Synthese van gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes, hun vervoeging met de Siderophore Feroxamine en de evaluatie voor bacteriën detectie

Magnetische nanodeeltjes zijn ideale instrumenten voor analytische wetenschap en nanogeneeskunde vanwege hun sterke magnetische eigenschappen en de eenvoudige functionalisering van hun oppervlak. We rapporteren hier de eerste instantie van een conjugaat tussen aminofunctionaliseerde silica magnetische deeltjes en de siderophore feroxamine samen met evaluatie voor het vastleggen van fotogeniek materiaal. Siderophores zijn kleine, organische moleculen die een belangrijke rol spelen in het ijzeren deelnemersmechanisme, en ze worden herkend door specifieke buitenste membraanreceptoren van bacteriën.

Deze video toont stap voor stap een efficiënt protocol om magnetische ijzernanodeeltjes voor te bereiden. Vervolgens werden ze bedekt met silica om de verspreiding te beschermen en de magnetische kern te beschermen. Het resulterende reactoroppervlak werd gefunctionaliseerd met aminegroepen.

Synthese van magnetische nanodeeltjes geconjugeerd met feroxamine. Voeg 0,5 gram Fe(acac)3 toe in een glazen flacon van 20 mL. Meng vervolgens met een benzylalcohol van 10 mL.

Sonicate dit mengsel gedurende 2 minuten. Breng vervolgens 72 uur over op een verwarmingsblok en verwarm op 180 graden Celsius. Spoel de nanodeeltjes af met 96% ethanol.

En centrifuge gedurende 30 minuten. Scheid de nanodeeltjes van de supernatant door magnetische aantrekkingskracht, met behulp van een neodymium magneet. Gooi het resterende oplosmiddel weg.

Gooi de supernatant, afgewisseld met sonicatie, totdat het oplosmiddel er duidelijk uitziet. Bereid een suspensie van 2 gram MNP in 80 milliliter isopropanol, voeg 4 milliliter van 21%ammoniak, 7,5 milliliter gedestilleerd water en 0,56 milliliter TEOS toe. Verwarm het mengsel op 40 graden Celsius gedurende 2 uur, met continu roeren.

Dan, sonicate voor 1 uur. Scheid de MNP met een magneet, gooi het supernatant weg, verspreid het in 30 milliliter isopropanol, voeg ammoniak, gedestilleerd water en TEOS toe, in dezelfde volgorde als eerder beschreven. Verwarm het mengsel op 40 graden Celsius gedurende twee uur met continu roeren.

Dan, sonicate voor een uur. Verwijder en was gemakkelijk de magnetische roerstaaf, om al het materiaal terug te krijgen. Gooi de supernatant weg en spoel de nanodeeltjes drie keer af met 96%-ethanol, afgewisseld met sonicatie.

Droog de nanodeeltjes onder vacuüm op kamertemperatuur gedurende 12 uur. Spoel 500 milligram van de MNP@SIO2 verkregen uit de vorige stap met dimethylformamide. Sonicate ze en gooi.

Stel de deeltjes opnieuw op in een ronde bodemkolf, roer met een magnetische staaf en voeg 9 milliliter APTES toe. Roer het mengsel op 60 graden Celsius gedurende 12 uur. Gooi de supernatant weg en spoel de nanodeeltjes drie keer af met 96%-ethanol, afgewisseld met sonicatie.

Los een 100 mg deferoxamine, mesylaatzout en 53,0 milligram ijzeracetylacetonaat op in 5 milliliter gedestilleerd water. Roer het mengsel 's nachts op kamertemperatuur. Was het resulterende product drie keer met 20 milliliter ethylacetaat in een scheidingstrechter.

Verwijder het organische oplosmiddel onder vacuüm. Vriesdroog de waterige fase om feroxamine en een rode vaste stof te betalen. Voeg 350 milligram barnsteenzuuranhydride toe aan een oplossing van 100 mg feroxamine in 5 milliliter pyridine in een ronde fles met 50 milliliter.

Roer het resulterende mengsel, bij kamertemperatuur, gedurende 16 uur. Verwijder het teveel aan pyridine onder verminderde druk. Los de reactie ruwe in 3 milliliter methanol.

Breng de methanoloplossing over in een LH-20-kolom en elute op 0,5 mL/minuut. Verzamel de rode fractie en verwijder de methanol onder vacuüm. Spoel 30 mg droge amine gefunctionaliseerde nanodeeltjes twee maal met DMF en sonicate de nanodeeltjes in een 100 milliliter Erlenmeyer fles gedurende 30 minuten.

Bereid een oplossing voor van 200 milligram N-succinylferoxamine, 173 milligram Benzotriazool 1-yl-oxy-tris-fosfonium hexafluorfosfate BOP, 46 mg 1-hydroxybenzotriazool HOBt en 128,8 milligram N, N-diisopropylethylamine DIPEA, in 10 mL DMF, in een kolf van 50 milliliter ronde bodem. Hang de eerder gespoelde MNP@SiO2@NH2 in een 3 milliliter DMF, onder sonicatie in droge en zuurstofvrije omstandigheden. Gebruik argon sfeer.

Voeg, dropwise, mix A om B.Shake het uiteindelijke mengsel te mengen, met behulp van een orbitale shaker, bij kamertemperatuur 's nachts. Scheid de resulterende conjugaat van de suspensie met behulp van een magneet. Bacteriële test met Y.enterocolitica stammen om de isolatie te kwantificeren en van pathogene bacteriën met nanodeeltjes te vangen.

Bereid een suspensie van alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat in PBS op 1 mg/mL in steriele buizen. Bereid een cultuur van Y.entorocolitica in 5 mL van Luria Bertani, LB, bouillon 's nachts. Bereid een 5 mL ijzertekort Trypcase Sojabouillon, TSB, door de toevoeging van 50 microliters van 10 mM 2, 2-bipyridyl oplossing.

Inenting de 5 milliliter ijzertekort TSB bouillon met 50 microliter van de nachtelijke cultuur van Y.enterocolitica. Incubeer bij 37 graden Celsius met agitatie tot od600 van 0.5 tot 0.8 wordt bereikt. Neem een 100 microliter van de nachtelijke cultuur en verdun het in een buis met 900 microliter pbs om de eerste 1/10 verdunning te verkrijgen.

Bereid vervolgens een 1/100 verdunning van de eerste verdunning met dezelfde procedure om een concentratie van bacteriële cellen op 10 te krijgen tot de kracht van 6 kolonievormende eenheden per milliliter ongeveer. Voeg een 100 microliter nanodeeltjes suspensie en 1 mg/mL toe aan 1 milliliter van de verdunning van 1/100 bacteriën. Scheid de MNP bacteriën aggregaten, met behulp van een magneet, gooi, zorgvuldig, de supernatant.

Spoel de gescheiden nanodeeltjes twee keer af met 1 millimeter PBS met behulp van een vortex. Bereid vier opeenvolgende 1/10 verdunningen van de voormalige suspensie, tot een 10 tot het vermogen van min 4 verdunning. Plaat 10 microliter van elke verdunning op TS agar platen.

Fotografeer de plaat met een gel digitalisator in epi witte modus. Verwerk de afbeelding met behulp van de handige software om een plek te versterken om het aantal individuele kolonies te tellen. Om de vorming van de covalente band tussen de nanodeeltjes en de siderophore te bevestigen, gebruiken we FT-IR Raman spectroscopie om de synthese te monitoren, waarbij we observeren hoe nieuwe banden verschijnen in overeenstemming met een nieuwe functionele groep in elke stap.

TEM en SEM microscopie werden gebruikt om de morfologie en deeltjesgrootte te observeren. Thermogravimetrische analyse om het gewichtsverlies te meten als gevolg van de toevoeging van organisch materiaal. En XPS stelt ons in staat om de verschillende oxidatietoestanden van de atomen in het oppervlak te analyseren en de vorming van covalente bindingen te bevestigen.

Ten slotte gebruikten we alle tussenproducten op de laatste conjugaat om te testen zijn vermogen om bacteriën te vangen, om hun eigenschappen als biosensor vast te stellen. Dit protocol is ontworpen om te profiteren van de hoge biocompatibiliteit van magnetiet nanodeeltjes. De coating met silica verbetert de dispersie en beschermt de magnetische kern tegen afbraak in waterige media.

En ook een reactief oppervlak te functionaliseren met amine groepen die nodig zijn om covalent binden een zuur gemodificeerde siderophore door carbodiimide chemie. In dit geval N-succynilferoxamine. De conjugaat bacteriën vangen vermogen werd getest en als gevolg daarvan, een laag aantal kolonies werd gevonden, zonder significant verschil met de tussenproducten als gevolg van een specifieke interacties op omvangrijke effecten gepresenteerd in de PBS bacteriële suspensie.