Gevalideerd LC-MS/MS Panel voor het kwantificeren van 11 resistente tb-medicijnen in small hair samples

Therapietrouw is zeer uitdagend en medicijnmetabolisme kan variëren van persoon tot persoon, zodat objectieve meting van de drug niveaus kan blijken te zijn belangrijk bij het voorkomen van het ontstaan van resistentie tijdens tbc behandeling. Als therapietrouw nauwkeuriger en gemakkelijker kan worden gekwantificeerd, dan kunnen zorgverleners een behandelplan ontwikkelen dat de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen zou beperken. We hebben het eerste meervoudige analyt massaspectrometriepaneel ontwikkeld voor meerdere tbc-medicijnen in kleine haarmonsters in één test.

Ons multi-drug paneel vereist slechts één monster van twee milligram per patiënt en gebruikt geen vaste faseextractie of filterstap om verlies van monstervolume te voorkomen. Objectieve maatregelen voor blootstelling aan geneesmiddelen die vroeg in het behandelingskuur worden gemeten, kunnen artsen mogelijk waarschuwen voor problemen met individuele geneesmiddelen in het behandelingsregime. Haarmonsters moeten worden verpulverd op de dag van de analyse voor een nauwkeurige drug concentratie niveau meting.

Om haarmonsters te verkrijgen, na het verkrijgen van schriftelijke geïnformeerde toestemming, maak materialen klaar met inbegrip van een dun label, twee deelnemer labels, een schaar, een uitgevouwen stuk aluminiumfolie, een alcohol doekje en een plastic zak. Veeg de messen van de schaar schoon met een alcoholdoekje. Ga naar de achterkant van het hoofd en til het bovenste deel van het haar met behulp van een haarclip indien gewenst.

Verzamel 30 haarlokken van de achterkant van het hoofd en isoleer het riet met je hand. Neem de schaar naar de hoofdhuid en snijd het riet van het haar. Leg het riet van het haar voorzichtig op de aluminiumfolie.

Zet het dunne etiket over het distale uiteinde van het haar riet, taping het veilig aan de aluminiumfolie. Het distale uiteinde is de kant het verst van de hoofdhuid. Vouw over het stuk aluminiumfolie op de bovenkant van het haar riet en zet een deelnemer label op de top van de aluminiumfolie.

Plaats het gevouwen stuk aluminiumfolie in de plastic zak en zet een ander deelnemerslabel op de plastic zak. Voor drug extractie van de haarmonsters, wegen twee milligram van elk haarmonster in individueel gelabelde kraalbuizen en twee milligram van het blanco haarmonster in elk van 16 extra kraalbuizen. Na het wegen, plaats alle kraalbuizen in een kraalmolenhomogenisator en homogeniseer de monsters bij een snelheid van 6.95 meters per seconde voor twee cycli van 30 seconden met een rustperiode van 15 seconden tussen elke cyclus.

Voeg na de tweede homogenisatie 500 microliter van de juiste interne standaardmix toe aan elk monster en voeg 500 microliter methanol toe aan de matrix blank buis. Spike de kalibratie curve buizen met de juiste hoeveelheid referentie standaard mix volgens de tafel en plaats alle buizen in een 37 graden water bad met zachte schudden voor twee uur. Breng aan het einde van de incubatie de supernatant van elke kraalbuis over in nieuwe gelabelde microcentrifugebuizen en voeg 500 microliters methanol toe aan de kraalbuizen.

Vortex de kraalbuizen en breng de methanol wassen naar de overeenkomstige microcentrifuge buizen. Centrifugeren de monsters en breng de supernatants voorzichtig over in nieuwe buizen zonder de haarpellets te verstoren. Verdamp de vloeistof in de buizen tot droogheid bij 32 graden Celsius en reconstrueren de monsters met 200 microliters van hoge druk vloeibare chromatografie kwaliteit water met 1%mierenzuur.

Breng na het vortexen de vloeibare monsters over op oranje flacons met 250 microliter inserts. Voor vloeibare chromatografie tandem massaspectrometrie, installeer eerst een twee tot 100 millimeter kolom met een 2,5 micrometer deeltjesgrootte en 100 angstrom porie grootte met polair-end afgetopte etherlinked fenol kralen volledig gemaakt van poreuze silica in de kolom compartiment. Controleer of er in de kolom ook een door de fabrikant aanbevolen beveiligingscartridge is geïnstalleerd.

Kopieer en plak de samengestelde informatie in de MDR-TB LCMS-methodeovergangen. csv-bestand in het vak in het venster massaspects. Maak in een spreadsheet een batchreeks van de kalibratiecurve, kwaliteitscontroles, patiëntmonsters, kalibratiecurve, kwaliteitscontroles, patiëntmonsters, kalibratiecurve en kwaliteitscontroles.

Voeg oplosmiddel blanco injecties toe aan het begin en einde van de run, evenals voor en na de kalibratiecurve, kwaliteitscontroles en patiëntmonsters. Plaats vervolgens ten minste acht oplosmiddel blanco injecties in de injecties in de kalibratiecurve en de hoge kwaliteit controle flacon om de analyt overdracht te verminderen. Wanneer de batches zijn voltooid, opent u de kwantificeringssoftware.

Blader door de overgangen om ervoor te zorgen dat de automatisch geselecteerde bewaartijd nauwkeurig is en controleer of de Gaussische smoothing is ingesteld op 1,5. Vervolgens geeft u de kalibratiecurve en regressie weer en stelt u het wachttype in op één boven x. Klik op OK en valideer de kalibratiecurve en de voorbeelden van kwaliteitscontrole om ervoor te zorgen dat de batch is uitgevoerd.

Voor elke referentieanalyt van de kwadraat moet ten minste twee derde van de kalibratiepunten een nauwkeurigheid hebben binnen 80-120%Controleer of de R-waarde boven de kalibratiecurve groter is dan 0,975. Als aan alle bovenstaande voorwaarden is voldaan, is de partij geslaagd en kunnen de monsters worden gekwantificeerd. Klik op Bewerken op de werkbalk en klik op Hele tabel kopiëren.

Plak de tabel vervolgens in een spreadsheet en gebruik het gemiddelde van de berekende concentratie van de twee monsterinjecties om de gerapporteerde concentratie van elk monster te bepalen. Hier wordt een illustratie getoond van een chromatogram met bevestigde niveaus van alle geteste 11 resistente tbc-geneesmiddelen. In deze cijfers kunnen de geëxtraheerde ionchromatogrammen voor een bepaald medicijn in een van de calibrators worden waargenomen.

De kwantificeerder- en kwalificatieovergangen worden gebruikt om de aanwezigheid van het geneesmiddel kwalitatief te bevestigen, aangezien de verhouding tussen het gebied van de kwantificeerder en het kwalificatiegebied de constante blijft voor monsters. De interne norm wordt ook gecontroleerd om ervoor te zorgen dat elke monsterinjectie wordt genormaliseerd. In deze analyse, een handige steekproef van 15 haarmonsters onder een totale studiepopulatie van 96 patiënten die resistente tbc-geneesmiddelen onder direct waargenomen therapie voorwaarden uit West-Kaap, Zuid-Afrika werd geëvalueerd om representatieve niveaus van resistente tbc-geneesmiddelen te bepalen over de laagste en hoogste niveaus voor elk analyt.

Bij afwezigheid van een vaste fase extractie of filterstap, zorg bij het overbrengen van de supernatant in de verdampingsbuizen. Alles wat in de buizen wordt overgebracht, kan in de kolom worden geïnjecteerd. Als de rotor van de kraal raptor kan vliegen als niet strak geschroefd of vergrendeld, moet u de rotor dubbel controleren voordat u gaat werken.

In tegenstelling tot antiretrovirale middelen op het gebied van HIV, blijft de relatie tussen tbc-medicatie farmacokinetiek, therapietrouw en klinische uitkomsten grotendeels onbestudeerd. We hebben verondersteld dat sommige tbc medicijnen niet goed accumuleren in het haar. Gericht op de metabolieten van deze geneesmiddelen kan een beter begrip van de therapietrouw van de patiënt.