van respirometrie met hoge resolutie maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik van vrij bewegende spermatozoa in een gesloten kamersysteem te meten. De techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijke spermatozoa te meten, wat informatie geeft over de mitochondriale kenmerken en integriteit van sperma.

Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen

Het AcroSensE-muismodel en de hier beschreven beeldvormingsmethoden voor levende cellen bieden een nieuwe benadering voor het bestuderen van de calciumdynamiek in het subcellulaire compartiment van het sperma-acrosoom en hoe deze tussenstappen reguleren die leiden tot membraanfusie en acrosoomexocytose.

Real-time beeldvorming van acrosomale calciumdynamiek en exocytose in levend muizensperma

Dit protocol beschrijft een kosteneffectieve manier om een glycolyse-stresstest uit te voeren om metabole herprogrammering in primaire muismicroglia te kwantificeren. Na isolatie en ontstekingsstimulatie wordt de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) gemeten met vers bereide, pH-gecorrigeerde reagentia, gevolgd door eiwitnormalisatie om een nauwkeurige en reproduceerbare beoordeling van glycolytische verschuivingen mogelijk te maken.

Onderzoek naar glycolyse in primaire microglia met behulp van extracellulaire fluxassay

Leer hoe je een extracellulaire flux-analyzer gebruikt om glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens capacitatie van muizensperma. Deze methode biedt real-time inzicht in metabole veranderingen.

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma (Video) | JoVE Journal

Met behulp van een extracellulaire flux Analyzer om veranderingen in glycolyse en oxidatieve fosforylering te meten tijdens het gebruik van muis sperma

Meer video's verkennen