Twee verschillende Real-Time Place Preference Paradigma's met behulp van Optogenetica binnen de Ventral Egmental Gebied van de Muis

We bieden hier een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van de lonende of aversieve eigenschappen van de genetische stimulatie van een specifiek hersengebied. De techniek kan snel antwoord geven als stimulatie van specifieke cellen lonend of aversief is. We beschrijven setup voor het stimuleren van de ventrale tegmental gebied, maar onze protocollen kunnen gemakkelijk worden aangepast aan specifieke parameters te veranderen in termen van verschillende regio's bestudeerd.

Gebruik om te beginnen microcontrollers met één bord om de laserbron te bedienen. Laad het script op het microcontrollerbord met behulp van de juiste verbindingskabel naar de computer. Het script bevat externe modulatie afkomstig van de tracking software via een TTL-box, en een uitvoer naar de laser om stimulatie parameters te controleren.

Gebruik een netwerkkabel om de TTL-box aan te sluiten op het bord. Zorg ervoor dat de laser is ingesteld op controle door externe modulatie, en sluit de laser aan op het bord met behulp van een FC / PC-kabel. Sluit de juiste pinnen aan op gronddelen van het bord.

Om de laserbron aan te sluiten op de glasvezelvezel, sluit u eerst de laserbron aan op een roterende verbinding. Sluit een patchkoord aan op het roterende gewricht. Stabiliseer het roterende gewricht boven het apparaat, maar buiten het opnamegebied.

Zorg ervoor dat de lengte van de glasvezel patch koord geschikt is om de muis te bewegen zonder problemen in de arena. Om de arena-opstelling te kalibreren, gebruikt u een liniaal om een specifiek deel van het fysieke apparaat te meten. Teken in de software een lijn die overeenkomt met het gemeten onderdeel.

Voer onder het tabblad Schalen naar kalibreren de reeds bekende waarde in. Ontwerp de arena, teken het gebied waar de beweging van de muizen zal worden geregistreerd. Maak de zones, teken de zones die uiteindelijk zullen worden toegewezen als laser-paired, laser-ongepaard en neutraal.

Druk op de knop Installatie valideren om de installatie te valideren om te bevestigen dat er geen conflicterende parameters zijn, bijvoorbeeld zones buiten de arena. Controleer of hardwarebeheer is ingeschakeld en stel de tijd van het experiment in op 30 minuten op de optie herhaaltegel in de instellingen van het referentievak. Wijs een compartiment toe als laser-gekoppeld, waarbij de ingang van de muis een TTL-signaal via de trackingsoftware naar het microcontrollerbord onder de instellingen van de conditie zal activeren.

Als u de instelling voor de voorkeursbenadering van het neutrale compartiment wilt wijzigen, wijst u na arena- en tijdinstellingen zowel A- als B-zones toe als laser-paired door toe te voegen wanneer het middelpunt zich in een van zone A en zone B bevindt voor het conditievak met betrekking tot de instellingen voor A- en B-compartimenten. Als u de detectie-instellingen wilt instellen, gebruikt u een dummy om op de muis te lijken. Plaats de dummy in één compartiment van het apparaat en gebruik geautomatiseerde installatie met dynamische aftrekking.

Verwijder de pop en plaats deze in het tegenovergestelde compartiment. Zorg ervoor dat de dummy volledig is gedetecteerd. Plaats de dummy in het met laser gekoppelde compartiment.

Als u wilt controleren of de stimulatie werkt, start u met de acquisitie met behulp van de eerder geconfigureerde instellingen voor proefbesturingselementen en controleert u of de stimulatie wordt geactiveerd zoals het hoort. Plaats vervolgens de pop in het ongepaarde of neutrale compartiment en kijk of de stimulatie wordt gestopt. Gebruik de knop op de laser om de laserkracht op 10 milliwatt in te stellen.

Sluit het glasvezelimplantaat aan op het glasvezelpatchsnoer met behulp van een keramische hoes en plaats de muis in het neutrale compartiment van het apparaat met drie compartimenten. Wacht tot de muis wordt gedetecteerd door de software. Verwijder de verticale schuifdeuren die het dier beperken om de hoofdcompartimenten binnen te komen.

Laat het dier vrij verkennen zonder enige verstoring. Het volledige real-time place preference experiment vindt plaats gedurende acht sessies. DAT-Cre muizen geïnjecteerd met AAV channelrhodopsin EYFP virus in het ventrale tegmental gebied werden getest om dopaminerge neuronen te richten.

De muizen brachten gemiddeld ongeveer 70% van hun tijd door in het door laser gekoppelde compartiment, in tegenstelling tot het ongepaarde compartiment bij 20% en het neutrale compartiment bij 10%Een tegenovergesteld gedragsfenotype werd waargenomen met Vglut2-Cre muizen geïnjecteerd met AAV channelrhodopsin EYFP in het ventrale tegmental gebied. De muizen vermeden het compartiment gekoppeld aan de stimulatie, en bracht meer tijd in de ongepaarden. Tijdens de geconditioneerde reacties dagen vijf en acht, de muizen niet tonen een duidelijke vermijding van de eerder gekoppelde compartiment.

Om de lonende of aversieve rol van specifieke neuronen verder aan te tonen, kan de beschreven methode worden aangevuld met andere methoden, zoals operonparadigma's, of fotogenetische substimulatie. Let op bij het omgaan met virussen en wanneer u laserbronnen gebruikt.