Identificatie van Neutrophil Extracellular Traps in Paraffine-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescentie Microscopie

Dit protocol van de parafinisatie gevolgd door antigeneraal ophalen van paraffine-ingebedde aortasecties kan een nuttig hulpmiddel zijn om de rol van neutrofiele driehoekige vallen bij katachtige trombose te bestuderen. Detectie van neutrofiele driehoekige vallen door immunofluorescentie in vast en paraffine-ingebed weefsel, is superieur aan conventionele histologische stents zoals HNE, omdat het gelijktijdige detectie van veiliger DNA en extracellulaire eiwitten mogelijk maakt. Dit protocol kan worden gebruikt in andere soorten trombi en bij andere veterinaire soorten.

Identificatie van neutrofiele extracellulaire vallen binnen katachtige arteriële trombi suggereren dat ze een rol kunnen spelen bij trombose bij katten. Protocollen die hier worden gepresenteerd zijn richtlijnen. We raden onderzoekers ten zeerste aan om de duur en voorwaarden van het antigeenophaalproces aan te passen om een bevredigend signaal af te geven.

Om een geautomatiseerd systeem te gebruiken om deparaffinisatie en re-hydratatie van de secties op glazen platen uit te voeren, plaatst u de glazen glijbanen in rekken. Dompel volledig onder in 100 procent zout gedurende drie minuten. Herhaal deze stap twee keer.

Spoel niet tussen de stappen door. Dompel volledig onder in afnemende concentraties ethanol bij kamertemperatuur drie keer gedurende drie minuten per stuk. Dompel volledig in gedeïmiseerd water gedurende twee minuten en herhaal nog een keer.

Na behandeling met TBST, vul het reservoir met gedeïsiseerd water verwarmd tot 100 graden Celsius. Laat de stoommachinekamer gedurende 20 minuten in evenwicht brengen. Verwarm op een warmteplaat de commercieel verkrijgbare antigeenophaaloplossing met Tris en EDTA bij pH 9,0 tot 95 tot 97 graden Celsius.

Zorg ervoor dat het niet kookt. Onderbezet de dia's volledig in de verwarmde antigeenophaaloplossing en zet de toepassing van externe verwarming via de stoomboot gedurende 20 minuten voort. Was vervolgens de dia's drie keer met TBST gedurende vijf minuten.

Plaats nu de secties in het blokkeren van buffer 1. Incubeer gedurende twee uur bij kamertemperatuur onder zacht schommelen tussen 30 en 50 rpm. Breng zonder wassen onmiddellijk 100 microliter verdunde konijnpolylonale anti-menselijke citrullinated histone H3-antilichaam rechtstreeks op de dia aan.

Plaats een afdeksel op elke sectie om een gelijkmatige verdeling van het antilichaammengsel mogelijk te maken. Incubeer voor 12 tot 16 uur bij vier graden Celsius met zacht schommelen. Daarna, was de dia's drie keer met TBST voor vijf minuten per keer.

Gebruik een pipet om antilichamen aan te brengen en verdeel gelijkmatig 100 microliter geitenanti-konijnantilichaam geconjugeerd naar Alexa Fluor 488. Bedek de glijbanen met aluminiumfolie en broed de glijbanen gedurende een uur bij kamertemperatuur onder zacht schommelen. Na het wassen met TBST volgens het manuscript, broeden de secties in het blokkeren van buffer 2 's nachts op vier graden Celsius onder zachte schommelen.

Bescherm tegen het licht. Was met TBST drie keer gedurende vijf minuten per keer. Blokkeer de secties in het blokkeren van buffer 3 zoals eerder gedaan bij kamertemperatuur gedurende twee uur onder zachte schommelen.

Incubeer de secties met biotine laded ployclonal konijn anti-menselijke neutrophil elastase antilichaam op vier graden Celsius gedurende 12 tot 16 uur zoals eerder beschreven. Na het wassen met TBST de glijbanen met Alexa Fluor 594 Streptavidin Conjugate gedurende een uur bij kamertemperatuur. Daarna, wassen met TBST een keer gedurende vijf minuten.

Breng 100 microliter van Autofluorescense Quenching oplossing mengsel direct op de secties voor een minuut, zoals geïnstrueerd door de fabrikant. Was onmiddellijk de glijbanen met TBST zes keer gedurende 10 minuten per keer. Bedek elke dia met 100 microliter van 300 nanomolar DAPI gedurende vijf minuten in het donker.

Dan wassen met TBST vijf keer gedurende drie minuten elke keer. Breng een druppel antifade montagemedium direct aan op de glazen schuif rond de sectie. Plaats een deksel slip zachtjes op de sectie zonder het creëren van bubbels.

Laat de monsters 's nachts genezen in het donker op vier graden Celsius. Om trombi te lokaliseren, scan cranially te caudally langs de lengte van de aorta, aorta bifurcatie en elke femerale slagader met behulp van fase contrast microscopie met een 10x doelstelling. Bestudeer eerst de secties voor celvrij DNA met behulp van het DAPI-kanaal met de excitatie op 357 en 44 nanometer.

Identificeer extracellulaire neutrofiele elastase en citrullinated histone H3 op de Texas rode en groene fluorescerende eiwitkanalen respectievelijk. Behoud consistente belichtingstijd en winsten van elk kanaal tijdens de verwerving van afbeeldingen om verzadiging in pixelintensiteit te voorkomen. Neutrofiele extracellulaire vallen zijn geïdentificeerd op basis van co-lokalisatie van neutrofiele elastase, citrullinated histone H3 en cel-vrij DNA.

Met behulp van hematoxyline en eosine vlek, en helderveld microscopie, katachtige arteriële trombi bestaan uit rode bloedcellen, leukocyten, fibrin en bloedplaatjes. NETs verscheen als netwerken van diepe paarse draden van verschillende lengtes rond de nabijgelegen erythrocyten en leukocyten. Met behulp van dit protocol, immunofluorescentie microscopie bleek grote aggregaten van NETs samengesteld uit cel-vrij DNA, extracellulaire citrullinated histone H3 en neutrofiele elastase.

Onder fasecontrast in immuunmicroscopie, werd een trombus gekenmerkt als goed-afgebakende structuur binnen de vasculaire ruimte. In geen van de controlemonsters werden echter trombi gedetecteerd. Deze figuur toont diepgaande autofluoresence van stolselelementen zoals erytrocyten wanneer afgebeeld op de 488 nanometer golflengte.

Korte autofluoresence quenching na immunolabelling aanzienlijk verhoogd de gevoeligheid van eiwit co-lokalisatie en NET detectie, zelfs in gebieden met een overvloed aan erythrocyten. De duur van fixatie heeft gevolgen voor de immunoreactiviteit van bepaalde antigenen. Wij raden fixatie niet langer dan 24 uur par de uitdroging en paraffine inbedding.

Als alternatief kan methanol-vrij paraformaldehyde worden gebruikt om artefact te beperken door mierenzuur en ketonen van oxidatie van formaldehyde. Om interferentie te voorkomen bij het gebruik van primaire antilichamen van dezelfde soort, hebben we extra blokkeringsstap toegevoegd om eventuele resterende bindingsplaatsen op de secundaire antilichamen te verzadigen. Onderzoekers moeten negatieve controles omvatten die bestaan uit isotypeantilichamen, uitsluiting van primaire antilichamen en immuno-etiketteringsstap en biologische controles van katten zonder trombose.

Autofluoresence van weefselgrenzen van trombi kan de microscopische identificatie van neutrofiele extracellulaire vallen hameren. De onderzoeker kan de fluorescentie door het gebruik van verre rode fluoroforen minimaliseren. Deze techniek kan een waardevol hulpmiddel zijn voor de studie van neutrofiele extracellulaire vallen bij andere veterinaire soorten.

Dit kan een beter begrip geven van de pathofysiologie van trombose.