Name: Levering van gemodificeerd mRNA in een myocardikoesmodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Leer een gestandaardiseerde methode voor genoverdracht met gemodificeerd RNA in muizen na myocardinfarct. Dit protocol toont injectietechnieken voor cardiaal onderzoek en klinische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen Ann Anu Kurian voor haar hulp met dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door een cardiologie start-up subsidie toegekend aan het Zangi laboratorium en ook door NIH subsidie R01 HL142768-01

Alle dierprocedures die hier zijn beschreven zijn goedgekeurd door Icahn School of Medicine op mount Sinai Institutional Care and Use Committee.
1. Synthese van modRNA
OPMERKING: De details van modRNA synthese zijn te vinden in Kondrat et al.13.
<ol><li>Bestel de plasmide sjablonen(Tabel van materialen) en het genereren van een schoon PCR-product te gebruiken als de mRNA-sjabloon.</li>
	<li>Bereid de modRNAs door transcriptie in vitro met een aangepaste ribonucleoside mix van de volgende (Tabel van materialen): T7 transcriptie kit, 6 mM anti-reverse cap analoog (ARCA) 30-O-Me-m7G(50) ppp(50)G, 75 mM guanosine sfosfaat, 75 mM adenosine sfosfaat, 75 mM cytidinesfosfaat, 100 mM pseudouridine-5-triphosfat en T7 DNase enzym.</li>
	<li>Zuiver de modRNA gemaakt in stap 1.2 met een transcriptie cleanup kit(Tabel van materialen)en behandelen met antarctische fosforfosfatase. Vervolgens herzuiveren de modRNA met de transcriptie opruimkit en kwantificeren met behulp van een spectrofotometer.</li>
	<li>Precipitate de modRNA met ethanol en ammoniumacetaat en resuspend in 10 mM Tris-HCl en 1 mM EDTA.</li>
	<li>Concentreer het modRNA voor in vivo levering door centrifugale filters en meet de kwaliteit met behulp van een geautomatiseerd elektroforeseplatform(Table of Materials).</li>
</ol>2. Voorbereiding van modRNA-injectie voor in vivo levering
<ol><li>Bereken het volume dat nodig is voor 100 μg luciferase (Luc)/Cre modRNA injectie op basis van de modRNA-concentratie.</li>
	<li>Meng het berekende volume modRNA met gelijke delen van sacharoseoplossing bereid in nucleasevrij water (0,3 g/mL) en 0,1 M citraatoplossing (pH = 7) (20 μL elk aanbevolen).</li>
	<li>Breng het uiteindelijke volume van de injectie op 60 μL door zoutoplossing toe te voegen.</li>
</ol>3. Hartinfarct chirurgie
<ol><li>Anesthesie en bereiding van het dier OPMERKING: Deze studie maakt gebruik van mannelijke en vrouwelijke CFW muizen 8−12 weken oud.<ol>
<li>Verdoven de muis met 2% isoflurane met behulp van een inductiekamer en plaats het dier op zijn rug in een dorsale positie met een gezichtsmasker over zijn neus en mond om de anesthesie bij te houden. Houd de anesthesie door mechanische ventilatie met behulp van een gasmasker uitgerust met een 7−8 mm luchtwegbuis en een filter.</li>
		<li>Om de muis te immobiliseren op het operatieplatform, beveilig je de ledematen met chirurgische tape. scheer het nekgebied en de linkerkant van de ribbenkast en ontsmet 70% ethanol en povidone jodium. Herhaal de desinfecterende stap twee keer. Controleer de reflexen, knijpen de staart en achterpoten om de diepte van anesthesie te beoordelen.</li>
		<li>Continu de lichaamstemperatuur van de kern bij normothermie (37,5−38 °C) monitoren en handhaven.</li>
		<li>Behoud een open luchtweg door intratracheale intubatie uit te voeren. Om dit te doen, plaats de muis in een ventrale positie met zijn mond naar de experimentator gericht en trek voorzichtig de tong. Pas de hoek van de nek aan en strek het intubatiepad recht en duw in de intubatie canule.</li>
		<li>In het geval dat het dier er niet doorheen kan ademen, kan tracheostomie worden uitgevoerd. Voer een cervicale incisie langs de middellijn isoleren van de huid, spieren, en weefsel waarin de luchtpijp met behulp van een microscoop. Wanneer de luchtpijp duidelijk zichtbaar is, steek de endotracheale buis in het weefsel tussen twee patroonringen onder de glottis door een klein gaatje te maken en het schedelgedeelte van de luchtpijp vast te houden met behulp van microchirurgische tangen.</li>
		<li>Let op de thoracale beweging van de muis om te controleren of beide longen zuurstof ontvangen. De ademhalingsfrequentie (RR) moet ongeveer 120 ademhalingen per minuut zijn, met een inspiratoire druk van 17−18 cm H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Linker voorste dalende (LAD) slagader ligation<ol>
<li>Om de LAD ligatie uit te voeren, draait u de muis voorzichtig zodat hij aan de rechterkant ligt. Til de huid op en voer een linkszijdige thoracotomie uit tussen de 3e en de 4e rib en ontleed het weefsel en de spieren zorgvuldig. Gebruik een cautery om bloedingen te voorkomen.</li>
		<li>Open de thorax voorzichtig en zodra het open is, vind het hart, zonder de long aan te raken met een scherp voorwerp. Plaats de oprolmechanismen in de incisie om de borstholte open te houden en een duidelijk zicht op het hart te hebben. Verplaats nu de longen naar de rand van de incisie en verwijder het deel van de hartzak die het hart bedekt om toegang te krijgen tot het voorste oppervlak van het hart.</li>
		<li>Identificeer de LAD zorgvuldig, dat kan worden gezien als een diep lichtrood vat tussen de longslagader en de linker oorschelp. Ligate de LAD proximale met een enkele hechting van een 7-0 zijden hechting. Plaats een borstbuis (28 G, venal katheter), tussen de 4e en de 5e rib.</li>
		<li>Sluit de thoracale incisie in lagen. Gebruik de 6-0 zijde lopende hechtingen om de ribben aan te passen en gebruik 5-0 zijde lopende hechtingen om de huid te sluiten. Zorg ervoor dat u een goed venster voor toekomstige echocardiografische meting te verlaten.</li>
		<li>Giet de thorax voorzichtig af met warme isotone oplossing (9 g natriumchloride in 1 L water) met behulp van een spuit van 2 mL. Plaats de muis op zijn rug. Als het uitvoeren van tracheostomie, neem de endotracheale buis uit en met behulp van 7-0 zijden hechtingen passen de tracheale cartridge ringen met een enkele steek. Plaats het gezichtsmasker op de muis en sluit de huid met behulp van 5-0 zijde lopende hechtingen.</li>
		<li>Los voor de herstelfase de intubatie canule van de ventilator los en laat spontane ademhaling toe. Plaats het dier onder een hittelamp tot het bewustzijn bereikt. Laat het dier na de operatie niet onbeheerd achter totdat het volledig wakker is.</li>
		<li>Beheer pijntherapie met buprenophine op 0,1 mg/kg lichaamsgewicht, onderhuids geïnjecteerd voor de komende 3 dagen bij 12 uur intervallen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Cardiale levering van modRNA
<ol><li>Lever in totaal 60 μL van het modRNA dat in stap 2.3 intramusculair (IM) wordt bereid met behulp van een insulinespuit (31 G) na een MI.<ol>
<li>Injecteer 20 μL van het modRNA op drie verschillende plaatsen van de hartspier rond het infarctgebied (twee aan weerszijden van ligatie en één in de top). Voer de injecties onmiddellijk na de LAD uit, voordat u de borst sluit. OPMERKING: Representatieve afbeeldingen van modRNA-injectieplaatsen zijn te zien in figuur 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Eiwit expressie validatie in hart post MI
<ol><li>Luciferase modRNA expressie met behulp van een bioluminescentie beeldvormingssysteem OPMERKING: Een totaal van 100 μg Luc mRNA bereid in 60 μL van de sacharose citraat buffer wordt direct geïnjecteerd in het hart van CFW muizen na de MI.<ol>
<li>Bij 24 uur na MI en modRNA injectie verdoven de muizen met 2% isoflurane met behulp van een inductiekamer en intraperitoneally luciferin (150 mg/g lichaamsgewicht) injecteren om het Luc-signaal in vivo te valideren.</li>
		<li>Beeld de muizen met behulp van een bioluminescentie beeldvormingssysteem om de 2 minuten tot het Luc signaal verzadiging bereikt.</li>
		<li>Kwantificeer de verzamelde beeldgegevens met imaging analysesoftware. Gebruik de muizen geïnjecteerd met zoutoplossing alleen als een basislijn lezing voor Luc expressie en trek het achtergrondsignaal verzameld van de zout-geïnjecteerde muizen. LET OP: Luc signaal wordt uitgedrukt in p/s/cm2/sr x 106.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunostaining voor Cre transfection validatie<ol>
<li>Om de transfectie met Cre te valideren, offert u de dieren 24 uur na injectie op met behulp van een intraperitoneale injectie van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine, gevolgd door cervicale dislocatie. Voordat u een incisie maakt, desinfecteert u de borst en buik met een 70% alcoholuitstrijkje.</li>
		<li>Open de borstholte door een dwarse incisie ~1 cm lager dan het borstbeen te maken en beweeg de schaar naar het hoofd, snijdend door de ribbenkast.</li>
		<li>Open de borst en injecteer 1 mL steriele PBS in de rechter ventriculaire kamer om overtollig bloed te verwijderen. Dlijt het hart onmiddellijk uit en leg het in de steriele PBS om het resterende bloed weg te wassen.</li>
		<li>Bevestig het hart in 4% paraformaldehyde (PFA) voor 24 uur, gevolgd door nachtelijke incubatie in 30% sacharoseoplossing bij 4 °C. De volgende dag verankeren de harten in optimale snijtemperatuur medium en sectie ze op een dikte van 10 μm met behulp van een cryostat.</li>
		<li>Bevlek de secties met primair antilichaam tegen harttroponine I (cTNI) en label ze met een fluorescerend secundair antilichaam. Om de kern te identificeren, vlek met 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) voor 5 min. Beeld de dia's met behulp van een fluorescerende microscoop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Statistische analyse
<ol><li>Zet een staafgrafiek uit op basis van de Luc-expressie in zoute en luc-geïnjecteerde muizen en rapporteer de waarden als gemiddelde ± SEM. Vergelijk de twee groepen met behulp van een ongepaarde t-test (****p < 0,0001).</li>
</ol>

<ol><li>Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+innate+immune+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The innate immune response to adenovirus vectors.</a> Human Gene Therapy. 15 (12), 1157-1166 (2004).</li>
<li>Donsante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observed+incidence+of+tumorigenesis+in+long-term+rodent+studies+of+rAAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors.</a> Gene Therapy. 8 (17), 1343-1346 (2001).</li>
<li>Calcedo, R., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+Immune+Response+to+AAV%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humoral Immune Response to AAV.</a> Frontiers in Immunology. 4, 341(2013).</li>
<li>Diebold, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+agonists+for+Toll-like+receptor+7+are+defined+by+the+presence+of+uridine+ribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid agonists for Toll-like receptor 7 are defined by the presence of uridine ribonucleotides.</a> European Journal of Immunology. 36 (12), 3256-3267 (2006).</li>
<li>Magadum, A., Kaur, K., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Based+Protein+Replacement+Therapy+for+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">mRNA-Based Protein Replacement Therapy for the Heart.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 785-793 (2019).</li>
<li>Kariko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+pseudouridine+into+mRNA+yields+superior+nonimmunogenic+vector+with+increased+translational+capacity+and+biological+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability.</a> Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).</li>
<li>Hadas, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Modified+mRNA+In+Vitro+Synthesis+Protocol+for+Heart+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-+Methods+and+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Optimizing Modified mRNA In Vitro Synthesis Protocol for Heart Gene Therapy.</a> Molecular Therapy- Methods and Clinical Development. 14, 300-305 (2019).</li>
<li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Cardiac+Delivery+of+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing Cardiac Delivery of Modified mRNA.</a> Molecular Therapy. 25 (6), 1306-1315 (2017).</li>
<li>Zangi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Carlsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+VEGF-A+mRNA+Improves+Cardiac+Function+after+Intracardiac+Injection+1+Week+Post-myocardial+Infarction+in+Swine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+Methods+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Purified VEGF-A mRNA Improves Cardiac Function after Intracardiac Injection 1 Week Post-myocardial Infarction in Swine.</a> Molecular Therapy Methods Clinical Development. 9, 330-346 (2018).</li>
<li>Huang, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chemically+modified+mRNA-based+delivery+of+cytoprotective+factor+promotes+early+cardiomyocyte+survival+post-acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Synthetic chemically modified mRNA-based delivery of cytoprotective factor promotes early cardiomyocyte survival post-acute myocardial infarction.</a> Molecular Pharmaceutics. 12 (3), 991-996 (2015).</li>
<li>Magadum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+a+Single+N-Glycosylation+Site+in+Human+FSTL+1+Induces+Cardiomyocyte+Proliferation+and+Cardiac+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Ablation of a Single N-Glycosylation Site in Human FSTL 1 Induces Cardiomyocyte Proliferation and Cardiac Regeneration.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 13, 133-143 (2018).</li>
<li>Kondrat, J., Sultana, N., Zangi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Modified+mRNA+for+Myocardial+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Modified mRNA for Myocardial Delivery.</a> Methods in Molecular Biology. 1521, 127-138 (2017).</li>
<li>Gan, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intradermal+delivery+of+modified+mRNA+encoding+VEGF-A+in+patients+with+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Intradermal delivery of modified mRNA encoding VEGF-A in patients with type 2 diabetes.</a> Nature Communication. 10 (1), 871(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gentherapie heeft aangetoond enorm potentieel om aanzienlijk te bevorderen van de behandeling van hart-en vaatziekten. Echter, traditionele instrumenten die worden gebruikt in de eerste klinische studies voor de behandeling van HF hebben aangetoond beperkt succes en worden geassocieerd met ernstige bijwerkingen. Gemodificeerd RNA presenteert een niet-virale genlevering die voortdurend aan populariteit wint als een genoverdrachtsinstrument in het hart. ModRNA vereist geen nucleaire lokalisatie van genen voor vertaling, en...

Gentherapie is een krachtig instrument waarbij de levering van nucleïnezuren voor de behandeling, genezing, of preventie van menselijke ziekten. Ondanks de vooruitgang in de diagnostische en therapeutische benaderingen voor hart-en vaatziekten, is er beperkt succes in de levering van genen in hartinfarct (MI) en hartfalen (HF). Zo eenvoudig als het proces van gentherapie lijkt, het is een duidelijk complexe aanpak gezien de vele factoren die moeten worden geoptimaliseerd voordat u een bepaald leveringsvoertuig in dienst neemt. De juiste toedoogd moet niet-immunogeen, efficiënt en stabiel zijn in het menselijk lichaam. Inspanningen op dit gebied hebben geleid tot twee soorten leveringssystemen: virale of niet-virale. De veelgebruikte virale systemen, met inbegrip van genoverdracht door adenovirus, retrovirus, lentivirus, of adeno-geassocieerd virus, hebben aangetoond uitzonderlijke transduction capaciteit. Het gebruik ervan in klinieken is echter beperkt als gevolg van de sterke immuunrespons geïnduceerde1, risico op tumorigenese2, of de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen3, die allemaal een groot obstakel blijven voor een brede en effectieve toepassing van virale vectoren in menselijke gentherapie. Aan de andere kant, ondanks hun indrukwekkende expressie patroon, de levering van naakte plasmiDE DNA toont een lage transfectie efficiëntie, terwijl mRNA overdracht presenteert een hoge immunogeniciteit en gevoeligheid voor afbraak door RNase4.
Met het uitgebreide onderzoek op het gebied van mRNA is modRNA een aantrekkelijk instrument geworden voor de levering van genen aan het hart en diverse andere organen vanwege de vele voordelen ten opzichte van traditionele vectoren5. Volledige vervanging van uridine door natuurlijk voorkomende pseudouridine resulteert in een robuustere en voorbijgaande eiwitexpressie, met minimale inductie van aangeboren immuunrespons en risico op genomische integratie6. Recent vastgestelde protocollen maken gebruik van een geoptimaliseerde hoeveelheid anti-reverse cap analog (ARCA) die de eiwitvertaling verder verbetert door de stabiliteit en transabiliteit van het synthetische mRNA7te verhogen.
Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de uitdrukking van verschillende verslaggever of functionele genen geleverd door modRNA in het knaagdier myocardium na MI. Met modRNA-toepassingen zijn belangrijke gebieden van het myocardium, waaronder zowel cardiomyocyten als noncardiomyocyten, met succes doorgetransfecteerd na hartletsel8 om angiogenese9,10,hartceloverleving11en cardiomyocyte proliferatie12te induceren . Een enkele toediening van modRNA gecodeerd voor gemuteerde menselijke follistatine-achtige 1 induceert de proliferatie van muis volwassen CMs en aanzienlijk verhoogt de cardiale functie, vermindert litteken grootte, en verhoogt capillaire dichtheid 4 weken na MI12. Een meer recente studie gemeld verbeterde cardiale functie na MI met toepassing van VEGFA modRNA in een varkens model10.
Dus, met de toegenomen populariteit van modRNA in het hartveld, is het essentieel om een protocol te ontwikkelen en te optimaliseren voor de levering van modRNA aan het hart post-MI. Herein is een protocol dat de voorbereiding en levering van gezuiverde en geoptimaliseerde modRNA beschrijft in een biocompatibele citraat-zoutoplossing die robuuste, stabiele eiwitexpressie biedt zonder enige immuunrespons te stimuleren. De methode in dit protocol en video toont de standaard chirurgische ingreep van een muis MI door permanente ligatie van de linker voorste aflopende slagader (LAD), gevolgd door drie site intracardiac injecties van modRNA. Het doel van dit document is om een zeer nauwkeurige en reproduceerbare methode van modRNA levering aan murine myocardium duidelijk te definiëren om modRNA toepassing wijd toegankelijk voor hartgentherapie te maken.

<table><tbody><tr><td>Adenosine trifosfaat</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inbegrepen in Megascript kit</td></tr><tr><td>Antarctic Phosphatase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>Anti-reverse cap analoog, 30-O-Mem7G(5') ppp(5')G</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-7003</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescentie beeldvormingssysteem</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>IVIS100 charge-coupled device beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Blunt retractoren</td><td>FST</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Cardiac troponin I</td><td>Abcam</td><td>47003</td><td></td></tr><tr><td>Cytidinetrifosfaat</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inbegrepen in Megascript kit</td></tr><tr><td>Dual Anesthesie Systeem</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-2001</td><td></td></tr><tr><td>Forceps- Adson</td><td>FST</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Forceps- Dumont #7</td><td>FST</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Guanosinetrifosfaat</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inbegrepen in Megascript kit</td></tr><tr><td>In vitro transcriptie kit</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>5X MEGAscript T7 Kit</td></tr><tr><td>Intubatiecanule</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Megaclear kit</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Muis ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-4279</td><td></td></tr><tr><td>N1-methylpseudouridine-5-trifosfaat</td><td>TriLink Biotechnologies</td><td>N-1081</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olsen hegar naaldhouder met sutuurschaar</td><td>FST</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid templates</td><td>GeneArt, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scherp-puntige dissectiescharen</td><td>FST</td><td>14200-12</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>Y433H</td><td>5.00</td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>Y432H</td><td>6.00</td></tr><tr><td>Sutures</td><td>Ethicon</td><td>7733G</td><td>7.00</td></tr><tr><td>T7 DNase enzym</td><td>Invitrogen</td><td>AMB13345</td><td>Inbegrepen in Megascript kit</td></tr><tr><td>Tape station</td><td>Aligent</td><td>4200</td><td></td></tr><tr><td>Transcription clean up kit</td><td>Invitrogen</td><td>AM1908</td><td>Megaclear</td></tr><tr><td>Ultra-4 centrifugale filters 10k</td><td>Amicon</td><td>UFC801096</td><td></td></tr></tbody></table>

levering van gemodificeerd mrna in een myocardikoesmodel

Delivery of Modified mRNA in a Myocardial Infarction Mouse Model

Myocardiaal infarct (MI) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit in de westerse wereld. In het afgelopen decennium is gentherapie een veelbelovende behandelingsoptie geworden voor hart- en vaatziekten, vanwege de efficiëntie en uitzonderlijke therapeutische effecten. In een poging om het beschadigde weefsel post-MI te herstellen, hebben verschillende studies gebruik genomen van DNA-gebaseerde of virale gentherapie, maar hebben aanzienlijke hindernissen ondervonden als gevolg van de slechte en ongecontroleerde expressie van de geleverde genen, oedeem, aritmie en cardiale hypertrofie. Synthetische gemodificeerde mRNA (modRNA) presenteert een nieuwe gentherapie benadering die hoge, voorbijgaande, veilige, niet-immunogenic, en gecontroleerde mRNA levering aan het hartweefsel biedt zonder enig risico van genomische integratie. Door deze opmerkelijke kenmerken in combinatie met de klokvormige farmacokinetiek in het hart is modRNA een aantrekkelijke aanpak geworden voor de behandeling van hartziekten. Om de effectiviteit ervan in vivo te vergroten, moet echter een consistente en betrouwbare leveringsmethode worden gevolgd. Om de modRNA-leveringsefficiëntie en de consistentie van modRNA voor in vivo-toepassingen te maximaliseren, wordt daarom een geoptimaliseerde methode voor voorbereiding en levering van modRNA intracardiac-injectie in een muis-MI-model gepresenteerd. Dit protocol zal modRNA levering toegankelijker maken voor fundamenteel en translationeel onderzoek.

Acht tot tien weken oude muizen werden verdoofd met isoflurane en geïntubeerd. Nadat het dier onder narcose was, werd het linker thoracale gebied geschoren en gesteriliseerd met ethanol, en het hart werd blootgesteld voor LAD ligatie. De linker kransslagader werd afgesloten door stevig knopen van de hechting onder de slagader (diagram vertegenwoordiging Figuur 1A). Na een succesvol infarct (aangegeven door de paling van de linker ventriculaire vrije muur), werd een directe injectie van 100 μ...

Dit protocol presenteert een eenvoudige en coherente manier om een gen van belang te upreguleren met behulp van modRNA na een hartinfarct bij muizen.

Levering van gemodificeerd mRNA in een myocardikoesmodel

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality in the Western world. In the past decade, gene therapy has become a promising ...

Gemodificeerd RNA is een nieuwe methode voor genoverdracht naar het hart en andere organen. Dit protocol zal nauwkeurige aanpak van het leveren van gewenste genen tijdelijk naar het hart, post myocardiaal infarct. Deze methode is niet beperkt tot een hartinfarct, maar kan ook worden toegepast op ischemie reperfusie, en transversale aorta vernauwing modellen.Gemodificeerd RNA wordt gebruikt in verschillende menselijke klinische studies. Er is echter geen gestandaardiseerd protocol voor gen overgebracht naar het hart met behulp van deze methode. Visuele demonstratie zal onderzoekers in staat stellen om gemodificeerd RNA correct te injecteren op geschikte plaatsen in het hart.Het demonstreren van de procedule zal Ajit Magadum, een postdoctoraal collega, en Elena Chepurko een dieren supervisor van ons laboratorium. Op basis van de concentratie van de eerder bereid op modRNA, bereken het volume van modRNA die nodig is voor een 100 microgram injectie. Maakt gelijke volumes van sacharose en citraat oplossingen.Voeg vervolgens het berekende volume modRNA toe en voldoende zoutoplossing om het injectievolume op 60 microliter te brengen. Na het verdoven van het dier, plaats het ventrale kant

delivery-of-modified-mrna-in-a-myocardial-infarction-mouse-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Tal van genetische manipulaties en / of intramyocardial injecties van genen, eiwitten, cellen en / of biomaterialen wordt toegevoegd aan de dimensie van de tijd in studies van de acute ischemie / reperfusie schade en chronische remodeling bij muizen. Deze video illustreert de microchirurgische procedures voor ischemie / reperfusie, permanent coronaire ligatie, en intramyocardial injectie studies.

Kransslagader Ligatie en Intramyocardial Injectie in een muizenmodel van Infarction

De chirurgische procedure gebruikt om experimentele myocardinfarct bij de muis begint met linker thoractomie tussen de derde en vierde ribben om visualiseren het voorste oppervlak van het hart en linker long. De linker coronaire arterie geligeerd, wordt de borst gesloten en de muis mag spontaan herstellen.

Gewijzigd Techniek voor Coronary Artery Ligatie in Muizen

We introduceren een chirurgische methode experimentele ischemie / reperfusie (I / R) letsel veroorzaken simuleren myocardiaal infarct (MI) in muismodellen die zorgt voor meer duidelijkheid in positionering van de ligatie van de LAD (LAD) om de reproduceerbaarheid te verhogen MI van experimenten in muizen.

Een muizenmodel van myocard ischemie-reperfusie schade door de eileiders van de LAD

Echocardiografie-geleide percutane intramyocardiale injectie vertegenwoordigt een efficiënte, betrouwbare en richtbare modaliteit voor de levering van genoverdracht agentia of cellen in muizen hart. Naar aanleiding van de stappen in dit protocol, kan de operator snel bevoegd in deze veelzijdige, minimaal invasieve techniek geworden.

Echogeleide Transthoracale intramyocardiale Injectie in Muizen

Een zeer reproduceerbaar model voor myocardinfarct bij muizen met minimale invasieve manipulaties wordt beschreven. Het model kan eenvoudig worden uitgevoerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid en overlevingsgraad. Daarom zal het beschreven model het aantal benodigde dieren verminderen zoals gevraagd door het 3R-principe (Vervanging, Verfijning en Vermindering).

Minimaal invasieve chirurgische procedure voor het induceren van Myocardinfarct in Muizen

Hierin beschrijven we een chirurgische ingreep die laat zien hoe u permanente ligatie van de linker-anterieure aflopende coronaire slagader bij muizen bereikt. Dit model is van groot belang om de pathofysiologie van myocardiaal infarct en de gelijktijdige biologische processen te onderzoeken.

Murine myocardinfarct model met behulp van permanente Ligatie van linker anterieure aflopende coronaire slagader

Onder adequate anesthesie werd het muizenhart geëxternaliseerd door de intercostale ruimte en werd een myocardinfarct met succes geïnduceerd door de linker voorste dalende slagader (LAD) af te binden met behulp van materialen die in de meeste laboratoria gemakkelijk verkrijgbaar zijn.

Een aangepaste eenvoudige methode voor het opwekken van een hartinfarct bij muizen

Hier beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare methode die myocardinfarct of myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen kan induceren door precisieligatie van de linker voorste dalende kransslagader door middel van micromanipulatie.

Inductie van myocardinfarct en myocardischemie-reperfusieletsel bij muizen

Hier wordt een chirurgische procedure gepresenteerd voor permanente ligatie van de linker kransslagader bij muizen. Dit model kan worden gebruikt om de pathofysiologie en bijbehorende ontstekingsreactie na een hartinfarct te onderzoeken.

Ligatie van de linker kransslagader: een chirurgisch muizenmodel van myocardinfarct

Dit protocol beschrijft de generatie en fenotypische karakterisering van een C57BL/6N-Cracdem1(c.538-83 to c.3352+255 del) muismodel met behulp van CRISPR/Cas9-technologie om de rol van CRACD bij cardiale remodellering na een myocardinfarct te bestuderen.

Generatie en fenotypische karakterisering van een CRISPR/Cas9-gemodificeerd Cracd-deficiënt muismodel voor studies naar remodellering na myocardinfarct

Leer een gestandaardiseerde methode voor genoverdracht met gemodificeerd RNA in muizen na myocardinfarct. Dit protocol toont injectietechnieken voor cardiaal onderzoek en klinische toepassingen.

Levering van gemodificeerd mRNA in een myocardikoesmodel

Meer video's verkennen