Morfologische en functionele evaluatie van Axons en hun Synapsen tijdens Axon Death in Drosophila melanogaster

Het algemene doel van dit Drosophila letsel protocol is om zowel het behoud van axonale en synaptische morfologie, evenals synaptische functie van axonen en hun synapsen observeren. Deze tests kunnen ook worden gebruikt om neuronale onderhoudsfactoren te karakteriseren, axonaal transport te bestuderen of axale organellen in intacte axonen te analyseren. De gedeeltelijke vleugel letseltest zorgt voor de observatie van gewonde axonen ondergaan degeneratie naast elkaar met ongewonde controle axonen binnen dezelfde zenuwbundel in de Drosophila vleugel.

Deze schadetest kan gemakkelijk vooraf worden beoefend in wilde vliegen door het toepassen van een snede ruwweg in het midden van de vleugel met micro-schaar. De interne schade maakt de beoordeling van axale morfologie en door het gebruik van optogenetica mogelijk om functionele bewaring van axon en hun synapsen te visualiseren. Antenneablatie vereist vaste handen.

Het wordt ook aanbevolen om de verwijdering van de antennes in wilde vliegen vooraf te oefenen. Bij verslaving is elke beschikbare optogenetica-setup geschikt voor het activeren van de neuronen in vliegen met hoed. Anders kan een eenvoudige setup gemakkelijk worden opgebouwd vanaf nul.

Om te beginnen, gebruik maken van vijf maagdelijke vrouwtjes en vijf mannetjes uit de juiste genotype om kruisen uit te voeren bij kamertemperatuur. Breng de P0-generatie om de drie tot vier dagen over in nieuwe flesjes. Verzamel vers afgeschermde volwassen nakomelingen F1 generatie dagelijks in nieuwe flesjes en leeftijd ze voor zeven tot 14 dagen.

Gebruik na verdovende middelen een microschaar om de binnenvleugelader ruwweg in het midden van de vleugel te snijden. Gebruik een vleugel voor de blessure en de andere vleugel als een leeftijd geëmatched niet-gewonde controle. Breng een blessure per vleugel en zorg ervoor dat 15 vleugels gewond te krijgen.

Herstel de vliegen in voedsel met flesjes. Vervolgens, met een pipet, verspreid 10 microliters van halocarbon olie 27 langs een hele glazen glijbaan. Een of zeven dagen na letsel, gebruik micro-schaar af te snijden van de gewonde en de niet-gewonde controle vleugel.

Gebruik een pincet om de vleugel in het midden te grijpen, monteer maximaal vier vleugels in de halocarbon olie 27 en bedek ze met een cover slide. Afbeeldingen van GFP gelabelde neuronen in de vleugel kunnen gemakkelijk worden verkregen met een draaiende schijf. De aanschaftijd moet echter binnen acht minuten na het monteren van de vleugels worden uitgevoerd omdat de schotel niet is gefixeerd.

Beeld de vleugel onmiddellijk met behulp van een draaiende schijf microscoop. Verwerf een reeks optische secties langs de Z-as met een stapgrootte van 0,33 micrometer en comprimeer Z-stacks in één bestand voor latere analyses. Kruis vijf maagdelijke vrouwtjes en vijf mannetjes uit het juiste genotype en verzamel de F1-generatie zoals voorheen.

Gebruik na verdovende middelen een pincet om het rechter derde antennesegment te oblate voor eenzijdige ablatie of zowel linker- als rechter derde antennesegmenten voor bilaterale ablatie. Dit verwijdert GFP gelabelde neuronale cellichamen, terwijl hun axonale projecties blijven in de CNS. Afhankelijk van de GFP gelabelde neuronen gebruikt in de techniek, is het belangrijk om te weten of de cellichamen zijn gehuisvest in de derde of in de tweede antenne segment voor de daaropvolgende schade test.

Herstel de vliegen in voedsel met flesjes. Na verdovende middelen, gebruik pincet om de nek en een andere pincet te grijpen om de thorax te repareren. Trek voorzichtig de nek en het hoofd van de thorax.

Met behulp van pincet die zijn ondergedompeld in de vaststelling oplossing, breng alle hoofden in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met een milliliter van de vaststelling oplossing van 4%paraformaldehyde en 0,1 triton X100 in PBS. Bevestig de koppen gedurende 20 minuten met zachte agitatie bij kamertemperatuur. Zet vervolgens de microcentrifugebuis op ijs en de hoofden trekken naar de bodem van de microcentrifugebuis.

Verwijder de supernatant met een pipet en voeg een milliliter wasbuffer toe met 0,1% triton X100 in PBS. Plaats de buis op een draaiwiel op kamertemperatuur om twee minuten te wassen. Herhaal de was vier keer extra om de restbevestigingsoplossing te verwijderen.

Na de voorbereiding van de hersenen, het verkrijgen van een cover dia, stick lab tape op, en knip een T-achtige vorm van de tape. Gebruik een 20 tot 200 microliter pipetpunt waarbij drie millimeter van de punt is afgesneden om de opening van de pipet te verbreden. Pipette de hersenen met antifade reagens op de dia en bedek de hersenen met een cover slide.

Gebruik klei om twee kleine zelfs rollen voor te bereiden. Zorg ervoor dat de kleirollen niet hoger zijn dan de hoogte van een glazen schuif. Plak de kleirollen op de glazen glijbaan en plaats de hersenen met deksel dia sandwich op de klei rollen.

Ga verder volgens het manuscript. Om de vliegen voor te bereiden op optogenetica, eerst smelten vliegen voedsel in een magnetron. Nadat het voedsel afkoelt, voeg u vóór stolling 20 millimolar alle trans-Retinale in ethanol toe aan een uiteindelijke concentratie van 200 micromolar.

Meng goed en giet het voedsel onmiddellijk in lege flesjes. Bedek de flesjes met het gestolde voedsel met pluggen of katoenen ballen. Wikkel de flesjes met aluminiumfolie.

Bewaar vervolgens het voedsel met flesjes in een donkere koude kamer. Gebruik vijf maagdelijke vrouwtjes en vijf mannetjes van het juiste genotype om kruisen uit te voeren bij kamertemperatuur en verzamel F1-generatie zoals eerder in met aluminium bedekte flesjes met 200 micromolar alle trans-Retinale in vliegvoedsel. Verzamel vervolgens de vliegen door ze af te tappen uit voedsel met flesjes in een lege flacon zonder voedsel.

Koel de flacon ongeveer 30 seconden af in ijs met water. Vliegen vallen in slaap. Nu, snel individuele vliegen in kleine kamers bedekt een cover dia om optogenetica uit te voeren.

Voer in een donkere kamer het protocol uit dat bestaat uit 30 seconden waar het rode licht afwezig is, gevolgd door 10 seconden blootstelling aan rood licht op 10 Hertz. Herhaal deze procedure drie keer in totaal gevolgd door een extra interval van 30 seconden waarbij het rode lampje afwezig is. Verzamel individuele vliegen uit elke kamer op kooldioxide pads.

Om ze te onderwerpen aan antenneletsel, ablate zowel de linker en rechter tweede antenne segmenten. Dit verwijdert de cellichamen van Johnston's orgaanneuronen, terwijl de axonale projecties in het CNS blijven. Herstel de vliegen in met aluminium bedekte flesjes met 200 millimolar allemaal trans-Retinal.

Op overeenkomstige tijdstippen, bijvoorbeeld zeven dagen na de antenneablatie, onderwerp de vliegen aan een andere grooming test. In dit protocol werden drie methoden gepresenteerd om de morfologie en functie van afgehakte axonen en hun synapsen te bestuderen. De eerste methode zorgt voor hoge resolutie observatie van individuele axonen in het perifere zenuwstelsel.

De schematische kruisen om wild-type en highwire klonen in de vleugel te genereren wordt hier getoond. De controle in gewonde GFP gelabelde axonen worden ook gepresenteerd met pijlen die wijzen op afgehakte axonen. De tweede benadering om axon dood van GFP gelabeld sensorische neuron axonen in de hersenen te bestuderen wordt gepresenteerd.

Schematische kruisen om wild-type en highwire klonen in de hersenen te genereren wordt hier getoond. Voorbeelden van controle in gewonde GFP gelabelde axonen worden gepresenteerd met pijlen die aangeeft afgesneden axon bundels. De derde methode toont de benadering om axonale en synaptische functie na axotomie te visualiseren.

De schematische kruisen om wild-type en dnmnat te genereren over-uitdrukken van Johnston's orgaan sensorische neuronen wordt hier getoond. Wild-type vliegen zijn vliegen met Johnston's orgaanneuronen met verzwakte axon dood. Beiden koesterden een krachtig grooming gedrag voor de verwonding.

Echter, zeven dagen na letsel, grooming niet worden opgewekt door optogenetica in wilde vliegen, terwijl de dieren met verzwakte axon dood bleef verzorgen. Hier gebruiken we verlies van functiemutaties of onze expressie van genen om het behoud van axonale morfologie of synaptische functie waar te nemen. Andere aanpassingsmethoden kunnen worden toegepast, zoals knock down RNA interferentie of weefsel specifieke CRISPR-Cas9 bemiddelde knock-outs.

Deze methoden kunnen worden gebruikt in een schade onafhankelijke context. Ze zorgen voor de observatie en karakterisering van neuronale onderhoudsfactoren tijdens veroudering, axonaal transport en axonale organellen in intacte axonen.