Efficiënte differentiatie van postganglionic Sympathische neuronen met behulp van menselijke pluripotente stamcellen onder Feeder-vrije en chemisch gedefinieerde cultuurvoorwaarden

Dit protocol maakt de afleiding van sympathische neuronen uit menselijke pluripotente stamcellen mogelijk. Deze cellen zullen een wetenschapper in staat stellen om menselijke aandoeningen te bestuderen die het sympathische zenuwstelsel beïnvloeden. Deze techniek maakt de afleiding van sympathische neuronen in verdeelde feeder-vrije vergaderomstandigheden op een hoge schaalbare efficiëntie.

Het resulteert in elektrisch actieve neuronen in 20 dagen. Deze techniek kan worden toegepast op ziekten veroorzaakt door een disfunctioneel sympathisch zenuwstelsel, het kan ook worden gebruikt voor ziektemodellering, regeneratieve geneeskunde en screening van geneesmiddelen. Deze cellen kunnen in vitro worden gebruikt om elk weefsel binnen een co-cultuursysteem te innoveren, bijvoorbeeld voor de studie van cardiale weefselregulatie.

Wanneer de menselijke pluripotente stamcelcultuur 80 tot 90% samenvloeiing bereikt, moeten grote kolonies met gladde heldere randen worden waargenomen. Voor het splitsen, was de cultuur met PBS voor de behandeling van de cellen met vier milliliter van 0,25 molaire EDTA bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Spoel de plaat na twee minuten door met 10 milliliter E8-medium en breng de vrijstaande celsuspensie over naar een conische buis van 15 milliliter.

Breng vervolgens 500 microliter cellen over naar een 9,5 milliliter aliquot van vers E8-medium. En plaat de stamcellen op nieuwe vitronectin gecoate 100 millimeter schotels. Een dag voor differentiatie inductie, vacht het juiste aantal van zes goed platen met twee milliliter van kelder membraan matrix per put.

En bewaar de platen op vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, verwarm de platen op kamertemperatuur en was de klaar om de menselijke pluripotente stamcelcultuur twee keer te splitsen met verse PBS per wasbeurt. Behandel de cellen na de tweede wasbeurt gedurende 15 minuten met zeven milliliter EDTA in de celkweekbrocor voordat u de drijvende pluripotente stamcellen aspireert en de geoogste cellen overdraagt in een buis van 50 milliliter.

Voeg een gelijk volume van PBS aan de buis om de EDTA te verdunnen en het verzamelen van de cellen door centrifugatie. Resuspend de pellet in een milliliter van dag 01 differentiatie medium alvorens een passend volume van medium voor de boekhouding toe te voegen. Verdun de cellen tot een 1,25 keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter concentratie in milliliters van differentiatie medium per put.

Aspirate alle van de kelder membraan matrix oplossing van elke put van de eerder voorbereid tot zes goed plaat. Zaad dan twee milliliter cellen in elke put en plaats de plaat in de celcultuur incubator. De volgende ochtend, voeden de cellen met drie milliliter van dag 01 differentiatie medium per put.

Op dag twee van differentiatie, voeden de cellen met drie milliliters van dag twee tot 10 differentiatie medium per goed, dan voeden de cellen om de andere dag tot dag 10. Om de neurale kamcellen te aggregeren in sferoïden, was de cellen op dag 10 met PBS. En voeg twee milliliter dissociatiemedium toe aan elke put.

Breng na 20 minuten in de celkweek incubator de drijvende cellen over in een conische buis van 50 milliliter en breng het suspensievolume in de buis op 50 milliliter met verse PBS. Verzamel de cellen door centrifugatie. En resuspend de pellet in een voldoende volume van dag 10 tot 14 sferoïde medium voor het tellen.

Verdun de cellen na het tellen tot een vijf keer 10 tot de vijfde concentratie van cellen per 500 microliters met behulp van dag 10 tot 14 sferoïde medium. En plaat 500 microliter cellen in elke put van een ultra lage bevestiging 24-put plaat. Breng de cellen dan terug naar de celkweek incubator.

Om een minimale sferoïde cultuur te induceren, op dag 11 van de cultuur, voeden de neurale kam sferoïden met een extra 500 microliter van dag 10 tot 14 sferoïde medium per put. Kantel op dag 12 de plaat om de sferoïden aan één kant van de plaat op te hopen. En zorgvuldig aspirate zoveel mogelijk medium van elke put zonder aspirating sferoïden.

Voer vervolgens de sferoïden met een milliliter van dag 10 tot 14 sferoïde medium per put. Om een uitgebreide sferoïde cultuur te induceren, voer op dag 15 de sferoïden met 1,5 milliliter dag 10 tot 14 sferoïde medium aangevuld met 0,5 micromolar retinoïnezuur per put. Breng de sferoïden terug naar de celkweek incubator.

Voor sympathische neuron differentiatie, op dag 14 of 28, kantel de plaat om de sferoïden accumuleren aan de ene kant van de plaat en zorgvuldig aspirate zo veel medium mogelijk. Voer de cellen met een milliliter van sympathiek neuron medium. Om grote sferoïde aggregaten op te splitsen in kleinere sferoïden, voeg niet meer dan een milliliter medium per put toe en pipette de sferoïden vijf tot 10 keer voordat u splitst.

En verwijder de overtollige laminine fibronectin van eerder voorbereide 24-well platen. Splits de plaat een milliliter van sferoïden van elke put op de 24-putten sferoïde cultuurplaat tussen vier afzonderlijke putten van de nieuwe gecoate 24-well plaat. Voeg 250 microliters van verse sympathieke neuron medium aan elke put.

En plaats de plaat in de celcultuur incubator. De volgende ochtend, vervang het medium in elke put met een milliliter van sympathiek neuron medium aangevuld met 0,125 micromolar retinoïnezuur en de plaat terug te keren naar de celcultuur incubator. Na dag 35, voeden de neuronen door zorgvuldig te vervangen slechts de helft van het bestaande medium in elke put met vers medium.

Vóór differentiatie moeten de menselijke pluripotente stamcelkolonies rond zijn met glanzende, gladde randen en weinig tot geen differentiatie. De cellen drukken de neurale kuif marker Sox10 van dag vier tot en met 10. Neurale kuifcellen ontstaan in dichte verduisterde richels die zichtbaar zijn vanaf dag zes.

Deze ribbels drukken ook Sox10 uit. In het stadium van de neurale kamcellen correleert Sox10 met de celoppervlakmarkering CD49D, die kan worden gebruikt om de neurale kamcellen te sorteren. Positieve gesorteerde en ongesorteerde populaties produceerden neurale kamferoïden op een vergelijkbare manier.

Terwijl negatieve gesorteerde cellen niet goed aggregeren, niet produceren ronde, glad gezond uitziende sferoïden en sterven binnen drie tot vier dagen. Bovendien, wanneer neurale kam sferoïden worden vergeleken op dag 14, de kwantitatieve omgekeerde transcriptase PCR voor neurale kam en sympathische zenuwverergisters, significante verschillen tussen de gesorteerde en ongesorteerde cellen kunnen niet worden gedetecteerd. Op dag 20 of 35, de respectieve minimale of uitgebreide protocollen, neuroïden kunnen worden waargenomen groeien in een radiaal patroon van de bijgevoegde sferoïden.

Markers met betrekking tot noradrenaline synthese en transport worden uitgedrukt in dit stadium, evenals Hox6 door middel van negen stam neurale kuif genen. Elektrofysiologische opname detecteert ook neurale activiteit vanaf dag 20. Dergelijke activiteit kan worden verbeterd of onderdrukt door geneesmiddelen die zich richten op autoreceptoren van sympathische neuronen die de functionaliteit van gedifferentieerde neuronen aanpassen.

De menselijke voorstander zelf moet gezond zijn vanaf dag nul van differentiatie, anders zal het experiment waarschijnlijk mislukken. Farmacologische remmers of activators kunnen worden toegevoegd aan de neuronen om hun normale of pathologische gedrag te begrijpen. Deze methode opent een nieuwe weg voor het bestuderen van sympathieke biologie en pathologie, omdat het nu mogelijk is om biopten van sympathische neuronen gemakkelijk van mensen te verkrijgen.