Monitoring van eIF4F-assemblage door eIF4E-eIF4G-interactie in levende cellen te meten

De regulatie van de eIF4F-complexsignalering is geassocieerd met verhoogde translatie van mRNA-subset die betrokken zijn bij kankerproliferatie en overleven. Hier beschrijven we een eIF4E-eIF4G cel-gebaseerde eiwit-eiwit interactie-assays die ons in staat stellen om drug-geïnduceerde verstoring in de eIF4F-complex integriteit in levende cellen te beoordelen. Er is een groeiende interesse in de ontwikkeling van modaliteiten die efficiënt doelwitten op het eiwit-eiwit grensvlak targeten.

We veronderstelden dat onze eIF4E-eIF4G PPI-assays zullen helpen bij het bevorderen van deze strategieën en deze valideren. Deze assay zal een optimale primaire methode bieden voor het optimaliseren van eIF4E-eIF4G remmers. Het correct zaaien van cellen en het uitvoeren van de overdrachtstransfectie zijn de meest uitdagende aspecten van dit product, omdat deze rechtstreeks kunnen weerspiegelen op de onderdrukking van het PPI-rapportagesysteem.

Na het ontdooien en tellen van cellen, zaai 6 welborden met HEK 293 cellen, met behulp van 2 milliliter standaard groeimedium per wel. Op de ochtend van dag 2, voor elke geplande transfectie, verdun 9 microliters van liposome-gebaseerde oplossing in een buisje met 125 microliters gereduceerd serum medium zonder fenol rood. Terwijl de verdunde liposomen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten incuberen, bereid de mastermix van DNA voor door 3 microgram van elk plasmide te verdunnen in 125 microliters gereduceerd serum medium voor elke transfectiebuis.

Voeg 12 microliters enhancer reagentia toe aan de DNA mastermix 2, meng goed. Voeg deze mengsel onmiddellijk toe aan elke buis van verdunde liposomen in een verhouding van 1 op 1. Na het incuberen van dit DNA-lipidecomplex gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, voeg het complex toe aan elke wel van de 6 welborden.

Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur. Op de ochtend van dag 3, spoel elke wel met 1 milliliter PBS en voeg 0,3 milliliter trypsine toe. Incubeer de platen bij 37 graden Celsius gedurende 5 minuten.

Na incubatie, neutraliseer de trypsine door 2 milliliter toe te voegen aan elke wel van het gereduceerd serum medium zonder fenol rood. Breng de getransfecteerde cellen over in een 15 milliliter buisje. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 290x G gedurende 5 minuten.

Zuig het medium af en re-suspendeer de celpellet in 2 milliliter van het gereduceerd serum medium. Zaai de getransfecteerde HEK 293 cellen in 96-wel opaque platen, met een dichtheid van 30.000 cellen per wel in 90 microliters medium. Om 3 technische replica's te verkrijgen voor 3 verschillende verbindingen binnen hetzelfde experiment, zaai 60 wellen.

Sluit de wellen aan de randen uit. Onmiddellijk na het zaaien van de getransfecteerde cellen, voeg 10 microliters van een 10%DMSO verbindingsoplossing toe aan elke wel. Bereid 1 millimolar verbindings stockoplossingen door elke verbinding van belang op te lossen in 100%DMSO.

Om 3 replica's voor elke verbindingstitratiever te hebben, gebruik 8 microliters van de 1 millimolar verbindings stockoplossing. Voer een tweevoudige seriële verdunning van elke stockverbindingsoplossing uit in 8 wellen van een 96-wel PCR plaat door 4 microliters van de 1 millimolar stock in 4 microliters van 100%DMSO te pipetten voor elk titratiepunt. Gooi de overtollige 4 microliters weg na het laatste punt van de tweevoudige seriële verdunning.

Voeg 36 microliters HPLC-kwaliteit steriel water toe aan elke buis om 40 microliters van 10x verbindings seriële verdunningsoplossingen in 10%DMSO voor te bereiden. Bereid ook een controle. 10%DMS alleen stockoplossing in HPLC-kwaliteit steriel water.

Voeg 10 microliters van 10x werkoplossingen toe aan de cellen in de 96-wel opaque plaat om de beoogde eindconcentratie te verkrijgen, met een resterende DMSO-concentratie van 1%. Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide gedurende 3 uur. Na 3 uur, begin met het voorbereiden van het luciferase substraatreagens door 1 volume substraat te combineren met 19 volumes van het verdunningsreagens. Gebruik een multi-kanaals pipette om onmiddellijk 25 microliters van het substraatreagens toe te voegen aan elke wel van de 96 wel plaat met de cellen.

Schud de plaat op een orbitale shaker bij 350 RPM, gedurende 50 minuten bij kamertemperatuur. Om luminescentie te beoordelen, plaats de plaat op een plaatlezer. Zet de spiegellezer op luminescentie en de emissiefilter op 455.

Gebruik een meethoogte van 6,5 millimeter met een meettijd van 1 seconde. Om celviabiliteit te beoordelen, voeg 33 microliters van het viabiliteitsassay reagens toe aan elke wel. Na 15 minuten bij kamertemperatuur, beoordeel luminescentie met de plaatlezer door de spiegellezer op luminescentie te zetten en de emissiefilter op 600.

Gebruik een meethoogte van 6,5 millimeter en een meettijd van 1 seconde. Gebruik de gegevens van de plaatlezer om de IC 50 waarde van elke verbinding te bepalen, door de gegevens curve-fitting aan de 4-parameter fittingcurvevergelijking te passen zoals beschreven in het manuscript. HEK 293 cellen werden getransfecteerd met het eIF4E-eIF4G complementatiesysteem, en vervolgens geïncubeerd en behandeld met mTOR remmers.

Toen luminescentie werd beoordeeld 4 uur na behandeling, produceerden zowel PP242 als rapamycine een dosisafhankelijke remming van het signaal. Noch PP242 noch rapamycine produceerden een significante afname in celviabiliteit, wat aangeeft dat de afname in luminescentie in het eIF4E-eIF4G complementatiesysteem niet te wijten is aan niet-specifieke celdood, maar eerder aan verstoring van de EIF4E-4G interactie. Western blot-analyse, volgend op m7GTP pull down experiment, toonde aan dat 4EBP1 gemedie