Name: Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Ontdek een methode voor weefselregeneratie in muizenhuid door gecontroleerde fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten met rood licht. Deze techniek stimuleert haargroei en wondgenezing via niet-dodelijke ROS-niveaus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk is ondersteund door subsidies van Ministerio de Economía y Competitividad (RTC-2014-2626-1 aan JE) en Instituto de Salud Carlos III (PI15/01458 aan JE) van Spanje. EC is ondersteund door de Atracción de Talento Investigador grant 2017-T2/BMD-5766 (Comunidad de Madrid en UAM).

Alle procedures voor het houden van muizen en experimenten moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale, nationale, internationale wetgeving en richtlijnen voor dierproeven.
1. Inductie van haargroei, brandwondinductie en identificatie van langdurige BrdU LRC's in het epitheel van de staarthuid
OPMERKING: Gebruik 10 dagen of 7 weken oude C57BL/6-muizen, bij voorkeur nestgenoten, voor de hieronder beschreven experimentele ontwerpen. In alle experimentele procedures zullen dieren worden verdoofd door 3% isofluraaninhalatie of geëuthanaseerd door cervicale dislocatie zoals aangegeven.
<ol><li>Inductie van haargroei in de rughuid van muizen in de tweede telogene (rust) fase (ongeveer dag 50 postnataal)<ol><li>Verdoof muizen met inhalatie van 3% isofluraan. Bevestig volledige diepe anesthesie door het ontbreken van een pedaalreflex (stevige teenknijp). Scheer twee onafhankelijke naast elkaar gelegen delen van de rughuid in elke afzonderlijke muis met behulp van tondeuses en ontharingscrème (materiaaltabel). Gebruik de linkerkant voor de controle en de rechterkant voor de behandeling. OPMERKING: Controleer of de onderliggende rughuid na het scheren roze is en niet grijs/zwart, een indicator van melanogenese en toegang tot de anagene (groei)fase in deze muizenstam.</li>
		<li>Was grondig met PBS om alle crèmeresten te verwijderen en ga over tot inductie van voorbijgaande in situ productie van niet-dodelijke ROS-niveaus zoals beschreven in rubriek 2.1.</li>
		<li>Registreer de haarfollikelgroei door dagelijkse acquisitie van beelden met hoge resolutie van de controle- en behandelde rughuidgebieden in elk dier (bijvoorbeeld met behulp van een HD-camera gekoppeld aan een 5−20x binoculaire lens).</li>
	</ol></li>
	<li>Inductie van 2e graads brandwonden in de rughuid van muizen in de tweedetelogene (rust) fase (ongeveer dag 50 postnataal)<ol><li>Verdoof muizen. Scheer het hele achterste huidgebied in elke afzonderlijke muis met tondeuses en ontharingscrème en was grondig met PBS om alle crèmeresten te verwijderen. OPMERKING: Dien in situ subcutane injecties van lidocaïne 0,5% (2 mg/ml) toe in steriele zoutoplossing, niet meer dan 7 mg/ml, vlak voor de verbrandingsprocedure.</li>
		<li>Verwarm een messing staaf (1 cm in doorsnede) voor op 95 °C door onder te dompelen in kokend water en breng vervolgens gedurende 5 s aan op het centrale deel van het rughuidoppervlak van elke muis.</li>
		<li>Net na het ontstaan van brandwonden, injecteer de dieren intraperitoneaal met 1 ml fysiologische oplossing (0,9% NaCl) op een elektrische deken om uitdroging te voorkomen. Laat de dieren gedurende 24 uur herstellen en ga over tot inductie van voorbijgaande in situ productie van niet-dodelijke ROS-niveaus zoals beschreven in rubriek 2.3.</li>
		<li>Registreer de progressie van brandwonden door dagelijkse acquisitie van beelden met hoge resolutie van de controle- en behandelde rughuidgebieden bij elk dier (bijvoorbeeld met behulp van een HD-camera gekoppeld aan een 5−20x binoculaire lens).</li>
	</ol></li>
	<li>Generatie en identificatie van langdurige BrdU LRC's in het epitheel van de staarthuid<ol><li>Injecteer 10/14 dagen oude nestgenoten intraperitoneaal (geen anesthesie) eenmaal per dag gedurende 4 opeenvolgende dagen met 50 mg/kg lichaamsgewicht BrdU opgelost in PBS. Laat muizen na de etiketteringsfase 50-60 dagen vóór elke behandeling groeien. OPMERKING: Gebruik een nieuwe naald voor elke injectie.</li>
		<li>Ga te werk zoals beschreven in rubriek 2.3 voor de inductie van voorbijgaande in situ niet-dodelijke ROS-productie in de staarthuid op verschillende tijdstippen vóór de bereiding van weefsels.</li>
		<li>Om hele mounts van staartepidermis voor te bereiden, euthanaseer muizen door cervicale dislocatie en knip de staarten met een chirurgische schaar.<ol><li>Gebruik een scalpel om een rechte longitudinale incisie langs de staart te maken en pel de hele huid als een enkel stuk van de ruggengraat. Incubeer de geschilde huid in 5 mM EDTA in PBS in 5 ml tubes gedurende 4 uur bij 37 °C en scheid zorgvuldig intacte vellen opperhuid van de dermis met behulp van een tang.</li>
			<li>Fixeer het weefsel in 4% formaldehyde in PBS gedurende ten minste 72 uur bij kamertemperatuur (RT) en ga verder met BrdU-detectie met behulp van geschikte antilichamen.</li>
			<li>Gebruik fluorescentie/confocale microscopie om LRC's in elke experimentele toestand te identificeren en te kwantificeren, inclusief lichtcontroles en fotodynamische behandelingen op verschillende tijdstippen vóór de bereiding van weefsel wholemounts, zoals eerder in detail beschreven19,20. OPMERKING: Vaste epidermale vellen mogen gedurende maximaal drie maanden worden bewaard in PBS met 0,02% natriumazide bij 4 °C. Vaste epidermale vellen kunnen worden gebruikt voor immunolocalisatie van vereiste eiwitten volgens standaard histologische sectieprocedures.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Inductie van voorbijgaande productie van niet-dodelijke ROS-niveaus in de huid van muizen
OPMERKING: Om voorbijgaande productie van niet-dodelijke ROS-niveaus in de huid van muizen te induceren, zal een fotodynamische behandeling met behulp van een voorloper van de endogene fotosensitizer PpIX, in dit geval methyl-aminolevulinaat (mALA), en rood licht worden gebruikt.
<ol><li>Om de transiënte ROS-productie voor de inductie van haargroei in de rughuid in te schakelen, bereidt u de dieren voor zoals aangegeven in rubriek 1.1.<ol><li>Breng ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème (materiaaltabel) op het rechtergebied, waarbij de linkerkant als interne controle wordt gebruikt om interindividuele verschillen te voorkomen. Incubeer gedurende 2,5 uur in het donker, was de overtollige crème grondig af met PBS. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld. OPMERKING: De productie van PpIX in de rughuid moet in situ worden getest door de rode fluorescentie onder excitatie van blauw licht (407 nm).</li>
		<li>Verdoof de dieren.</li>
		<li>Bestraal de hele rughuid met een adequate roodlichtbron (Table of Materials) voor een totale dosis van 2,5−4 J/cm2. Houd muizen op een elektrische deken totdat ze volledig zijn hersteld en ga verder zoals beschreven in stap 1.1.3. OPMERKING: De bestralingssterkte moet worden aangepast door de afstand tussen de lichtbron en het weefsel te manipuleren en te meten met behulp van een vermogensenergiemeter (materiaaltabel). Het experiment wordt als voltooid beschouwd wanneer volledige haargroei wordt waargenomen in een van de onafhankelijke geschoren regio's van elk dier. De hele procedure omvat slechts één fotobehandeling.</li>
	</ol></li>
	<li>Om voorbijgaande ROS-productie in te schakelen voor genezingsverbetering van2e graads brandwonden, bereidt u de dieren voor zoals aangegeven in rubriek 1.2.<ol><li>Breng ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème langs het verbrande oppervlak, dat ongeveer 4 mm aangrenzend weefsel omvat. Incubeer gedurende 2,5 uur in het donker, was de overtollige crème grondig af met PBS. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld.</li>
		<li>Verdoof de dieren.</li>
		<li>Bestraal de hele rughuid met een adequate roodlichtbron voor een totale dosis van 2,5−4 J/cm2. Houd de muizen op een elektrische deken totdat ze volledig hersteld zijn en ga verder zoals beschreven in stap 1.2.4. OPMERKING: De experimentele procedure voor elk dier wordt als voltooid beschouwd wanneer volledige brandwondengenezing wordt waargenomen. De hele procedure omvat slechts één fotobehandeling.</li>
	</ol></li>
	<li>Om voorbijgaande ROS-productie in de staarthuid in te schakelen, bereidt u muizen voor zoals aangegeven in rubriek 1.3, brengt u ~ 25 mg mALA aan in de vorm van actuele crème langs het hele dorsale weefselgebied en gaat u te werk zoals beschreven in rubriek 2.1 voor de rughuid. Voer fotobehandelingen en corresponderende lichtcontroles uit 24 uur, 48 uur of 72 uur vóór euthanasie bij dieren en verdere extractie van de hele staarthuid. OPMERKING: Test in alle experimentele ontwerpen de ROS-afhankelijkheid van het proces met behulp van antioxidant ROS-aaseters (bijv. Dagelijkse inenting van 100 mg / kg lichaamsgewicht N-acetyl-cysteïne door intraperitoneale injectie van een 20 mg / ml oplossing in PBS, pH 7,2, beginnend 5 dagen vóór mALA-behandelingen of, als alternatief, twee doses van 100 mg / ml ascorbinezuur in 50% ethanol, 30 min, topisch aangebracht op de huid in het tijdsinterval tussen de mALA-behandelingen en roodlichtbestraling).</li>
</ol>3. ROS-detectie in de huid
<ol><li>Ex vivo evaluatie van ROS-productie in staarthuid na fotodynamische behandeling met hydro-ethidine OPMERKING: Hydro-ethidine is een niet-fluorescerend molecuul dat specifiek reageert met ROS om fluorescerende kleurstof 2-hydroxyethidium (hET) te produceren.<ol><li>Incubeer hele staarthuiden, verkregen zoals beschreven in punt 1.3.3, gedurende 3 uur bij 37 °C in 5 mM EDTA in PBS-oplossing (controlemonsters) of aanvullend met 2 mM mALA (fotodynamische behandelingsmonsters).</li>
		<li>Voeg in alle gevallen hydro-ethidine toe tot een eindconcentratie van 3,2 μM uit een voorraad van 25 mg/ml in dimethylsulfoxide (DMSO) en incubeer gedurende 1 uur in het donker bij RT.</li>
		<li>Strek de staarthuidmonsters met vingertoppen over een glazen oppervlak en bestraal met 636 nm rood licht bij een fluence van 10 J/cm2 .</li>
		<li>Ga onmiddellijk verder met het scheiden van de epidermis van de dermis en het fixeren van de epidermale vellen zoals beschreven in punt 1.3.3.</li>
		<li>Evalueer de hET-rode emissie onder een fluorescentie / confocale microscoop met behulp van groen opwindend licht, leg beelden van hoge kwaliteit vast en ga verder met verdere analyse. OPMERKING: Gebruik hET-kleuring van weefselmonsters bij afwezigheid van fotodynamische behandeling als een negatieve controle voor hET-autoxidatie.</li>
	</ol></li>
	<li>In vivo detectie van ROS-productie in de rughuid na inductie van haargroei en brandwondengenezing gevolgd door fotodynamische behandeling OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van 2′,7′-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DHF-DA), een celdoordringende niet-fluorescerende verbinding die, na splitsing door intracellulaire esterase-enzymen, specifiek reageert met ROS die de 2′,7′-dichloorfluoresceïne (DCF) fluorescerende kleurstof geeft.<ol><li>Gebruik dieren die zijn voorbereid op inductie van haargroei (rubriek 1.1) of brandwondgenezing (rubriek 1.2). Vlak voor topische mALA-crèmebehandelingen (zie rubrieken 2.1 en 2.2), doseer topisch 100 μL van 1 mg / ml in 50% ethanol van DHF-DA op alle doelcontrole/ behandelde huidgebieden, laat de huid het materiaal volledig absorberen en ga verder met het aanbrengen van actuele mALA-crème.</li>
		<li>Incubeer behandelde dieren gedurende 4 uur in het donker, was de actuele mALA-crème grondig van de huid met PBS en doseer een tweede dosis van 100 μL DHF-DA-oplossing op de huid. Om de diepte van de anesthesie te bevestigen, controleert u de dieren elke 10 minuten totdat ze volledig zijn hersteld.</li>
		<li>Incubeer behandelde dieren gedurende 50 minuten in het donker, verdoof en bestraal de hele rughuid met een vloeiendheid variërend van 2,5 tot 4 J / cm2 van 636 nm rood licht met behulp van een LED-lamp.</li>
		<li>Evalueer onmiddellijk na de bestraling de ROS-niveaus die in de huid worden gegenereerd met behulp van een in vivo beeldvormingssysteem (materiaaltabel). Stel de filterbox in voor 445−490 nm excitatie en 515−575 nm emissie, leg beelden van hoge kwaliteit vast en ga verder met verdere analyse. OPMERKING: Gebruik DHF-DA-kleuring van weefselmonsters in afwezigheid van fotodynamische behandeling als negatieve controle voor DHF-DA-autoxidatie.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Blázquez-Castro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+1O2+optical+excitation%3A+A+tool+for+redox+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct 1O2 optical excitation: A tool for redox biology.</a> Redox Biology. 13, 39-59 (2017).</li>
<li>Valko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+antioxidants+in+normal+physiological+functions+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39 (1), 44-84 (2007).</li>
<li>Sena, L. A., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+Roles+of+Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species.</a> Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).</li>
<li>Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+Destroyers+or+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: Destroyers or messengers.</a> Biochemical Pharmacology. 77 (8), 1303-1315 (2009).</li>
<li>Brieger, K., Schiavone, S., Miller, J., Krause, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+from+health+to+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Swiss+Medical+Weekly%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: from health to disease.</a> Swiss Medical Weekly. 142, 13659(2012).</li>
<li>Speakman, J. R., Selman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-radical+damage+theory%3A+Accumulating+evidence+against+a+simple+link+of+oxidative+stress+to+ageing+and+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">The free-radical damage theory: Accumulating evidence against a simple link of oxidative stress to ageing and lifespan.</a> BioEssays. 33 (4), 255-259 (2011).</li>
<li>Fernandez, V., Videla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+aspects+of+cellular+antioxidant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Biochemical aspects of cellular antioxidant systems.</a> Biological Research. 29 (2), 177-182 (1996).</li>
<li>Matés, J. M., Sánchez-Jiménez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+enzymes+and+their+implications+in+pathophysiologic+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Antioxidant enzymes and their implications in pathophysiologic processes.</a> Frontiers in Bioscience. 4, 339-345 (1999).</li>
<li>Bedard, K., Krause, K. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+Family+of+ROS-Generating+NADPH+Oxidases%3A+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The NOX Family of ROS-Generating NADPH Oxidases: Physiology and Pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 87 (1), 245-313 (2007).</li>
<li>Leto, T. L., Morand, S., Hurt, D., Ueyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+and+Regulation+of+Reactive+Oxygen+Species+Generation+by+Nox+Family+NADPH+Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Targeting and Regulation of Reactive Oxygen Species Generation by Nox Family NADPH Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 11 (10), 2607-2619 (2009).</li>
<li>Hernández-García, D., Wood, C. D., Castro-Obregón, S., Covarrubias, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species%3A+A+radical+role+in+development%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species: A radical role in development.</a> Free Radical Biology and Medicine. 49 (2), 130-143 (2010).</li>
<li>Covarrubias, L., Hernández-García, D., Schnabel, D., Salas-Vidal, E., Castro-Obregón, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+reactive+oxygen+species+during+animal+development%3A+Passive+or+active%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of reactive oxygen species during animal development: Passive or active.</a> Developmental Biology. 320 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Timme-Laragy, A. R., Hahn, M. E., Hansen, J. M., Rastogi, A., Roy, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+stress+and+signaling+during+vertebrate+embryonic+development%3A+Regulation+and+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Redox stress and signaling during vertebrate embryonic development: Regulation and responses.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 80, 17-28 (2018).</li>
<li>Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+prime+Drosophila+haematopoietic+progenitors+for+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species prime Drosophila haematopoietic progenitors for differentiation.</a> Nature. 461 (7263), 537-541 (2009).</li>
<li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amputation-induced+reactive+oxygen+species+are+required+for+successful+Xenopus+tadpole+tail+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Amputation-induced reactive oxygen species are required for successful Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Nature Cell Biology. 15 (2), 222-228 (2013).</li>
<li>Le Belle, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferative+Neural+Stem+Cells+Have+High+Endogenous+ROS+Levels+that+Regulate+Self-Renewal+and+Neurogenesis+in+a+PI3K%2FAkt-Dependant+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Proliferative Neural Stem Cells Have High Endogenous ROS Levels that Regulate Self-Renewal and Neurogenesis in a PI3K/Akt-Dependant Manner.</a> Cell Stem Cell. 8 (1), 59-71 (2011).</li>
<li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((production+and+NF-%CE%BAB+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li>
<li>Hamanaka, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Reactive+Oxygen+Species+Promote+Epidermal+Differentiation+and+Hair+Follicle+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Reactive Oxygen Species Promote Epidermal Differentiation and Hair Follicle Development.</a> Science Signaling. 6 (261), 8(2013).</li>
<li>Carrasco, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+ROS+Production+in+situ+Transiently+Activates+Cell+Proliferation+in+Mouse+Skin+and+in+the+hair+Follicle+Stem+Cell+Niche+Promoting+Hair+Growth+and+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of ROS Production in situ Transiently Activates Cell Proliferation in Mouse Skin and in the hair Follicle Stem Cell Niche Promoting Hair Growth and Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 135 (11), 1-12 (2015).</li>
<li>Carrasco, E., Blázquez-Castro, A., Calvo, M. I., Juarranz, Á, Espada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+on+a+transient+endogenous+ROS+production+in+mammalian+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Switching on a transient endogenous ROS production in mammalian cells and tissues.</a> Methods. , 109(2016).</li>
<li>Braun, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+stem+cell+proliferation+and+lineage+commitment%3A+visualisation+of+label-retaining+cells+in+wholemounts+of+mouse+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis.</a> Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).</li>
<li>Hsu, Y. -C., Li, L., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+interactions+between+skin+stem+cells+and+their+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Emerging interactions between skin stem cells and their niches.</a> Nature Medicine. 20 (8), 847-856 (2014).</li>
<li>Plikus, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+stem+cells+and+implications+for+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial stem cells and implications for wound repair.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 23 (9), 946-953 (2012).</li>
</ol>

Alle commerciële toepassingen van de procedures beschreven in dit werk zijn beschermd door een CSIC-UAM patent (EP2932967A1) geschreven door EC, MIC en JE en in licentie gegeven aan Derma Innovate SL voor commerciële exploitatie. JE en JJM hebben een adviserende functie in Derma Innovate SL.

Hier presenteren we een methodologie die een voorbijgaande activering van endogene ROS-productie in vivo in muizenhuid met fysiologische effecten mogelijk maakt. De methodologie is gebaseerd op een fotodynamische procedure om een gecontroleerde en lokale stimulatie van de endogene fotosensitizer PpIX te induceren (figuur 1B). Deze experimentele benadering is een interessant hulpmiddel om ROS-biologie te bestuderen in in vivo experimentele systemen die een aanzienlijke vooruitgang betekenen t...

Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn het resultaat van de chemische reductie van moleculaire zuurstof tot water, en omvatten singletzuurstof, superoxide-anion, waterstofperoxide en het hydroxylradicaal 1,2,3. ROS hebben een zeer korte levensduur vanwege hun extreem chemisch reactieve karakter. In aerobe organismen wordt ROS incidenteel gevormd in de cellen als een belangrijk lekkend bijproduct van aerobe ademhaling (elektronentransportketen) in de mitochondriën. Voorbijgaande accumulatie van hoge niveaus van ROS in de cel resulteert in een oxidatieve stressconditie die de onomkeerbare inactivatie van eiwitten, lipiden en suikers en de introductie van mutaties in het DNA-molecuul 2,3,4,5 kan veroorzaken. De geleidelijke accumulatie van oxidatieve schade in cellen, weefsels en hele organismen neemt gestaag toe met de tijd en is in verband gebracht met de inductie van celdoodprogramma's, verschillende pathologieën en het verouderingsproces 2,3,4,6.
Aërobe organismen hebben gestaag efficiënte moleculaire mechanismen ontwikkeld om overtollige ROS-accumulatie in cellen en weefsels aan te pakken. Deze mechanismen omvatten leden van de superoxide dismutase (SOD) eiwitfamilie, die superoxide radicale desmutatie in moleculaire zuurstof en waterstofperoxide katalyseren, evenals verschillende catalasen en peroxidasen die de antioxidantpool (glutathion, NADPH, peroxiredoxine, thioredoxine 7,8) gebruiken om de daaropvolgende omzetting van waterstofperoxide in water en moleculaire zuurstof te katalyseren.
Verschillende rapporten ondersteunen echter de rol van ROS als belangrijke componenten van moleculaire circuits die kritieke celfuncties reguleren, waaronder proliferatie, differentiatie en mobiliteit 2,3,4. Dit concept wordt verder ondersteund door de initiële identificatie en karakterisering van speciale ROS-producerende mechanismen in aërobe organismen, waaronder lipoxygenases cyclooxygenases en NADPH-oxidasen 9,10. In die zin vertoont ROS een actieve rol tijdens de ontwikkeling van gewervelde embryo's 11,12,13 en sleutelrollen voor deze moleculen in de regulatie van specifieke in vivo fysiologische functies zijn gemeld in verschillende experimentele systemen, waaronder het differentiatieprogramma van hematopoietische voorlopers in Drosophila14, genezingsinductie bij zebravissen of staartregeneratie bij Xenopus-kikkervisjes 15. Bij zoogdieren is ROS betrokken geweest bij het zelfvernieuwings-/differentiatiepotentieel van neurale stamcellen in een neurosfeermodel16 en bij de deregulatie van de darmstamcelfunctie tijdens de initiatie van colorectale kanker17. In de huid is ROS-signalering in verband gebracht met epidermale differentiatie en de regulatie van de huidstamcelniche en de haarfollikelgroeicyclus18,19.
In dit perspectief is een belangrijke experimentele beperking om de fysiologische rollen van ROS in biologische systemen te bepalen, zowel in normale als pathologische omstandigheden, het gebrek aan adequate experimentele hulpmiddelen om gecontroleerde productie van deze moleculen in cellen en weefsels te induceren, die nauwkeurig lijken op hun fysiologische productie als tweede signaalboodschappers. Op dit moment omvatten de meeste experimentele benaderingen de toediening van exogene ROS, meestal in de vorm van waterstofperoxide. We hebben onlangs een experimentele aanpak geïmplementeerd om een voorbijgaande, niet-dodelijke in vivo productie van endogene ROS in de muizenhuid in te schakelen, gebaseerd op de toediening van precursoren van de endogene fotosensitizer protoporfyrine IX (PpIX; bijv. aminolaepilinezuur of het methylderivaat methylaminolevulinaat daarvan) en verdere bestraling van het monster met rood licht om de in situ vorming van ROS uit intracellulaire moleculaire zuurstof te induceren (figuur 1). Deze fotodynamische procedure kan efficiënt worden gebruikt om residente stamcelniches te stimuleren, waardoor de regeneratieve programma's van het weefselworden geactiveerd 19,20 en de weg wordt geopend voor nieuwe therapeutische modaliteiten in de huidregeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving van het protocol, met representatieve voorbeelden van stimulatie van stamcelniches, gemeten als een toename van het aantal langdurige 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) labelbehoudende cellen (LRC's) in het uitstulpende gebied van de haarfollikel19,21, en daaropvolgende activering van regeneratieprogramma's (versnelling van haargroei en brandwondgenezingsprocessen) geïnduceerd door voorbijgaande, niet-dodelijke ROS-productie in de huid van de C57Bl6-muizenstam.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorofluorescin diacetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>5'-bromo-2'-deoxiuridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5002-500MG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bromodeoxyuridine-Fluorescein</td><td>Roche</td><td>11202693001</td><td></td></tr><tr><td>Depilatorische crème (bijv. Veet)</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>In Vivo beeldvormingssysteem, bijv. IVIS Lumina 2</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mALA in de vorm van een topische crème, bijv. METVIX Crema 160 mg/g</td><td>Galderma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Energiemeter (bijv. ThorLabs Model PM100D)</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rode lichtbron, bijv. 636 nm Aktilite LED-lamp</td><td>Photocure ASA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine ix-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Hier beschrijven we een protocol om schakelbare in vivo fotogeneratie van endogene reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren. Deze voorbijgaande productie van ROS in situ activeert efficiënt celproliferatie in stamcelniches en stimuleert weefselregeneratie zoals sterk gemanifesteerd door de versnelling van brandwondengenezing en haarfollikelgroeiprocessen. Het protocol is gebaseerd op een gereguleerde fotodynamische behandeling die het weefsel behandelt met voorlopers van de endogene fotosensitizer protoporfyrine IX en het weefsel verder bestraalt met rood licht onder streng gecontroleerde fysisch-chemische parameters. Over het algemeen vormt dit protocol een interessant experimenteel hulpmiddel om de ROS-biologie te analyseren.

De topische toediening van de mALA-voorloper in de rug- en staarthuid van de muis resulteert in een significante accumulatie van PpIX in het hele weefsel en, merkbaar, in de haarfollikel, zoals aangetoond door de roodroze fluorescentie van deze verbinding onder excitatie van blauw licht (407 nm) (figuur 2A,C). Latere bestraling van behandeld weefsel met rood licht (636 nm) bij een fluence van 2,5−4 J/cm 2 bevordert de voorbijgaande productie van ROS in het weefsel...

Het doel van dit protocol is om voorbijgaande in vivo productie van niet-dodelijke niveaus van reactieve zuurstofsoorten (ROS) in de huid van muizen te induceren, waardoor fysiologische reacties in het weefsel verder worden bevorderd.

Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Onze methodologie is de eerste die een betrouwbaar experimenteel hulpmiddel biedt om een tijdelijke activering van een endogene reactieve zuurstofsoort of ROS-productie in een weefsel in vivo te induceren. Onze methodologie biedt een robuuste, gebruiksvriendelijke en niet-invasieve procedure die een consistente productie van fysiologisch stimulerende ROS-niveaus in de huid oplevert, fundamenteel gebruikmakend van een rode lichtbron. Aangezien de fysiologische inductie van ROS in de huid de weefselen stemt, hebben we onze methodologie verder toegepast voor huidregeneratietherapie, inclusief goede genezing en haargroei.ROS-biologie en -signalering is momenteel een onderzoeks-hotspot. Een grote beperking om ROS-functie in vivo te onderzoeken, is het ontbreken van adequate hulpmiddelen om een gecontroleerde endogene ROS-productie te induceren. ONZE methodologie is gebruiksvriendelijk en eenvoudig, maar alle apparaten, lamp, IV, IS, enzovoort, moeten adequaat worden gekalibreerd.Kritische chemische precursoren moeten vers zijn en alle stappen of het protocol moeten nauwkeurig worden gevolgd. Om haargroei op de dorsale huid van muizen in de tweede telogene fase te induceren, na bevestiging van een gebrek aan respons op de peesreflex rond dag 50 na geboorte bij C57 zwarte zes muizen uit dezelfde nest, gebruik een scheermes en ontharingscrème om twee onafhankelijke zij-aan-zij gebieden van de huid van de rug van elke muis te verwijderen. Na een paar minuten, verwijder de crème met PBS en registreer de haarfollikelgroei door dagelijks hoge resolutiebeelden van de controle en behandelde dorsale huidgebieden van elk dier te maken.Om de generatie van tweedegraads brandwondlesies op de dorsale huid van muizen in de tweede telogene fase te induceren, verwijder het haar van de rug van de muis. Verwarm een koperaandeel van één centimeter tot 95 graden Celsius in kokend water en breng de staaf gedurende vijf seconden aan op de centrale regio van de muishuid. Direct na het genereren van brandwonden, injecteer de dieren intraperitoneaal met één milliliter fysiologische oplossing om uitdroging te voorkomen en laat de muizen 24 uur herstellen voordat u doorgaat met de behandeling.Voor de generatie van BrdU gelabelde behouden cellen of LRC's, injecteer 10 of 14 dagen oude nestgenoten intraperitoneaal eenmaal per dag gedurende vier opeenvolgende dagen met 50 milligram per kilogram lichaamsgewicht van BrdU in PBS. Na de labelfase, laat muizen zich gedurende 50 tot 60 dagen ontwikkelen voordat u de behandeling toepast. Om de tijdelijke productie van niet-dodelijke reactieve zuurstofsoorten of ROS-niveaus in muizenhuid voor een haargroeianalyse te induceren, breng na het verkrijgen van een basislijn haargroei-afbeelding ongeveer 25 milligram mALA-crème aan op de rechte geschoren huidgebieden en plaats het dier in het donker gedurende 2,5 uur.Aan het einde van de behandelingsperiode met de fotosensitizer, verwijdert u grondig eventuele overtollige crème met PBS en bevestigt u PP9-productie in situ door rode fluorescentie-expressie onder blauwe lichtexcitering, bestraal vervolgens de hele rughuid met een adequate rode lichtbron voor een totale dosis van 2,5 tot 4 joule per vierkante centimeter. Laat de muizen vervolgens herstellen op een elektrische deken met monitoring totdat volledige recumbentie is bereikt voordat de dieren terugkeren naar hun kooien. Om tijdelijke ROS-productie voor tweedegraads brandwondgenezing in te schakelen, breng ongeveer 25 milligram mALA-crème aan langs het rechter brandwondoppervlak en ongeveer vier millimeter aangrenzend weefsel en plaats de dieren in het donker gedurende 2,5 uur zoals gedemonstreerd.Na het verwijderen van de crème, bestraal de hele rughuid en laat de muizen herstellen met monitoring zoals gedemonstreerd. Om tijdelijke ROS-productie in staarthuid te induceren, breng ongeveer 25 milligram mALA-crème aan langs het dorsale weefselgebied van de BrdU-behandelde muizen en bestraal de dorsale huid van de staart zoals gedemonstreerd. Na het euthanaseren van de muizen, oogst de staarthuid voor BrdU-detectie.Gebruik een scalpel om de staart van elk dier te oogsten, maak vervolgens rechte longitudinale incisies en verwijder de hele huid als een enkel stuk van de ruggengraat. Incubeer de gepelde huidstukken in vijf millimolar EDTA en PBS en vijf milliliter buizen gedurende vier uur bij 37 graden Celsius om de zorgvuldige scheiding van intacte vellen epidermis van de dermis met behulp van pincetten mogelijk te maken. Fixeer de gescheiden weefsels in 4% formaldehyde en PBS gedurende ten minste 72 uur bij kamertemperatuur.Label vervolgens de gefixeerde weefsels met de gefluorescerende geconjugeerde antilichamen van belang voordat u de weefsels visualiseert door middel van fluorescentie-confocale microscopie volgens standaardprotocollen om LRC's onder elke experimentele conditie te identificeren en te kwantificeren. Voor de ex vivo evaluatie van ROS-productie, na het oogsten van muizenstaarthuidstukken zoals gedemonstreerd, incubeer de controle onbehandelde weefsels en vijf millimolar EDTA en PBS alleen en de fotodynamische behandelingsmonsters in EDTA aangevuld met twee millimolar mALA. Voeg vervolgens hydroethidine toe tot een eindconcentratie van 3,2 micromolar aan elke set weefsels en incubeer alle monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur in het donker.Aan het einde van de incubatie, gebruik vingertoppen om de staarthuidmonsters uit te rekken over een glazen oppervlak en bestraal de behandelde weefsels met 636 nanometer rood licht bij een fluence van 10 joule per vierkante centimeter. Aan het einde van de behandeling, scheid onmiddellijk de epidermis van de dermis en fixeer de epidermale vellen in 4% formaldehyde en PBS gedurende ten minste 72 uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de fixatie, evalueer de rode 2-hydroxyethidium-emissie door middel van fluorescentiemicroscopie met behulp van groen exciterend licht om de acquisitie van hoogwaardige afbeeldingen mogelijk te maken.Voor in vivo detectie van ROS-productie in de dorsale huid, direct na bestraling met rood licht, breng 100 microliter van een milligram per milliliter DH-FDA en 50% ethanol aan op alle doelwitten controle en behandelde huidge

stimulation-stem-cell-niches-tissue-regeneration-mouse-skin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Het doel van dit artikel is om een uitgebreid en gedetailleerd protocol te geven over hoe genetisch gemodificeerde humane organotypische huid te genereren uit epidermale keratinocyten en gedevitaliseerde humane dermis.

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Een niet-invasieve in vivo imaging protocol dat is gestroomlijnd en kosteneffectieve, beschrijven we met behulp van L-012, een chemiluminescentie luminol-analoog, om te visualiseren en te kwantificeren van reactieve zuurstof soorten (ROS) gegenereerd in een excisional wond muismodel.

In Vivo Beeldvorming van reactieve zuurstof soorten in een RattenUitrustingen wond Model

Wij stellen voor een protocol dat laat zien hoe geïnduceerde pluripotente stamcel afkomstige keratinocyten en fibroblasten differentiëren en genereren een 3D huid organoid, met behulp van deze keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol bevat een extra stap van het genereren van een gehumaniseerd muizen model. De techniek die hier gepresenteerd zal dermatologische onderzoek verbeteren.

Generatie van 3D huid Organoid van koord bloed afkomstige geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd direct herprogrammeringssysteem voor melanocyten en een zeer efficiënt, geconcentreerd virusverpakkingssysteem dat zorgt voor een soepele directe herprogrammering.

Directe herprogrammering van muisfibroblasten in melanocyten

Traditioneel wordt celkweek uitgevoerd op vlakke substraten die de natuurlijke omgeving van cellen in vivo slecht nabootsen. Hier beschrijven we een methode om celkweeksubstraten te produceren met fysiologisch relevante gebogen geometrieën en micropatterned extracellulaire eiwitten, waardoor systematisch onderzoek naar cellulaire detectie van deze extracellulaire signalen mogelijk is.

Generatie van multicue cellulaire micro-omgevingen door UV-fotopatterning van driedimensionale celcultuursubstraten

Hier presenteren we een protocol dat het gebruik van hydrogel demonstreert als een driedimensionaal (3D) celkweekraamwerk voor vet-afgeleide stamcelkweek (ADSC) en de introductie van fotobiomodulatie (PBM) om de proliferatie van ADSC's binnen de 3D-kweekomgeving te verbeteren.

Driedimensionale celkweek van van vet afgeleide stamcellen in een hydrogel met fotobiomodulatie-augmentatie

De combinatie van iteratief-bleken-extends-multiplexity (IBEX) en een commerciële nucleotide-labelingtest (Click-iT EdU) maakt de detectie en categorisatie van delende celtypen mogelijk in zeer dynamische processen in gefixeerde ingevroren muizenweefselsecties. Bovendien biedt een nieuwe open-source beeldverwerkingspijplijn beeldacquisitie en -analyse met hoge doorvoer.

High-throughput beeldvormings- en analyseworkflow voor het evalueren van fenotypes en proliferatietoestanden van huidcellen in weefselmonsters

Dit protocol schetst een methode voor het produceren van huidorganoïden die haarzakjes bevatten van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een vlak, fysiologisch relevant lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem om de huidarchitectuur en -functie na te bootsen.

Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide vlakke haardragende huidorganoïden met behulp van een lucht-vloeistof-interfacecultuursysteem

Deze methode bestudeert hoe senescente huidfibroblasten gezonde fibroblasten beïnvloeden. Senescentie wordt geïnduceerd door UVB-blootstelling, en het geconditioneerde medium wordt toegepast op normale fibroblasten. Het helpt bij het evalueren van bioactieve verbindingen die gericht zijn op veranderde cel-tot-cel communicatie bij huidveroudering.

Nieuwe combinatie van antioxidanten om gezonde intercellulaire communicatie te herstellen in een in vitro model met behulp van een geconditioneerd medium uit senescente cellen

Ontdek een methode voor weefselregeneratie in muizenhuid door gecontroleerde fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten met rood licht. Deze techniek stimuleert haargroei en wondgenezing via niet-dodelijke ROS-niveaus.

Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ (Video) | JoVE Journal

Stimulatie van stamcelniches en weefselregeneratie in muizenhuid door schakelbare protoporfyrine IX-afhankelijke fotogeneratie van reactieve zuurstofsoorten in situ

Meer video's verkennen