Name: Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Leer markerloze gendeletie in Chlamydia trachomatis via floxed cassette allelic exchange mutagenesis. Deze methode maakt precieze genmanipulatie mogelijk zonder polaire effecten op naburige genen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de GGD van het National Institute of Health, NIAID (subsidies A1065530 en Al124649), aan K.A. Fields.

1. Ontwerp en montage van pSUmC-4.0 met homologie armen specifiek voor het gen van belang
<ol><li>Identificeer ~3 kb-regio's direct stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gen dat is gericht op verwijdering om te dienen als de homologiearmen van 5 ' en 3 voor homologe recombinatie (figuur 1).</li>
	<li>Ontwerp PCR primers tot 1) versterken de 3 kb 5 'homologie arm van chlamydia genomische DNA en 2) bevatten een 15-30 bp overhang specifiek voor pSUmC-4.0 wanneer verteerd op de Sall beperking enzym site. Zorg ervoor dat de primergebieden die overlappen met pSUmC-4.0 smelttemperaturen van 55 °C hebben en dat de smelttemperatuur voor de gehele primer <35 °C is.</li>
	<li>Ontwerp PCR primers tot 1) versterken de 3 kb 3 'homologie arm van chlamydia genomische DNA en 2) bevatten een 15-30 bp overhang specifiek voor pSUmC-4.0 wanneer verteerd op de SbfI beperking enzym site. Zorg ervoor dat de primergebieden die overlappen met pSUmC-4.0 smelttemperaturen van 55 °C hebben en dat de smelttemperatuur voor de gehele primer <35 °C is.</li>
	<li>Ontwerp PCR screening primers die het inbrengen van elke homologie arm in de pSUmC-4.0 vector zal versterken na een DNA-assemblage reactie16. Ontwerp deze primers naar anneal ~ 500 bp buiten de beperking sites om eenvoudige visualisatie van een PCR-product mogelijk te maken, zelfs als de invoeging niet succesvol was(figuur 1).</li>
	<li>Versterk de 3 kb 5' en 3' homologie armen uit vers geëxtraheerd chlamydia genomic DNA door PCR in een tot twee reacties om genoeg fragment voor latere DNA-assemblage opleveren. Volg het protocol van de fabrikant van DNA voor specifieke reactieopstelling en fietsomstandigheden.</li>
	<li>Controleer of beide PCR-producten de juiste grootte hebben en of de reacties geen vervuilende banden bevatten. Voer 5 μL van elke PCR-reactie uit op een 1% DNA-agarosegel.</li>
	<li>Zuiver en concentreer de PCR-fragmenten door fenol/chloroformextractie en ethanolneerslag.<ol>
<li>Bundel alle 3' PCR reacties samen in een 1,5 mL buis en breng tot een laatste volume van 200 μL met nuclease-vrije H2O. Herhaal dit proces voor de 5' PCR reacties.</li>
		<li>Voeg 200 μL fenol toe aan elke buis en vortex gedurende 30-60 s. Draai elke buis in een microcentrifuge op >21.000 x g voor 20 min bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Breng de waterige fase toplaag van elke buis in een nieuwe 1,5 mL buis, voeg een tiende van het volume van 3 M natriumacetaat aan elke buis, dan flick om te mengen.</li>
		<li>Voeg 3 volumes van 100% ethanol toe aan elke buis en flick om te mengen. Incubeer beide buizen bij -80 °C gedurende 20 min.</li>
		<li>Pellet het DNA door het draaien van elke buis op >21,000 x g voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant.</li>
		<li>Was de DNA-pellet met 100 μL 70% ethanol. Draai elke buis op >21.000 x g voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Was de DNA-pellet opnieuw met 100 μL 100% ethanol. Draai elke buis op >21.000 voor 5 min bij RT. Gooi de supernatant weg.</li>
		<li>Laat de pellet volledig luchtdrogen en zet het DNA voorzichtig op in 12 μL nuclease-vrije H2O door te vegen om te mengen.</li>
	</ol></li>
	<li>Digest 500 ng pSUmC-4.0 vector in een 20 μL reactie met 1 eenheid Sall en 1 eenheid SbfI volgens het protocol van de vervaardiging. Incubeer de reactie ongeveer 3 uur of 's nachts om volledige vertering van de vector te garanderen.</li>
	<li>Zuiver en concentreer de verteerde ruggengraat door fenol/chloroformextractie en ethanolneerslag zoals eerder beschreven (stap 1.7.1–1.7.9).</li>
	<li>Combineer de verteerde pSUmC-4.0 vector en zowel de 5' en 3' homologie arm PCR producten samen bij een verhouding van 0,01 pmol pSUmC-4.0 tot 0,09 pmol elke homologie arm. Monteer de fragmenten in een DNA-assemblagereactie volgens het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Transformeer 50 μL elektrocompetente E. coli met 1 μL van de DNA-assemblagereactie. Plaats de getransformeerde E. coli op LB agar platen met 100 μg/mL spectinomycine door 150 μL per plaat te verspreiden. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>De volgende dag, scherm kolonies voor groene en rode fluorescentie met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop. In totaal worden 5-30 kolonies per agarplaat verwacht.</li>
	<li>Pluk 5-10 kolonies om 4 mL LB bouillon in te enten aangevuld met 100 μg/mL spectinomycine. Incubeer culturen bij 37 °C 's nachts met schudden bij 250 rpm.</li>
	<li>Met behulp van de nachtelijke E. coli culturen, het uitvoeren van kleinschalige DNA-zuivering. Elute het DNA met 50 μL nuclease-vrije H2O.</li>
	<li>Bevestig het inbrengen van elke homologiearm in de pSUmC-4.0-vector met behulp van de PCR-screeningprimers (ontworpen in stap 1.4) om elke invoeging te versterken. Als DNA-assemblage succesvol is, moet een ~ 4 kb PCR product worden waargenomen in een 1% DNA agarose gel voor zowel de 5 'en 3 ' arm regio's. Een ~ 1 kb PCR product geeft een gebrek aan invoeging. OPMERKING: Als het inbrengen van de homologie armen niet succesvol is in een dubbele fragment montage reactie, voeren twee montage reacties om de 5 'arm dan 3 'arm, individueel. Vermeer de vector met alleen Sall voordat u met de 5'-arm wordt gemonteerd en verteer de vector met SbfI om de arm van 3 te monteren.</li>
	<li>Transformatie dam-/dcm- competente E. coli met 200 ng pSUmc-4.0 geassembleerd met beide homologie armen. Plaats de getransformeerde bacteriën op LB agarplaten met 100 μg/mL spectinomycine door 25 μL per plaat te verspreiden. Incubeer de platen 's nachts bij 37 °C. In totaal worden 20-200 kolonies verwacht.</li>
	<li>Screen de platen voor rode en groene fluorescerende kolonies zoals beschreven in stap 1.13.</li>
	<li>Zet een cultuur op voor een grootschalige DNA-zuivering door 100 mL LB-bouillon met 100 μg/mL spectinomycine met rode en groene kolonies in te enten. Incubeer de cultuur bij 37 °C 's nachts met schudden bij 250 rpm.</li>
	<li>Oogst de cultuur en zuiver het DNA met behulp van een grootschalige DNA-zuivering.<ol>
<li>Resuspend the purified plasmid DNA in 100 μL of NF-H2O. Een totale DNA-opbrengst van ten minste 2 μg/μL is ideaal voor C. trachomatis transformatie.</li>
		<li>Volg de 5' en 3' homologie arm regio's om een juiste montage in pSUmC-4.0 te garanderen alvorens C. trachomatiste transformeren .</li>
	</ol></li>
</ol>2. Transformatie van C. trachomatis met pSUmC 4.0 + Homologie Armen voor Genverwijdering door Allelic Exchange
<ol><li>Zaad McCoy cellen, muis fibroblasten standaard gebruikt voor het cultiveren van Chlamydia, in twee 6 put platen (1 x 106 cellen / goed) met groei media #1. Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO2 totdat de monolayer confluent is (ongeveer 24 uur).</li>
	<li>Voeg in een buis van 1,5 mL een volume c. trachomatis WT serovar L2 elementaire lichamen (EB's) toe die voldoende zijn om 12 putten van een 6-put plaat te infecteren op een MOI van 2. Pellet de EBs op >20.000 x g voor 30 min, gooi dan de supernatant.</li>
	<li>Start chlamydiatransformatie door de EB's voorzichtig op te schorten in 600 μL CaCl2-buffer en voeg vervolgens 24 μg pSUmC-4.0 + homologiearmen toe aan de buis. Meng de oplossing voorzichtig door te vegen. Incubeer de buis op RTfor 30 min en flick om elke 10 min te mengen.</li>
	<li>Voeg de transformatieoplossing toe aan 24 mL van Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) en meng door zachtjes te besmeifen. Breng 2 mL van het inoculum over op elke put van confluent McCoy-cellen in de 6 putplaten en infecteer door centrifugering bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C.</li>
	<li>Verwijder het inoculum en vervang door 2 mL/well RPMI groeimedia #2. Bebroed de platen bij 37 °C met 5% CO2.</li>
	<li>Na minimaal 7 uur, maar niet meer dan 12 uur, vervang de media door 2 mL/well van de selectiemedia #1. Zet de incubatie voort bij 37 °C gedurende 48 uur vanaf het moment van infectie.</li>
	<li>Oogst en doorleg de bacteriën op een verse monolaag van McCoy cellen.<ol>
<li>Met behulp van een celschraper, voorzichtig schraap de McCoy monolayer om de cellen te tillen in de media. Breng het materiaal van elke put in een 2 mL buis. Pellet het celmateriaal op >20.000 x g in een microcentrifuge gedurende 30 min bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder en gooi de supernatant weg. Brep de celpellet opnieuw in 1 mL HBSS door zachtjes te besmepelen.</li>
		<li>Pellet het celpuin op 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Breng de supernatant over op een frisse put van confluent McCoy cellen. Voeg een extra 1 mL HBSS aan elk goed voor een totaal volume van 2 mL/well.</li>
		<li>Infecteer door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C. Vervang het intmateriaal door selectiemedia #1 onmiddellijk na infectie.</li>
	</ol></li>
	<li>Doorgaan met het doorgeven van de bacteriën op een verse monolayer van McCoy cellen (sectie 2.7) om de 48 uur voor drie of meer passages totdat rode en groene insluitsels worden gedetecteerd met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop 24 uur post-infectie (24 hpi).</li>
	<li>Zodra rode en groene insluitsels worden gedetecteerd, blijven doorgeven van de monolayer (sectie 2.7) met behulp van selectiemedia #2.</li>
	<li>Doorgaan met het doorgeven van de monolayer totdat groen-only insluitsels worden gedetecteerd 24 hpi (passage #3 of hoger), wat het verlies van de pSUmC-4.0 vector en de integratie van de loxP selectie cassette in het genoom aangeeft.</li>
	<li>Kies een goed van groen-only insluitsels te verrijken door middel van passaging. Oogst en vries alle andere putten die ook groen-only insluitsels bevatten in sucrose-fosfaat-glutamaat buffer (SPG).<ol>
<li>Om groen-only insluitsels te verrijken, passage de monolayer uit een put van een 6 goed plaat zoals gedaan in stap 2.7, maar na pelleting de cel puin (stap 2.7.3), breng de supernatant in een conische met 12 mL hbss. Gebruik dit enoculum om twee 6 putplaten te infecteren door 2 mL per put toe te voegen en draai de platen vervolgens op 900 x g gedurende 60 min bij 20 °C.</li>
		<li>Om extra putten te bevriezen, oogst de monolayer als in stap 2.7.1, maar breg de pellets opnieuw op in 1 mL SPG in plaats van HBSS. Pellet de cel puin (stap 2.7.3) en breng de supernatant in een 1,5 mL cryotube. Bevries het materiaal op -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Na het verrijken van groen-only insluitsels aan een MOI van 0,5-1.0 (nog een tot twee passages na detectie), oogst de monolagen in SPG zoals beschreven in stap 2.11.2. Verkrijg aliquots van 50 μL in 1,5 mL buizen en vries op -80 °C.</li>
	<li>Titer groen-only bacteriën om opname te bepalen, vormen eenheden / μL, volgens een standaard titratie protocol17.</li>
</ol>3. Clonal Isolation of Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Containing the loxP Geflankeerd Selection Cassette by Limiting Dilution 3. Clonal Isolation of Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Containing the loxP Geflankeerd Selection Cassette by Limiting Dilution 3. Clonal Isolation of Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Containing the loxP Geflankeerd Selection Cassette by Limiting Dilution 3. Clonal
<ol><li>Zaai een 384 put weefsel kweekplaat met 50 μL McCoy cellen op ~ 2.000 cellen / goed in groeimedia #1. Incubeer bij 37 °C met 5 % CO2 voor ~24 uur of tot confluent.</li>
	<li>Verdun een aliquot van groen-only bacteriën in HBSS te bereiken ~ 50 EBs per 20 mL. Breng het verdunde intmateriaal over op een reservoirlade.<ol>
<li>Verwijder de media van de 384 putplaat door de hele plaat ondersteboven in een afvalcontainer te vegen. Voeg met behulp van een meerkanaals pipet 50 μL C. trachomatis inoculum toe aan elke put. Infecteer door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C. LET OP: Houd er rekening mee dat u niet zo hard veegt dat de monolayer loskomt. Als cellen over-confluent zijn, zullen ze gemakkelijker loskomen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder het inoculum door te vegen en te vervangen door 50 μL/well growth media #2. Incubeer platen bij 37 °C met 5% CO2. OPMERKING: In dit stadium is de integratie van de selectiecassette in het genoom stabiel, dus antibioticaselectie met spectinomycine is niet langer nodig.</li>
	<li>Na het uitbroeden van de plaat voor 5-12 dagen, identificeren individuele putten met groene fluorescerende insluitsels met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop of een hoog gehalte screening platform.</li>
	<li>Oogst putten met groen-only insluitsels door de monolayer te schrapen met een p-10 tip en de volledige inhoud van de put over te brengen in een buis met 2 mL HBSS. Meng en breng de 2 mL inoculum voorzichtig aan op een verse confluentMcCoy monolayer in een 6-putplaat voor infectie. OPMERKING: Bij het identificeren van individuele putten met insluitsels, zullen de insluitsels in een cluster te wijten aan uitbreiding van de eerste opname. Als een put meerdere clusters heeft, is het waarschijnlijk dat meer dan één EB in eerste instantie die put heeft geïnfecteerd. Deze putten mogen niet worden geoogst, en in sommige gevallen kunnen meerdere rondes van klonale isolatie door seriële verdunning noodzakelijk zijn.</li>
	<li>Infecteer de 6 putplaat door centrifugeren bij 900 x g gedurende 1 uur bij 20 °C. Vervang het inoculum door 2 mL/well growth media #2. Incubeer bij 37 °C met 5 % CO2 gedurende 48 uur.</li>
	<li>Herhaal de stappen 2.11–2.13 om de kloonpopulaties te verrijken, te bevriezen en te titeren.</li>
	<li>Bevestig de verwijdering van gerichte genen uit clonally geïsoleerde C. trachomatis met qPCR zoals eerder beschreven12.</li>
</ol>4. Transformatie van C. trachomatis FRAEM Mutant met pSU-Cre om verwijdering van loxP geflankeerde selectiecassette te initiëren
<ol><li>Herhaal het transformatieproces in een 6-bronplaat zoals eerder beschreven (stappen 2.1–2.8) met behulp van de clonally geïsoleerde C. trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vector en selectiemedia #3. OPMERKING: Een succesvolle transformatie wordt aangegeven door insluitsels die rood en groen fluorescerend zijn.<ol>
<li>Passage van de monolayer tot rood-only insluitsels worden gedetecteerd met behulp van een epifluorescentie omgekeerde microscoop, die het verlies van de selectie cassette (twee tot drie passages) aangeeft. Doorgaan met het doorgeven van de monolayer totdat rood-only insluitsels zijn verrijkt met een MOI van ~ 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Clonally isoleren van alleen rood-only insluitsels door verdunning te beperken in een 384-putplaat zoals eerder beschreven (stappen 3.1–3.8); gebruik echter selectiemedia #3 voor alle stappen.</li>
	<li>Verrijk de klonalpopulaties door te passeren tot een MOI van 0,1. Vervang sectiemedia eenmaal door groeimedia #2 om verlies van de pSU-Cre-vector (ongeveer drie tot vier passages) te initiëren.</li>
	<li>Clonally isoleren van niet-fluorescerende bacteriën (stappen 3.1–3.8); scan de plaat echter handmatig met een brightfield microscoop om insluitsels te detecteren. Verrijk en vries bacteriën (stap 2.11–2.12).</li>
	<li>Scherm voor de mutant stam met behulp van kwantitatieve real-time PCR, Western blotting, en hele genoom DNA Sequencing zoals eerder beschreven12.</li>
</ol>

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Incidence+and+Prevalence+of+Selected+Curable+Sexually+Transmitted+Infections%3A+2008%3A+World+Health+Organization%5BTitle%5D)+AND+%22Sexual+and+Reproductive+Health+Matters%22%5BJournal%5D)">Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization.</a> Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).</li>
<li>Stephen, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Paradigm+of+Chlamydial+Pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis.</a> Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).</li>
<li>Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Frontiers+in+Type+III+Secretion+Biology%3A+the+Chlamydia+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective.</a> Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).</li>
<li>Seth-Smith, H. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-evolution+of+genomes+and+plasmids+within+Chlamydia+trachomatis+and+the+emergence+in+Sweden+of+a+new+variant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain.</a> BMC Genomics. 10, 239(2009).</li>
<li>Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+obstacles+in+genetic+dissection+of+chlamydial+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).</li>
<li>McClure, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+obligate+Intracellular+bacteria%3A+progress%2C+challenges+and+paradigms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).</li>
<li>Rahnama, M., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Chlamydia%3A+current+approaches+and+impact+on+our+understanding+of+chlamydial+infection+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology.</a> Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).</li>
<li>Kari, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+targeted+Chlamydia+trachomatis+null+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).</li>
<li>LaBrie, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+Mutagenesis+in+Chlmaydia+trachomatis+Identifies+CT339+as+a+ComEC+Homolog+Important+for+DNA+Uptake+and+Later+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer.</a> mBio. 10 (4), 01343(2019).</li>
<li>Johnson, C. M., Fisher, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific%2C+insertional+inactivation+of+incA+in+Chlamydia+trachomatis+using+a+group+II+intron%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron.</a> PLoS One. 8, 83989(2013).</li>
<li>Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> mBio. 7, 01817(2016).</li>
<li>Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Floxed+cassette+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Enables+Markerless+Gene+Deletion+in+Chlamydia+trachomatis+and+can+Reverse+Cassette-Induced+Polar+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects.</a> Journal of Bacteriology. 200, 00479(2018).</li>
<li>Yarmolinsky, M., Hoess, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((THe+legacy+of+Nat+Sternberg%3A+the+genesis+of+Cre-lox+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Virology%22%5BJournal%5D)">THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology.</a> Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).</li>
<li>McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+Reveals+a+Role+for+Chlamydia+trachomatis+TmeA+in+Invasion+that+is+Independent+of+Host+AHNAK%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK.</a> Infection and Immunity. 85 (12), 00640(2017).</li>
<li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+Plasmid-Encoded+Pgp4+is+a+Transcriptional+Regulator+of+Virulence-Associated+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes.</a> Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).</li>
<li>Silayeva, O., Barnes, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gibson+Assembly+facilitates+bacterial+allelic+exchange+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis.</a> Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).</li>
<li>Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Metabolism+in+Chlamydia+trachomatis-Infected+Cells%3A+Directed+Trafficking+of+Golgi-Derived+Sphingolipids+to+the+Chlamydial+Inclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).</li>
<li>Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+phenotypic+characterization+of+in+vitro-generated+Chlamydia+trachomatis+recombinants%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants.</a> BMC Microbiology. 13, 142(2013).</li>
<li>Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rifampin-resistant+RNA+polymerase+mutants+of+Chlamydia+trachomatis+remain+susceptible+to+the+ansamycin+rifalazil%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil.</a> Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Het hier beschreven protocol voor de generatie markerless gendeleties in C. trachomatis door FLAEM maakt gerichte verwijdering van niet-essentiële genen mogelijk en elimineert door cassette-geïnduceerde polaire effecten. Het protocol is gebaseerd op een zorgvuldig ontwerp van 5' en 3' homologie armen ingevoegd in de pSUmC 4.0 zelfmoord vector, efficiënte transformatie van C. trachomatis, en zorgvuldige screening van geïsoleerde mutant stammen. Succesvolle genoomengineering via deze methode resulteert in...

Chlamydia trachomatis is de belangrijkste oorzaak van bacteriële seksueel overdraagbare aandoeningen en vormt een aanzienlijke last voor de menselijke gezondheid. Meer dan 100 miljoen mensen zijn elk jaar besmet met C. trachomatis1. Ongeveer 70% van de infecties bij vrouwen zijn asymptomatisch ondanks schadelijke reproductieve gezondheidseffecten, zoals bekkenontstekingsziekte, buitenbaarmoederlijke zwangerschap en/of onvruchtbaarheid. Ziekte sequela zijn direct gerelateerd aan immunopathologie geïnitieerd door C. trachomatis infectie2. Er moet nog een effectief vaccin worden ontwikkeld; daarom is het begrijpen van de functie van bacteriële virulentiefactoren en andere bacteriële genproducten een belangrijke en dringende onderzoeksvraag.
Als intracellulaire bacteriën zijn gastheercelinvasie, intracellulaire replicatie, het vrijkomen van nakomelingen en ontduiking van gastheerimmunologische reacties kritieke processen. C. trachomatis vormt een parasitophoreuze membraan gebonden vacuole, genoemd een opname, voor intracellulaire ontwikkeling. De totstandbrenging van de opneming en vele andere kritieke processen worden bereikt door afscheiding van effectorproteïnen via een type III secretiesysteem (T3SS)3. Het verduidelijken van de functies van deze uitgescheiden effectoren was beperkt voor vele jaren als gevolg van de genetische onmateerbaarheid van C. trachomatis. In tegenstelling tot E. colizijn veel klassieke kloontechnieken niet van toepassing op Chlamydia. Een paar grote beperkingen omvatten transformatie-efficiëntie, gebrek aan tegenselectie verslaggevers zoals SACB, en plasmid onderhoud. Terwijl E. coli plasmiden over het algemeen voor onbepaalde tijd kunnen worden gehandhaafd met een oorsprong van replicatie en passende selectieve druk, vereist C. trachomatis plasmids nog eens acht open leesframes(pgp1-8) voor onderhoud dat op de inheemse pL2 plasmid binnen de L2 serovar4wordt aangetroffen.
In de afgelopen jaren zijn er meerdere genetische instrumenten gegenereerd die geschikt zijn voor chlamydia's unieke biologie, maar er zijn nog steeds beperkingen5,6,7. Chemische mutagenese door ethylmethaansulfonaat (EMS) behandeling kan brengen verkeerde mutaties, of (minder vaak) kan resulteren in nucleotide overgangen de invoering van een voortijdige stop codon om een onzin mutatie opleveren8. Transposon inbrengen is efficiënt voor genverstoring, maar de huidige technologie in Chlamydia onderzoek is moeizaam en tijdrovend9. Zowel EMS-behandeling als transposon mutagenesetechnieken genereren willekeurige mutaties en vereisen rigoureuze screeningsmethoden om gemuteerde stammen te isoleren. Een methode om genen te verstoren door het inbrengen van groep II-intronen (bijvoorbeeld TargeTron) maakt gerichte mutagenese mogelijk; deze methode wordt echter beperkt door efficiëntie en de invoegplaats wordt niet altijd goed voorspeld10.
Fluorescentie-gerapporteerde allelic exchange mutagenesis (FRAEM) is een strategie die wordt gebruikt voor gerichte genverwijdering in combinatie met het inbrengen van een selectiecassette die antibioticaresistentie en een fluorescentiereporter11biedt. Toch wordt FRAEM gecompliceerd door het potentieel van door cassettegeïnduceerde polaire effecten op downstream genen, vooral wanneer het zich richt op genen binnen polycistronic operonen. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM) is een nieuwe genetische benadering ontwikkeld om de cassette-geïnduceerde polaire effecten eerder waargenomen met de FRAEM selectie cassette12te verlichten . FLAEM maakt gebruik van Cre-loxP genoombewerking om de selectiecassette te verwijderen en de expressie van downstreamgenen te herstellen. De selectiecassette met antibioticaresistentie en groen fluorescerend eiwit (GFP) is opnieuw ontworpen met flankerende loxP-sites. Deze loxP-sites kunnen opnieuw combineren in aanwezigheid van Cre recombinase en resulteren in excisie van de cassette uit het genoom13. Deze strategie is aangetoond dat het verlichten van cassette geïnduceerde polaire effecten bij het richten tmeA voor schrapping12,14.
Zowel FRAEM en FLAEM methoden maken gebruik van dezelfde zelfmoord vector, pSUmC 4.0, die voorwaardelijk kan worden gehandhaafd door middel van onuitleidbare expressie van pgp6. Uiting van pgp6 is eerder aangetoond dat het noodzakelijk is voor plasmidretentie en wordt daarom ingezet om plasmid onderhoud te controleren11,15. Wanneer C. trachomatis wordt geteeld in de media aangevuld met anhydrous tetracycline (aTc) om pgp6 expressie te induceren, wordt de vector gehandhaafd. Bij afwezigheid van aTc gaat de vector verloren. Gerichte genverwijdering wordt bereikt door allelic uitwisseling van het gen voor de selectiecassette. De 3 kb-regio's direct stroomopwaarts en stroomafwaarts van het beoogde gen dienen als homologiearmen voor recombinatie. Deze armen worden gekloond in de pSUmC 4.0 vector flankeren de selectie cassette. Succesvolle C. trachomatis transformatie en recombinatie gebeurtenissen worden waargenomen door middel van fluorescentie rapportage. Expressie van mCherry op de vector backbone en gfp binnen de selectie cassette opbrengst rode en groene fluorescerende insluitsels. Zodra aTc uit kweekmedia is verwijderd, wijzen green-only insluitsels op succesvolle recombinatiegebeurtenissen met het verlies van de zelfmoordvector en de integratie van de selectiecassette in het bacteriële genoom.
FLAEM vertegenwoordigt een uitbreiding van FRAEM via de daaropvolgende transformatie van een Cre recombinase-uitdrukkende vector, pSU-Cre, in de nieuw gecreëerde mutantenstam. Cre recombinase vergemakkelijkt de combinatie tussen loxP-sites en excisie van de selectiecassette. Recombinatie gebeurtenissen worden aangegeven via fluorescentie rapportage. De pSU-Cre vector codeert mCherry; succesvolle transformatie wordt dus aangegeven door toevoeging van rode fluorescentie aan gfp-uitdrukkendeinsluitsels. De teelt bij afwezigheid van selectieve druk voor de cassette resulteert in cre-gemedieerde recombinatie op de loxP-locaties, en het verlies van de cassette wordt aangegeven door rood-only insluitsels. Net als bij pSUmC-4.0 wordt onuitleidbare expressie van pgp6 gebruikt om pSU-Cre voorwaardelijk te onderhouden. Zodra aTc en antibiotica selectie zijn verwijderd, de plasmid is genezen, en de resulterende markerless deletie stam is niet fluorescerend. Deze methode pakt het probleem van cassette-geïnduceerde polaire effecten.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>KSE Scientific</td><td>BMK-A1705</td><td>Molecular Biology Grade</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>ACROS Organics</td><td>233131000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 Buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate</td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>Geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>dam-/dcm- Competent E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C2925H</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>Steriele gefilterde celcultuur getest</td></tr><tr><td>Glutamic acid</td><td>Sigma</td><td>G8415-100G</td><td>L-Glutamic acid</td></tr><tr><td>Growth Media #1</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 media aangevuld met 10 % (vol/vol) hitte-inactiveerd foetaal bovien serum (FBS).</td></tr><tr><td>Growth Media #2</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 media aangevuld met 10 % (vol/vol) hitte-inactiveerd foetaal bovien serum (FBS) en 1 &micro;g/mL cycloheximide</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A38402-02</td><td></td></tr><tr><td>McCoy Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1696</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T1010S</td><td>Kleinschalige DNA-zuivering</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139-250G</td><td>Natriumfosfaatmonobasisch</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td>Natriumfosfaatdibasisch</td></tr><tr><td>NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells</td><td>New England BioLabs</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E5520S</td><td>Gibson Assembly Kit</td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Sigma</td><td>P3032-10MU</td><td>Bioreagens geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>Grootschalige DNA-zuivering</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0515</td><td>Fragment PCR Polymerase</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (1x)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>Bevat 2mM L-glutamine</td></tr><tr><td>Sall-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Sbfl-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3642S</td><td></td></tr><tr><td>Selection Media #1</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &micro;g/mL cycloheximide, 500 &micro;g/mL spectinomycin, en 50 ng/mL anhydrous tetracycline opgelost in DMSO</td></tr><tr><td>Selection Media #2</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &micro;g/mL cycloheximide, 500 &micro;g/mL spectinomycin</td></tr><tr><td>Selection Media #3</td><td></td><td></td><td>RPMI 10 % FBS, 1 &micro;g/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, en 0,6 &micro;g/mL penicillin</td></tr><tr><td>Sodium Acetate Buffer Solution</td><td>Sigma</td><td>S7899-100ML</td><td>3M</td></tr><tr><td>SOC Outgrowth Medium</td><td>New England BioLabs</td><td>B9020SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61820</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S1888-1KG</td><td>Bioreagens geschikt voor celcultuur</td></tr><tr><td>Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG)</td><td></td><td></td><td>37,5g sucrose, 1,25 g Na2HPO4, 0,18 g NaH2PO4, 0,36 glutamin zuur voor 500 ml weefselkweek kwaliteit water</td></tr><tr><td>Tris</td><td>AMRESCO</td><td>0497-5KG</td><td>Ultrazuivere graad</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0,25%</td></tr><tr><td>Water</td><td>Sigma</td><td>W3500-500ML</td><td>Steriele gefilterde, BioReagens, geschikt voor celcultuur</td></tr></tbody></table>

markerless gene deletion door floxed cassette allelic exchange mutagenesis in chlamydia trachomatis

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is een obligate intracellulaire ziekteverwekker die historisch moeilijk te manipuleren is geweest. Definitieve vooruitgang bij het verduidelijken van de mechanismen die C. trachomatis gebruiken om een bevoorrechte intracellulaire niche te creëren en te behouden, is beperkt door een gebrek aan genetische hulpmiddelen. Gelukkig zijn er onlangs verschillende nieuwe ontwikkelingen in genetische manipulatie technieken. Een daarvan is de ontwikkeling van fluorescentie-gerapporteerde allelic uitwisseling mutagenese (FRAEM). Deze methode maakt gerichte genverwijdering mogelijk in combinatie met het inbrengen van een selectiecassette die antibioticaresistentie en groen fluorescerend eiwit (GFP) inkaartbrengt. Vertrouwen op deze strategie kan ingewikkeld zijn bij het richten van genen binnen polycistronic operons vanwege het potentieel van polaire effecten op downstream genen. Floxed cassette allelic exchange mutagenesis (FLAEM), het protocol waarvoor hier wordt beschreven, werd ontwikkeld om cassette-geïnduceerde polaire effecten te verlichten. FLAEM maakt gebruik van Cre-loxP genoombewerking om de selectiecassette te verwijderen na gerichte verwijdering door allelic exchange. De resulterende stammen bevatten markerless gendeleties van een of meer coderingssequenties. Deze techniek vergemakkelijkt de directe beoordeling van de genfunctie en breidt het repertoire van instrumenten voor genetische manipulatie in C. trachomatis uit.

De methode voor markerless gendeletie in C. trachomatis met FLAEM is afhankelijk van zorgvuldige klonen en transformatietechnieken. Succesvolle allelic recombinatie is een essentiële eerste stap en vereist de identificatie en inbrengen van homologie armen in de pSUmC-4.0 klonen vector (Figuur 1). Een essentiële tweede stap voor markerless gendeletie is het verwijderen van de fluorescentiereporter en antibioticaselectiecassette door Cre-lox genoombewerking, vertegenwoordigd in <stron...

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

Floxed cassette allelic uitwisseling mutagenesis is een belangrijke methode, omdat gen schrapping is een waardevol instrument dat kan worden gebruikt om de functie van genproducten te begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gerichte genverwijdering mogelijk maakt zonder polaire effecten toe te brengen op downstream genen. Identificeer ongeveer drie kilobasisregio's direct stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gen dat is gericht op verwijdering om te dienen als de vijf eerste en drie eerste homologiearmen voor homologe recombinatie en primers toe te wijzen zoals aangegeven in het tekstprotocol.Versterk de drie kilobasis vijf prime en drie prime homologie armen uit vers geëxtraheerd chlamydial genomic DNA door PCR in een of twee reacties om genoeg fragment opleveren voor latere DNA assemblage. Na het zuiveren en concentreren van de PCR-fragmenten zoals beschreven in het tekstprotocol, verteerbaar 500 nanogram pSUmC-4.0 vector in een 20 microliter reactie met een eenheid van cel een en een eenheid van SBF een volgens het protocol van de fabrikant. Combineer de verteerde en gezuiverde pSUmC-4.0 vector en zowel de vijf prime en drie prime homologie arm PCR

markerless-gene-deletion-floxed-cassette-allelic-exchange-mutagenesis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

We beschrijven een methode om genetische analyse in Chlamydia op basis van chemische mutagenese en hele genoom sequencing uitvoeren. Bovendien wordt een systeem voor het uitwisselen van DNA in geïnfecteerde cellen beschreven die kunnen worden gebruikt voor genetische mapping. Deze methode kan breed toepasbaar microbiële systemen ontbreekt transformatiesystemen en moleculair genetische hulpmiddelen.

Forward Genetische technieken in<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Bacteriële pathogenen scheiden eiwitten in de gastheer die gericht zijn op cruciale biologische processen. Het identificeren van de gastheer trajecten doelwit van bacteriële Effector eiwitten is de sleutel tot het aanpakken van moleculaire pathogenese. Hier wordt een methode beschreven met behulp van een gemodificeerde gist suppressor en toxiciteits scherm om gastheer trajecten te verhelderen die zijn gericht op toxische bacteriële Effector eiwitten.

Identificatie van Hosttrajecten die zijn getarget door bacteriële Effector eiwitten met behulp van gist toxiciteit en suppressor schermen

Dit protocol maakt gebruik van fluorescerende promotor-verslaggevers, live-cel microscopie, en individuele opname extractie in een gerichte voorwaartse genetische benadering te identificeren en isoleren van ontwikkelingsmutanten van Chlamydia trachomatis.

Live-Cell Forward Genetische Benadering voor identificeren en isoleren developmental mutanten in Chlamydia trachomatis

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Oligonucleotiden kunnen worden gebruikt om de website speciaal een single nucleotide van getransfecteerde doelwitgenen vervanger in...

Transfectie en mutagenese van Target genen in cellen Mosquito door Locked Nucleic Acid-gemodificeerde oligonucleotiden

Beenmergtransplantatie geeft een manier om het genotype van het beenmerg afgeleide cellen. Als het gen van interesse tot expressie wordt gebracht in zowel van beenmerg afgeleide cellen en niet-beenmerg afgeleide cellen kan beenmergtransplantatie wijzigen beenmerg afgeleide cellen een ander genotype zonder de niet-beenmerg cellen genotype.

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

Leer markerloze gendeletie in Chlamydia trachomatis via floxed cassette allelic exchange mutagenesis. Deze methode maakt precieze genmanipulatie mogelijk zonder polaire effecten op naburige genen.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Meer video's verkennen