Name: Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: Leer ongerichte metabolomics-analyse van tarwekorrel met vloeibare chromatografie-massaspectrometrie. Deze methode detecteert een breder scala aan metabolieten en verbetert het begrip van biochemische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het West-Australische Premier's Agriculture and Food Fellowship-programma (Department of Jobs, Tourism, Science and Innovation, Government of Western Australia) en de Premier's Fellow, professor Simon Cook (Centre for Digitale landbouw, Curtin University en Murdoch University). Veldproeven en graanmonsterverzameling werden ondersteund door de regering van het Western Australia's Royalties for Regions-programma. We erkennen Grantley Stainer en Robert French voor hun bijdragen aan veldproeven. De door NCRIS gefinancierde Bioplatforms Australië wordt erkend voor de financiering van apparatuur.

<ol><li>Hall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+metabolomics%3A+the+missing+link+between+genotype+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype.</a> Plant Cell. 14, (2002).</li>
<li>Beleggia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genotype%2C+environment+and+genotype-by-environment+interaction+on+metabolite+profiling+in+durum+wheat+%28Triticum+durum+Desf.%29+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cereal+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain.</a> Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).</li>
<li>Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+Key+Metabolomic+Alterations+in+Wheat+Embryos+Derived+from+Freshly+Harvested+and+Water-Imbibed+Seeds+of+Two+Wheat+Cultivars+with+Contrasting+Dormancy+Status%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).</li>
<li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li>
<li>Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+and+Quantification+of+Wheat+Seed+Oxidized+Lipids+by+High-Resolution+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS.</a> Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).</li>
<li>Blazenovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+Annotation+of+All+Mass+Spectra+in+Untargeted+Metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).</li>
<li>Castro-Perez, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+LC-MSE+Lipidomic+Analysis+using+a+Shotgun+Approach+and+Its+Application+to+Biomarker+Detection+and+Identification+in+Osteoarthritis+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients.</a> Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).</li>
<li>Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pragmatic+and+readily+implemented+quality+control+strategy+for+HPLC-MS+and+GC-MS-based+metabonomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis.</a> Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).</li>
<li>Dunn, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+large-scale+metabolic+profiling+of+serum+and+plasma+using+gas+chromatography+and+liquid+chromatography+coupled+to+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).</li>
<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
<li>Chong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboAnalyst+4.0%3A+towards+more+transparent+and+integrative+metabolomics+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).</li>
<li>Du Fall, L. A., Solomon, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+necrotrophic+effector+SnToxA+induces+the+synthesis+of+a+novel+phytoalexin+in+wheat%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat.</a> New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).</li>
<li>Bowne, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+Responses+of+Leaf+Tissues+from+Wheat+Cultivars+of+Differing+Drought+Tolerance+at+the+Metabolite+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant%22%5BJournal%5D)">Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level.</a> Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).</li>
<li>Wang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sharing+and+community+curation+of+mass+spectrometry+data+with+Global+Natural+Products+Social+Molecular+Networking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking.</a> Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).</li>
<li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een LC-MS-gebaseerde ongerichte metabolomics methode voor de analyse van tarwekorrel. De methode combineert vier acquisitiemodi (omgekeerde fase en lipide-ontvankelijke omgekeerde fase met positieve en negatieve ionisatie) in twee modi door een derde mobiele fase in het omgekeerde faseverloop te introduceren. De gecombineerde aanpak leverde ongeveer 500 biologisch relevante kenmerken per ionpolariteit op, waarvan ongeveer de helft aanzienlijk verschilt in intensiteit tussen tarwevariëteiten. Significa...

Inzicht in de interacties tussen genen, omgeving en management praktijken in de landbouw zou kunnen toestaan dat een nauwkeurigere voorspelling en beheer van de opbrengst en kwaliteit van het product. Plantenmetabolieten worden beïnvloed door factoren zoals het genoom, het milieu (klimaat, regenval, enz.), en in een landbouwomgeving, de manier waarop gewassen worden beheerd (d.w.z. toepassing van kunstmest, fungicide enz.). In tegenstelling tot het genoom wordt het metabolome beïnvloed door al deze factoren en daarom biedt metabolomics gegevens een biochemische vingerafdruk van deze interacties op een bepaald moment. Er zijn meestal een van de twee doelen voor een metabolomics-gebaseerde studie: ten eerste om een dieper begrip van de biochemie van het organisme te bereiken en te helpen verklaren het mechanisme van de reactie op verstoring (abiotische of biotische stress) in relatie tot de fysiologie; en ten tweede, om biomarkers te associëren met de verstoring in studie. In beide gevallen is het resultaat van het hebben van deze kennis een nauwkeurigere managementstrategie om het doel van een betere rendementsgrootte en kwaliteit te bereiken.
De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden1 van kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen bevatten. Momenteel kunnen geen metabolomics platforms (voornamelijk massaspectrometrie en nucleaire magnetische resonantie spectroscopie) het hele metabolome in één analyse vastleggen. Het ontwikkelen van dergelijke technieken (monstervoorbereiding, metabolietextractie en -analyse), die een zo groot mogelijke dekking van het metabolome binnen één enkele analytische run bieden, is een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers. Eerdere ongerichte metabolomics analyses van tarwekorrel hebben gegevens gecombineerd van meerdere chromatografische scheidingen en acquisitiepolariteiten en/of instrumentatie voor een grotere metabolomedekking. Hiervoor moeten echter monsters voor elke modaliteit afzonderlijk worden bereid en verworven. Beleggia et al.2 hebben bijvoorbeeld een gederivatiseerde steekproef voorbereid voor de GC-MS-analyse van polaire analyten naast de GC-MS-analyse van de niet-polaire analyten. Das et al.3 gebruikten zowel GC- als LC-MS-methoden om de dekking in hun analyses te verbeteren; Deze aanpak vereist echter over het algemeen afzonderlijke monsterpreparaten zoals hierboven beschreven, evenals twee onafhankelijke analytische platforms. Eerdere analyses van tarwekorrel met GC-MS2,3,4 en LC-MS3,5 platforms hebben 50 tot 412 (55 geïdentificeerde) functies opgeleverd voor GC-MS, 409 voor gecombineerde GC-MS en LC-MS en enkele duizenden voor een LC-MS lipidomics analyse5. Door ten minste twee modi te combineren in één analyse, kan een uitgebreide metabolomedekking worden gehandhaafd, waardoor de rijkdom van biologische interpretatie toeneemt en tegelijkertijd besparingen in zowel tijd als kosten worden bespaard.
Om de efficiënte scheiding van een breed scala van lipidesoorten door omgekeerde-fase chromatografie mogelijk te maken, gebruiken moderne lipidomics methodologieën vaak een hoog percentage isopropanol in het elutionoplosmiddel6, die beakeerbaarheid aan lipideklassen verstrekt die anders door de chromatografie zouden kunnen worden onopgelost. Voor een efficiënte lipidescheiding is de beginmobiele fase ook veel hoger in organische samenstelling7 dan de typische omgekeerde fasechromatografische methoden, die andere klassen van moleculen overwegen. De hoge organische samenstelling aan het begin van de gradiënt maakt deze methoden minder geschikt voor vele andere klassen van moleculen. Met name, omgekeerde fase vloeibare chromatografie maakt gebruik van een binaire oplosmiddel gradiënt, te beginnen met een meestal waterige samenstelling en toenemende organische inhoud als de elutie sterkte van de chromatografie wordt verhoogd. Hiertoe probeerden we de twee benaderingen te combineren om de scheiding van zowel lipide- als niet-lipideklassen van metabolieten binnen één analyse te bereiken.
Hier presenteren we een chromatografische methode die een derde mobiele fase gebruikt en een gecombineerde traditionele omgekeerde fase en lipidomics-geschikte chromatografiemethode mogelijk maakt met behulp van een enkele monstervoorbereiding en één analytische kolom. We hebben veel van de kwaliteitscontrolemaatregelen en gegevensfilterstappen genomen die eerder zijn geïmplementeerd in voornamelijk klinische metabolomics studies. Deze benaderingen zijn nuttig bij het bepalen van robuuste kenmerken met een hoge technische reproduceerbaarheid en biologische relevantie en sluiten degenen uit die niet aan deze criteria voldoen. We beschrijven bijvoorbeeld herhaalde analyse van het samengevoegde QC-monster8, QC-correctie9,gegevensfiltering9,10 en toerekening van ontbrekende functies11.

<table><tbody><tr><td>13C6-sorbitol</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-aminoanthracene</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS grade</td></tr><tr><td>Ammonium formate</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 mL</td><td>>99.995%</td></tr><tr><td>Analyst TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>Version 1.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro software</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Data processing software used for step 7.2. Version 5.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro XD sortware</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>Data processing software used for step 7.5. Version 1.4</td></tr><tr><td>Balance</td><td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d6-transcinnamic acid</td><td>Isotec</td><td>513962-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 mL</td><td>99%</td></tr><tr><td>Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus)</td><td>Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit)</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids)</td><td></td></tr><tr><td>Installation kit for Sciex TripleToF</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA464-4</td><td>Optima LC-MS grade</td></tr><tr><td>Laboratory blender</td><td>Waring commercial</td><td></td><td>Model HGBTWTS3</td></tr><tr><td>Leucine-enkephalin</td><td>Waters</td><td>p/n 700008842</td><td>Tuning solution</td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td><td></td><td>Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS grade</td></tr><tr><td>Miconazole</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge (Eppendorf 5415R)</td><td>Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>5426 No. 0021716</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (2 mL)</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View software</td><td>Sciex</td><td></td><td>Version 1.2 (64-bit)</td></tr><tr><td>Pipette tips (200 uL, 100 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes (200 uL, 1000 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic centrifuge tubes (15 mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NUN339650</td><td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Nonlinear Dynamics</td><td></td><td>Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit)</td></tr><tr><td>Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium formate</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Tissue lyser/homogeniser</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>Serial 0001620</td></tr><tr><td>Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.)</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS grade</td></tr><tr><td>Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column</td><td>Waters</td><td>p/n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Inzicht in de interacties tussen genen, het milieu en het beheer in de landbouwpraktijk zou een nauwkeurigere voorspelling en beheer van productopbrengst en kwaliteit mogelijk kunnen maken. Metabolomics gegevens biedt een uitlezing van deze interacties op een bepaald moment in de tijd en is informatief van de biochemische status van een organisme. Verder kunnen individuele metabolieten of panelen van metabolieten worden gebruikt als nauwkeurige biomarkers voor opbrengst- en kwaliteitsvoorspelling en -beheer. De plant metabolome wordt voorspeld dat duizenden kleine moleculen met gevarieerde fysischchemische eigenschappen die een kans voor een biochemisch inzicht in fysiologische eigenschappen en biomarker ontdekking bieden bevatten. Om dit te benutten, een belangrijk doel voor metabolomics onderzoekers is om zo veel van de fysischchemische diversiteit mogelijk vast te leggen binnen een enkele analyse. Hier presenteren we een vloeibare chromatografie-massaspectrometrie gebaseerde ongerichte metabolomics methode voor de analyse van veldgekweekte tarwekorrel. De methode maakt gebruik van de vloeibare chromatograaf quaternary oplosmiddel manager om een derde mobiele fase te introduceren en combineert een traditionele omgekeerde fase gradiënt met een lipide-vatbaar gradiënt. Korrelvoorbereiding, metabolietextractie, instrumentele analyse en workflows voor gegevensverwerking worden in detail beschreven. Goede massanauwkeurigheid en signaalreproduceerbaarheid werden waargenomen en de methode leverde ongeveer 500 biologisch relevante kenmerken per ionisatiemodus op. Verder werden aanzienlijk verschillende metaboliet- en lipidefunctiesignalen tussen tarwevariëteiten bepaald.

De plant metabolome wordt beïnvloed door een combinatie van zijn genoom en omgeving, en bovendien in een agrarische omgeving, het gewas management regime. We tonen aan dat genetische verschillen tussen tarwerassen kunnen worden waargenomen op het metabolietniveau, hier, met meer dan 500 gemeten verbindingen die significant verschillende concentraties tussen rassen in het graan alleen laten zien. Goede massanauwkeurigheid (<10 ppm fout) en signaalreproduceerbaarheid (<20% RSD) van interne ...

Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

De metaboliet wordt beïnvloed door factoren zoals de genoomomgeving en managementpraktijken. Inzicht in de interacties tussen deze factoren kan een nauwkeurigere voorspelling en beheer van de opbrengst en kwaliteit van een product mogelijk maken. Door het opnemen van een derde mobiele fase, in plaats van de traditionele twee, deze techniek maakt de scheiding en detectie van een breder scala van metabolieten.Metabolomics kunnen worden toegepast op elk gebied van de biologie. Ten eerste, om een dieper begrip van de biochemie van een organisme te bereiken, en hun reactie op abiotische of biotische stress in relatie tot de fysiologie te verklaren. Ten tweede, om biomarkers te associëren met de verstoring in studie.Aangezien isopropylalcohol een viskeuze oplosmiddel is, moet het worden ingevoerd bij een laag flare-percentage en voldoende evenwichtstijd die wordt gebruikt voordat de samenstelling wordt verhoogd tot 98%Deze stappen zullen voorkomen dat het chromatische grafische systeem overdruk geeft, een fout terugkeert of de analytische kolom mogelijk beschadigt. Om te beginnen met de voorbereiding van de korrels, gebruik maken van een laboratorium blender om het graan te malen. Voer de blender op hoge snelheid gedurende 20 seconden en herhaal.Haal de blenderpot van de basis. Tik op de zijkant van de blenderpot om een grof gemalen graan aan het oppervlak van het monster te brengen. De grofgrondse korrel kan worden weggegooid of opgeslagen.Breng de fijngrondse korrel van de blender naar een twee milliliter plastic microcentrifuge buis. Op dezelfde dag als de extractie, bereid het extractie oplosmiddel, zoals beschreven in het manuscript. Weeg vervolgens 200 milligram fijngrondkorrel in een twee milliliter microcentrifugebuis.Voeg 500 microliter extractieoplosmiddel toe aan het graan in de buis. Bereid bovendien een blanco door 500 microliters extractieoplosmiddel toe te voegen aan een lege buis. Met behulp van een homogenisator, ingesteld op 6, 500 RPM, meng het oplosmiddel en graan gedurende 20 seconden.Herhaal dit vervolgens nog eens 20 seconden. Dan, centrifuge de buis op vier graden Celsius en 16, 100 keer G, gedurende vijf minuten. Breng de supernatant over op een plastic buis van twee milliliter en bewaar de pellet.Herhaal het extractieproces op de pellet twee keer. Combineer de drie supernatants, die een totaal extractvolume van ongeveer 1.5 milliliter opleveren en door hetkolenen mengen. Om een samengevoegd monster te maken van alle graanextracten die voor kwaliteitscontrole moeten worden gebruikt, breng je 55 microliter van elk graanextract over naar een buis en vortex van twee milliliter.Breng vervolgens 50 microliter aliquots van dit gepoolde monster over naar glazen flesjes. Breng een 50-microliter aliquot van elk graan monster extract naar glas flacons. Zoals beschreven in het geschreven manuscript, bereid de oplossingen die nodig zullen zijn voor vloeibare chromatografie massaspectrometrie.Bereid op de dag van de LCMS-analyse 100 milliliter van 5%acetonitril, met 200 nanogram per milliliter leucine enkephalin. Voeg 950 microliter van deze oplossing toe aan de glazen flacon met de 50 microliter aliquot van het graanextract. Meng de inhoud in de flacon door vortexing.Stel eerst de instrumenten op zoals beschreven in het manuscript en de gebruikershandleiding van de fabrikant. Vervolgens zuiver en spoel het LC-vloeistofsysteem met lcms-grade oplosmiddelen, waaronder mobiele fase- en wasmiddelen. Het LC-systeem wordt volgens lc-methode gecontabiliseerd, zodat de druk van de kolom is gestabiliseerd.Stel de tabel met instrumentenreeks in. Injecteer natrium formate aan het begin van de monsterreeks om de kalibratie van het instrument te controleren. Analyseer eerst oplosmiddel- en preparatieve blanks, gevolgd door gepoolde kwaliteitscontrolemonsters voor systeemconditionering en vervolgens de gerandomiseerde steekproeflijst.Voer de monsters van de kwaliteitscontrole regelmatig uit, als technische replica's. Voer twee kwaliteitscontrolemonsters uit aan het einde van de reeks. Controleer tijdens het uitvoeren van de reeks de gegevenskwaliteit, inclusief zowel de interne standaardmassanauwkeurigheid als de reproductiebaarheid van het signaal.Om de reproduceerbaarheid van het signaal te controleren, moet visuele inspectie van bedekte spectra volstaan. Vier interne normen werden opgenomen in de oplossing die werd gebruikt om de graanextracten te bereiden. Tijdens LCMS werden een goede massanauwkeurigheid en enkele reproduceerbaarheid van interne standaarden waargenomen voor zowel positieve als negatieve ionisatiemodi.Op basis van analyse van blanco's, 421 signalen in de negatieve modus en 835 signalen in de positieve modus werden beoordeeld als artefacten. Deze signalen waren aanwezig in blanco's bij intensiteiten gelijk aan of groter dan 5% van de gemiddelde enkele intensiteit in graanmonsters. Na het verwijderen van de artefacten en verdere filtering van de gegevens, de negatieve modus terug 483 functies en de positieve modus terug 523 functies.Ongeveer 250 kenmerken waren biologisch relevant en verschilden aanzienlijk in intensiteit tussen tarwevariëteiten. De kwaliteitscontrole maatregelen, zoals de opname van preparative blanks, interne normen, en gepoolde monsters, zijn belangrijk om te onthouden in dit protocol.

untargeted-liquid-chromatography-mass-spectrometry-based-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

We presenteren een protocol voor de identificatie en kwantificering van belangrijke klassen van in water oplosbare metabolieten in de gist Saccharomyces cerevisiae. De beschreven methode is veelzijdig, robuust en gevoelig. Het maakt de scheiding van structurele isomeren en stereo-somerische vormen van in water oplosbare metabolieten van elkaar mogelijk.

Kwantitatieve metabolomica van Saccharomyces Cerevisiae met behulp van vloeistofchromatografie in combinatie met tandemmassaspectrometrie

De protocollen beschrijven hoogwaardige vloeistofchromatografiemethoden gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor het bestuderen van metabole reacties in complexe op lysaat gebaseerde celvrije systemen.

Vloeistofchromatografie gekoppeld aan brekingsindex of massaspectrometrische detectie voor metabolietprofilering in op lysaat gebaseerde celvrije systemen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van de absorptie, translocatie en distributie van imidacloprid in tarwe onder hydroponische omstandigheden met behulp van vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS-MS). De resultaten toonden aan dat imidacloprid kan worden opgenomen door tarwe, en imidacloprid werd gedetecteerd in zowel de tarwewortels als de bladeren.

Bepaling van de absorptie, translocatie en distributie van imidacloprid in tarwe

Er wordt een methode voor metabolomicse analyse van gerst gepresenteerd. De methode omvat fractievorming en derivatisatie van metabolieten en analyse daarvan door gaschromatografie/massaspectrometrie (GC/MS). Metabolomicse analyse kan worden gebruikt om het effect van gemengde teelten en droogtestress op het graan te bepalen.

Metabolomicse analyse van gerst door middel van gaschromatografie/massaspectrometrie

Dit protocol presenteert een gevalideerde massaspectrometriemethode voor vloeistofchromatografie-ionenmobiliteit en hoge resolutie om de aanwezigheid van moederkorenalkaloïden in voedsel te bepalen in overeenstemming met de onlangs uitgebrachte Verordening (EU) 2023/915 van de Commissie.

Detectie van gereguleerde moederkorenalkaloïden in voedselmatrices door middel van vloeistofchromatografie-ingesloten ionenmobiliteitsspectrometrie-time-of-flight massaspectrometrie

Hier beschrijven we een protocol voor extractie van metabolieten van Staphylococcus aureus en de daaropvolgende analyse via vloeistofchromatografie en massaspectrometrie.

Een vloeistofchromatografie tandem-massaspectrometrie gebaseerde benadering voor metabolietanalyse van<em&gt; Staphylococcus aureus</em

We beschrijven een protocol te identificeren van RNA-bindende proteÃ¯nen en kaart van de regio's hun RNA-bindende in levende cellen met behulp van UV-gemedieerde photocrosslinking en massaspectrometrie.

Bereiding van de monsters voor de massa spectrometrie gebaseerde identificatie van RNA-bindende regio 's

Leer ongerichte metabolomics-analyse van tarwekorrel met vloeibare chromatografie-massaspectrometrie. Deze methode detecteert een breder scala aan metabolieten en verbetert het begrip van biochemische processen.

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Meer video's verkennen