Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Dit protocol is belangrijk omdat het ons in staat stelt om de functie van eiwitten te bestuderen, zoals extracellulaire matrixeiwitten, die in latere stadia van myotubevorming of rijping zijn up-regulated. Deze methode kan worden gebruikt om elk gen dat van belang is in C2C12-cellen neer te halen met behulp van specifieke shRNAs en de respectieve analytische instrumenten voor fenotypering. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat we C2C12-cellen hebben gegenereerd die onze genen van belang continu kunnen onderdrukken, zelfs in volwassen myotubes.

Het belangrijkste aspect van deze procedure is het handhaven van C2C12 cellen in de ongedifferentieerde toestand, wat betekent bij een lage celdichtheid tijdens de routinecelcultuur. De dag voor de overloop, zaad vijf keer 10 tot de vierde C2C12 cellen per milliliter in twee milliliter van volledige DMEM per goed in een zes-put plaat om een 40 tot 50% samenvloeiing te bereiken na 's nachts incubatie bij 37 graden Celsius en 5% CO2. De volgende ochtend, combineer 100 microliters van 25-millimolar natriumchloride in een 1,5-milliliter reactie buis per cultuur goed met 25,5 microliters PEI voorraad oplossing van een ongedifferentieerde C2C12 celcultuur voor een vijf minuten incubatie bij 37 graden Celsius.

Combineer vervolgens drie microgram plasmide DNA met 100 microliter van 25 millimolar natriumchloride per cultuur goed voor een vijf minuten durende incubatie bij 37 graden Celsius. Combineer aan het einde van de incubaties het volledige volume van elk verdund PEI-reagens met elke verdunde plasmidoplossing met zachte pipetting voor een incubatie van 25 minuten bij 37 graden Celsius. Vervang tijdens de incubatie de supernatants van de C2C12-celculturen door DMEM zonder antibiotica of serum.

Voeg aan het einde van de incubatie het volledige volume van elke transfectiemix toe aan elke put in druppels, terwijl u de celkweekschotel continu verplaatst. Na zes uur in de celcultuur incubator, vervang het medium in elke put met volledige DMEM. 24 uur na de transfectie, vervang de volledige DMEM in elke put met selectiemedium aangevuld met vijf microgram per milliliter puromycine, en de cellen terug te keren naar de celkweek incubator voor 10 tot 14 dagen of tot stabiele C2C12 cellen worden waargenomen.

Vouw vervolgens de puromycine-resistente C2C12-cellen uit in lage celdichtheidsculturen in aanwezigheid van vijf microgram per milliliter puromycine en cryopreserve zes tot tien flesjes cellen voor toekomstig gebruik. Om de C2C12 cellen voor te bereiden op differentiatie, zaad 1,5 keer 10 tot de vijfde stabiele puromycine-resistente C2C12 cellen in een milliliter selectiemedium per put in een 12-put plaat, en incubeer bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide totdat de culturen zijn 95% confluent. Om differentiatie te induceren, vervang het medium in elke put door serum-vrije DMEM om de twee dagen na de myotube formatie op een omgekeerde helder-veld microscoop uitgerust met een camera.

Voor myosine zware keten immunosmet de gedifferentieerde cellen, zaad vijf keer 10 tot de vierde puromycine-resistente C2C12 cellen in 500 microliters van volledige DMEM per kamer op een acht-put kamer dia, en de cellen terug te keren naar de celcultuur incubator. Wanneer de cellen 95% samenvloeiing bereiken, vervang het selectiemedium in elke put door 500 microliter serumvrije DMEM. Op de juiste experimentele tijdstippen, spoel de differentiërende cellen in elke put drie keer met 5 milliliter PBS per wasbeurt alvorens de cellen met 200 microliters van 4% paraformaldehyde in PBS per put te bevestigen.

Na 15 minuten, was de cellen drie keer met verse PBS per wasbeurt zoals net aangetoond, gevolgd door incubatie met 200 microliters van 5-molaire glycine in PBS per put gedurende vijf minuten. Aan het einde van de incubatie, was de cellen drie keer voordat u de cellen permeabiliseert met 200 microliter van 1%niet-ionische oppervlakteactieve stoffen in PBS gedurende 10 minuten. Blokkeer vervolgens de niet-specifieke antilichaambindingsplaatsen met 200 microliter van 5% runderserum albumine in PBS per put gedurende een uur, gevolgd door drie wasbeurten in PBS.

Na de laatste wasbeurt, label de cellen met 200 microliters van myosine zware ketting antilichaam gedurende twee uur bij kamertemperatuur. Na drie PBS wast, incubeer de cellen met de juiste secundaire antilichaam gedurende twee uur bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Na drie laatste wasbeurten, aspirate de PBS, en monteer de cellen met een druppel montage medium aangevuld met DAPI en een coverslip.

Bekijk vervolgens elke kamer op een fluorescentiemicroscoop met behulp van de juiste filterset. Om de knockdown efficiëntie in de celculturen te beoordelen door westerse blotting, eerste zaad drie keer 10 tot de vijfde puromycine-resistente C2C12 cellen in twee milliliters van volledige DMEM per goed in een zes-put plaat. Na 24 uur, spoel de culturen met PBS, en start differentiatie van de cellen met twee milliliter serum-vrije DMEM zoals aangetoond.

Voor analyse van de uitgescheiden eiwitten op de juiste experimentele tijdstippen, verzamel een milliliter serum-vrij geconditioneerd medium van elk goed in individuele 1,5-milliliter reactiebuizen voor centrifugatie. Breng na centrifugatie een milliliter van de geconditioneerde medium supernatants over in nieuwe 1,5 milliliter reactiebuizen en precipitaat de eiwitten met 391 microliter trichloorazijnzuur in niet-ionische oppervlakteactieve stoffen per buis. Na 30 seconden van vortexen, incubeer de mengsels op ijs gedurende 10 minuten.

Aan het einde van de incubatie, pellet de neergeslagen eiwitten door centrifugatie, en was de eiwit pellets drie keer met verse ijskoude aceton en een centrifugatie per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt drogen de pellets drie tot vier minuten bij kamertemperatuur voor de resuspensie in 50 microliters van SDS-PAGE monsterbuffer per buis. Kook vervolgens de monsters gedurende vijf minuten op 95 graden Celsius voor de analyse van de westelijke vlek volgens de standaardprotocollen.

Voor intracellulaire en membraangebonden eiwitanalyse, spoel de cellaag in elke put met twee milliliter PBS per put, en gebruik een celschraper om de cellen zorgvuldig te verjagen in één milliliter volumes PBS. Breng de cellen in individuele 1,5-milliliter buizen voor centrifugatie, gevolgd door drie wasbeurten in een milliliter PBS per buis per wasbeurt via centrifugatie. Na de laatste wasbeurt, resuspend de cel pellets in 200 microliter lysis buffer aangevuld met EDTA-vrije proteaseremmer cocktail reagens voor een 30-minuten incubatie op ijs.

Aan het einde van de incubatie, ultrasoon de monsters gedurende 15 seconden op ijs met een vermogensinstelling van 10 bij een operationele frequentie van 23 kilohertz, en verwijder de cel puin door centrifugatie. Breng de supernatants over in nieuwe 1,5 milliliter reactiebuizen en bepaal de eiwitconcentraties volgens standaardprotocollen. Combineer 100 microgram eiwit met 5X SDS-PAGE monsterbuffer in een totaal volume van 60 microliter per monster en kook de monsters gedurende vijf minuten bij 95 graden Celsius.

Analyseer vervolgens de monsters door westerse blotting voor de aanwezigheid van het gewenste doeleiwit. De selectie van puromycine-resistente C2C12 cellen kan worden bereikt binnen 10 tot 14 dagen na de transfectie als gevolg van een efficiënte eliminatie van de niet-resistente cellen. Typisch, meer dan 80% van de C2C12 cellen los te maken van de cel cultuur schotel tijdens deze periode en worden verwijderd tijdens routinecelonderhoud.

Puromycine-resistente C2C12 cellen uitdrukken van de controle of de ADAMTSL2 shRNA behouden hun spindel-vormige, langwerpige celmorfologie bij een lage celdichtheid, evenals hun vermogen om te differentiëren in myotubes. C2C12 differentiatie bij serum ontwenning kan worden gecontroleerd door helder-veld microscopie en immunostaining voor de myotube marker myosin zware keten. Myosine zware ketting-positieve myotubes worden waargenomen tussen drie tot vijf dagen na differentiatie initiatie en zijn multinucleated, zoals waargenomen door de aanwezigheid van meer dan een DAPI-positieve kern binnen de celgrenzen.

Zoals de genexpressie gegevens in proliferatie voorwaarden aantonen, de knockdown efficiëntie van de transfectie is 40 tot 60% westerse vlek analyse kan worden uitgevoerd om het succes van de knockdown in cel lysates verkregen, bijvoorbeeld, uit C2C12 cellen stabiel uitdrukken shRNA dat zich richt ADAMTSL2 in vergelijking met controle shRNA uitdrukken cellen te bevestigen. Zorg ervoor dat u de puromycine concentratie te handhaven tijdens het selectieproces hoog genoeg om alle van de niet-transfected C2C12 cellen te elimineren, of de niet-transfected cellen kunnen ontgroeien de transfected cellen. Deze test stelt ons in staat om de functie van extracellulaire matrix eiwitten die later worden uitgedrukt in spierontwikkeling te bepalen, zelfs als ze worden geïnduceerd vijf of 10 dagen na C2C12 differentiatie.

Vergeet niet dat het RNA-extractiereagens en de bèta-mercaptoethanol in een rookkap moeten worden behandeld en het trichloorazijnzuur volgens de juiste veiligheidsprotocollen moeten hanteren. Bedankt voor het kijken, en veel geluk met uw experiment.