Parallelle ondervraging van β-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening op een GPCR-Brede Schaal met presto-Tango Assay

Het Presto-Tango platform is ontworpen om de parallelle en gelijktijdige ondervraging van alle niet-reuk-GPCRs in het menselijk genoom uit te voeren, inclusief dat weesdoelen om ligand-geïnduceerde bèta-arresten te profileren in 2 rekrutering. Het Presto-Tango platform is de enige open source bron voor het profileren van het gehele GPCR genoom in een parallelle aanpak, met behulp van een G-eiwit onafhankelijke bèta-arrestin recruitment test. Het aantonen van de processor zou Genevieve Laroche een Research Associate in mijn lab zijn, en Manel Zighal, een promovendus in mijn lab.

Voeg voor aanvang van de procedure 20 microliter van een 25 microgram per milliliter poly-L-lysineoplossing toe aan elke put van het juiste experimentele getal van 384 optische bodemplaten en broed de platen gedurende 30 minuten tot twee uur bij kamertemperatuur uit. Aan het einde van de incubatie, flick de platen over de gootsteen om de overtollige poly-L-lysine te verwijderen en voeg 40 microliters van antibiotica antimycotische oplossing aan elke put. Dan incubeer de platen die nodig zijn voor cel zaaien op 37 graden Celsius en plaats de rest van de platen op vier graden Celsius voor langdurige opslag.

Om HTLA-cellen te zaaien voor primaire screening, spoel dan voorzichtig 150 millimeter celculturen met 10 milliliter PBS voordat ze de culturen behandelen met zes milliliters van 0,05% trypsine EDTA per gerecht. Wanneer de cellen zijn losgemaakt pool de cel suspensies in een 50 milliliter conische buis met een gelijk volume van DMEM. En verzamel de cellen door centrifugatie.

Stel de pellet opnieuw op met een 2,2 keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter DMEM-concentratie en veeg de platen over de gootsteen om de antimycotische oplossing van antibiotica te verwijderen. Tik op de platen te drogen en zaad 45 microliter cellen in elke put. Plaats dan de platen op 37 graden Celsius en 45% kooldioxide 's nachts.

Ter voorbereiding van de 384 goed DNA-bronplaat voor transfectie distribueren 50 nanogram per milliliter van elke plasmide gratis DNA codering van de GPRC Tango constructie van belang in 0.1X Tris-EDTA per goed in elke put van een 96 put plaat. Gebruik een multi-channel pipet om handmatig overdracht 10 microliter van DNA-oplossing van elke put van de 96 put plaat naar individuele putten van een 384 goed DNA-bronplaat in viervoudige voor elke aandoening zoals geïllustreerd. Breng vervolgens 40 microliter van een 0,313 molaire calciumchlorideoplossing over naar elke put van de DNA-bronplaat en meng voorzichtig de inhoud van elke put.

Voeg 50 microliter van 2x HEPES buffer toe aan elke put van de 384 goed DNA bronplaat met zachte menging. Na één minuut overdracht 10 microliters van het mengsel van de transfectie van DNA van de 384 goed de bronplaat van DNA aan elke put van gezaaide cellen HTLA en incubbateren de cellen in de incubator van de celkweek 's nachts. De volgende dag decanteren de transfected cell medium en langzaam toe te voegen 40 microliters van hongeren medium om elke goed zorg niet direct aan te raken de cellen.

Voeg vervolgens 20 microliter van de voertuigbuffer toe voor de afwisselende rijen zonder verbinding in 20 microliter van de verbinding van belang bij een driemaal concentratie in de afwisselende rijen, voordat de plaat terugkeert naar de celkweek incubator. 16 tot 24 uur na de stimulatie decanteert het transfected cellmedium en voeg 20 microliter vers bereide gloeireagens toe aan elke put voor een vijf tot 20 minuten durende incubatie bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Lees vervolgens de platen op een micro-plaat luminescentie teller met een integratietijd van een seconde per put.

Voor een secundaire screening, subcultuur de HTLA cellen in 100 millimeter schotels op een vijf keer 10 tot de zes cellen totale celdichtheid in 11 millimeter van het volledige medium per schotel voor 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag, gemengd 10 microgram GPCR gratis DNA met 500 microliters van Tris-EDTA calciumchloride oplossing met vortexing, gevolgd door de toevoeging van 500 microliters van HEPES buffer. Na krachtig schudden, incubeer de oplossing voor een minuut bij kamertemperatuur en onmiddellijk voeg een milliliter van de oplossing laten vallen verstandig op de cellen.

Zachtjes rocken om het neerslag gelijkmatig te verdelen en plaats de plaat op 37 graden Celsius gedurende 24 uur. Controleer de volgende dag de transfectie-efficiëntie onder een fluorescerende celafbeelding. Transacties groter dan 50% dekking zijn ideaal.

Spoel de doorsneden cellen voorzichtig af met verseneoplossing voordat u de cellen losmaakt met drie milliliters van 0,05% trypsin EDTA. Verzamel de gescheiden cellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op met een vier keer 10 tot de vijfde cellen per milliliter uitgehongerde gemiddelde concentratie. Dan zaad 45 microliter cellen in elke put van een poly-L-lysine gecodeerde 384 put plaat en plaats de plaat in de cel cultuur incubator voor ten minste vier uur.

Voor het opstellen van een half log dosis-curve responsplaat voeg 270 microliters van HBSS aangevuld met HEPES en antibioticum antimycoticum voor alle, maar de laatste rij van een 96 put plaat en voeg 30 microliter van elke hoge en lage drug oplossing aan de putten van rij H.Transfer de oplossing van elke put van rij H in de overeenkomstige put van rij G met mengen en blijven serieel verdunnen van de drug verbindingen tot de laatste rij van de plaat is bereikt. Met behulp van de schematische als referentie, meng 20 microliter van de lage kolom verdunningen van rijen A tot en met G van de 96 put plaat en 20 microliter van de hoge kolom verdunningen tot putten B door H van de 96 put plaat aan de eerder zittende 384 put plaat. Dan incubeer de plaat op 37 graden Celsius voor een minimum van 16 uur.

16 tot 24 uur na de stimulatie decanteren de transfected cell medium en voeg 20 microliter van gloeireagemiddel aan elke put voor een vijf tot 20 minuten incubatie voor het lezen van de platen op een microplaat luminescentie teller met een integratietijd van een seconde per goed. In dit representatieve experiment, van de 168 GPCRs die werden ondervraagd in de primaire screening, alleen dopamine receptor D3 en opsin 5 waren kanshebbers als potentiële actieve doelen. Dopamine receptor D3 produceerde een significante log2 voudige verandering van 4,7 terwijl opsin 5 een iets lagere respons van 2.39 geproduceerd.

Ter vergelijking, dopamine receptor D2, de positieve controle voor het primaire scherm produceerde een log2 vouw verandering van 4.58. Deze responscurven van de secundaire screening toonden aan dat chromatine granulaatextract vergelijkbare signaalvensters produceren in half maximaal effectieve concentratiewaarden tot quinpirole die de geldigheid ervan bevestigt als een actieve hit bij dopaminereceptor D3. Een vlakke dosis-curve vergelijkbaar met de negatieve controle werd geproduceerd voor opsin 5 echter uitsluiten van deze receptor als een mogelijk doelwit voor de chromatine granulaat extract. Presto-Tango vereist speciale zorg omdat variabiliteiten in celdistributie, transfectie-efficiëntie en seriële verdunningen kunnen leiden tot een samengestelde fout, die de nauwkeurigheid van de gegevens kan beïnvloeden.

Orthogonale methoden zoals Radioligand-bindende benaderingen, Bioluminescent resonance resonance energy transfer en cyclische AMP calcium en internalisatie functionele testen kunnen worden gebruikt om ligand receptor interacties verder te bevestigen en te karakteriseren.