Name: Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Leer multiplex immunostaining met microwaves en fluorophore-tyramide voor muis bijnieren. Deze methode blokkeert antilichaamkruisreactiviteit en maakt gebruik van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde soort.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door NIH R00 HD032636.

1. Vlekken met het eerste antilichaam
<ol><li>Dewax en rehydrate FFPE dia's met 5 min toegewezen aan elk van de volgende stappen: xyleen of gelijkwaardige reagentia 3x, 100% ethanol 2x, 95% ethanol 1x, 70% ethanol 1x, 50% ethanol 1x, en gedestilleerd water 2x. OPMERKING: Dia's moeten vochtig blijven vanaf deze rehydratiestap tot de montage in de laatste stap.</li>
	<li>Voor het optioneel ophalen van antigeen plaatst u de glijbanen in 275 mL kokende natriumcitraatoplossing (10 mM, pH = 6,0) gedurende 8 min. Om de oplossing kokend te houden, plaatst u de glijbanen plat op de bodem van een 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x H) pipettipbox met deksel en magnetron de oplossing op 70% vermogen in een 700 W magnetron gedurende 8 min. Verwijder vervolgens de pipet tipbox uit de magnetron, open het deksel en laat de oplossing afkoelen bij kamertemperatuur (RT) gedurende ten minste 20 min.</li>
	<li>Breng de glijbanen over in een Coplin-pot met PBST (fosfaatgebufferde zoutoplossing met 0,1% polysorbaat 20/80). Was met PBST voor 5 min 3x. Als u niet onmiddellijk naar de volgende stap gaat, bewaar t.a.v. PBST in deze stap een paar uur of bij 4 °C gedurende 1-2 dagen, zo niet onmiddellijk naar de volgende stap.</li>
	<li>Om de blokkeringsoplossing voor te bereiden, gebruikt u het normale serum van de gastheersoorten van het secundaire antilichaam als blokkerend reagens. Andere commerciële blokkerende reagentia kunnen ook worden gebruikt. Als het gebruik van een normaal serum dat wordt gebruikt voor de studie die in dit onderzoek wordt gepresenteerd, voegt u 100 μL normaal ezelsserum toe aan 4,9 mL PBST. De blokkeringsoplossing kan maximaal 3 dagen bij 4 °C worden bewaard.</li>
	<li>Voor het blokkeren, schud de PBST van de dia's en snel bedekken met voldoende blokkeren oplossing. Incubeer de glijbanen bij RT in een bevochtigde kamer gedurende 30 min.</li>
	<li>Bereid de primaire antilichaamoplossing (500 μL voor twee dia's) voor met behulp van de blokkeringsoplossing om het primaire antilichaam tot de gewenste concentratie te verdunnen. De oplossing moet tot gebruik op ijs worden opgeslagen.<ol>
<li>Voeg voor 3βHSD 2 μL 3βHSD toe aan 498 μL blokkeringsoplossing.</li>
		<li>Voeg voor TH 0,5 μL TH-antilichaam toe aan 499 μL blokkeringsoplossing.</li>
		<li>Voeg voor β-catenine 1 μL β-catenin antilichaam toe aan 499 μL blokkeeroplossing.</li>
		<li>Voeg voor 20α HSD 1 μL 20αHSD-antilichaam toe aan 499 μL blokkeringsoplossing.</li>
		<li>Voeg voor CYP2F2 2 μL CYP2F2-antilichaam toe aan 498 μL blokkeringsoplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubeer met het primaire antilichaam door de blokkeringsoplossing van de glijbanen af te schudden en ze snel te bedekken met voldoende primaire antilichaamoplossing. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer 's nachts bij 4 °C. Tijdens de incubatie kunnen de dia's worden bedekt door een klein stukje paraffinefolie om uitdroging te voorkomen.</li>
	<li>De volgende ochtend was de glijbanen met PBST voor 5 min 3x.</li>
	<li>Bereid de secundaire antilichaamoplossing (500 μL voor twee glijbanen) voor met behulp van de blokkeringsoplossing om het biotinylated secundaire antilichaam te verdunnen tot de gewenste concentratie (bijvoorbeeld 1 μL ezelantimuisantilichaam of ezelantikonijnantilichaam in 499 μL van blokkeren oplossing). De oplossing moet tot gebruik op ijs worden opgeslagen.</li>
	<li>Incubeer met het tweede antilichaam door PBST van de glijbanen af te schudden en ze snel te bedekken met voldoende secundaire antilichaamoplossing. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij RT. OPMERKING: Als endogene biotine een punt van zorg is, gebruik dan een peroxidase-geconjugeerd secundair antilichaam in plaats van het biotinylated secundaire antilichaam. Ga naar stap 1.14 als u in stap 1.10 een geperoxidase-geconjugeerd secundair antilichaam gebruikt.</li>
	<li>Was de glijbanen met PBST gedurende 5 min 3x.</li>
	<li>Bereid de mierikswortel peroxidase-geconjugeerde streptavidin (SA-HRP) oplossing (500 μL voor twee dia's) door 0,5 μL SA-HRP toe te voegen aan 499 μL PBS. De uiteindelijke concentratie is 1 μg/mL.</li>
	<li>Incubeer met de SA-HRP oplossing. Schud PBST van de glijbanen en bedek de glijbanen snel met voldoende SA-HRP-oplossing. Incubeer de glijbanen in een bevochtigde kamer gedurende 0,5 uur bij RT.</li>
	<li>Was de glijbanen met PBST gedurende 5 min 3x.</li>
	<li>Bereid de fluorophore-tyramideoplossing voor door fluorophore-tyramide te verdunnen met zijn verdunningsbuffer volgens de instructies van de fabrikant (bijvoorbeeld 5 μL fluorophore-tyramide in 496 μL verdunningsbuffer).</li>
	<li>Voer de signaalontwikkeling uit met fluorophore-tyramide door PBST van de glijbanen af te schudden en de glijbanen snel te bedekken met voldoende fluorophore-tyramideoplossing. Incubeer in een bevochtigde kamer gedurende 1 min bij RT. De incubatietijd kan worden aangepast om de gewenste fluorescentieintensiteit te verkrijgen. Stop de reactie door de dia's over te zetten naar een Coplin-pot met PBST. Was glijbanen met PBST gedurende 3 min 2x.</li>
	<li>Signalen kunnen snel worden gecontroleerd onder een fluorescentiemicroscoop om het resultaat in dit stadium te bevestigen. Als coverslips niet worden gebruikt, breng dan op elke sectie een druppel glycerol:PBS (1:1) aan om de monsters vochtig te houden. Was glijbanen met PBST gedurende 3 min 2x. Dia's kunnen enkele dagen bij 4 °C in PBST worden opgeslagen voordat ze naar de volgende stap gaan.</li>
</ol>2. Strip het eerste antilichaam
<ol><li>Plaats de glijbanen in 275 mL kokende natriumcitraatoplossing (10 mM, pH = 6,0) gedurende ten minste 8 min. Houd de oplossing aan het koken door de glijbanen plat op de bodem van een 14 x 9,5 x 9 cm3 (W x L x X H) pipet tipbox met een deksel en microwaving de oplossing op 70% vermogen in een 700 W magnetron voor 8 min. Als een langere strippentijd de voorkeur heeft, kan het nodig zijn om de buffer af te maken met behulp van een kokende natriumcitraatoplossing om de dia's te allen tijde ondergedompeld in bufferoplossing te houden. Haal de pipet tipbox uit de magnetron, open het deksel en laat de oplossing minstens 20 min afkoelen bij RT.</li>
	<li>Breng de dia's over in een Coplin-pot met PBST. Was met PBST voor 5 min 3x. Als de volgende stap indien niet onmiddellijk wordt uitgevoerd, bewaar de dia's in een Coplin-pot met PBST bij RT gedurende een paar uur of bij 4 °C gedurende 1-2 dagen.</li>
</ol>3. Vlek met het tweede antilichaam
<ol><li>Ga van start bij de blokkeringsstap en volg dezelfde procedures in stap 1.5 tot en met stap 1.14. Gebruik bij de signaalontwikkelingsstappen (stap 1.15 en stap 1.16) de fluorophore-tyramide in een ander fluorescentiespectrum. OPMERKING: Dia's kunnen worden gestript met behulp van deze methode meerdere malen om multiplex vlekken mogelijk te maken. Het laatste antilichaam heeft fluorophore-tyramide niet nodig als verslaggever. Een fluorophore-geconjugeerd secundair antilichaam kan worden gebruikt om signalen van het laatste primaire antilichaam weer te geven.</li>
	<li>Incubeer dia's met 2 μg/mL 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of Hoechst oplossing voor 1 min bij RT als nucleaire tegenkleuring nodig is. Was vervolgens de glijbanen met PBST voor 3 min 2x.</li>
</ol>4. Beeldvorming Met behulp van een fluorescentiemicroscoop om signalen te detecteren
<ol><li>Monteer een coverslip met een druppel montagemedium dat geschikt is voor immunofluorescentie.</li>
	<li>Gebruik voor beeldvorming een fluorescentiemicroscoop om signalen van elk fluorescentiekanaal te detecteren. Begin met het DAPI-kanaal (Nuclear Staining) en de 4x lens om het weefsel op de dia te lokaliseren.</li>
	<li>Schakel over naar de 10x lens voor beeldvorming. Pas de belichtingstijd (300 ms) en lichtbronintensiteit (80% intensiteit) aan. Pas deze instellingen aan als het signaal te helder of te donker is. Maak foto's van elk kanaal zonder het podium te verplaatsen. Voor elk kanaal kan opnieuw worden scherpstellen. Voeg de afbeeldingen van elk kanaal samen met behulp van de software van de microscoop of ImageJ (imagej.nih.gov/ij/).</li>
</ol>

<ol><li>Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+indirect+immunofluorescence+procedure+for+staining+the+same+cryosection+with+two+mouse+monoclonal+primary+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).</li>
<li>Lan, H. Y., Mu, W., Nikolic-Paterson, D. J., Atkins, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+simple%2C+reliable%2C+and+sensitive+method+for+multiple+immunoenzyme+staining%3A+use+of+microwave+oven+heating+to+block+antibody+crossreactivity+and+retrieve+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel, simple, reliable, and sensitive method for multiple immunoenzyme staining: use of microwave oven heating to block antibody crossreactivity and retrieve antigens.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 97-102 (1995).</li>
<li>Tornehave, D., Hougaard, D. M., Larsson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwaving+for+double+indirect+immunofluorescence+with+primary+antibodies+from+the+same+species+and+for+staining+of+mouse+tissues+with+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microwaving for double indirect immunofluorescence with primary antibodies from the same species and for staining of mouse tissues with mouse monoclonal antibodies.</a> Histochemistry and Cell Biology. 113 (1), 19-23 (2000).</li>
<li>Kim, M., Soontornniyomkij, V., Ji, B., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((System-wide+immunohistochemical+analysis+of+protein+co-localization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">System-wide immunohistochemical analysis of protein co-localization.</a> PLoS One. 7 (2), e32043(2012).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Staining+by+Sequential+Immunostaining+and+Antibody+Removal+on+Routine+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Multiplex Staining by Sequential Immunostaining and Antibody Removal on Routine Tissue Sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Toth, Z. E., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+multiple+antigens+with+tyramide+signal+amplification+using+antibodies+from+the+same+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545-554 (2007).</li>
<li>Buchwalow, I., Samoilova, V., Boecker, W., Tiemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+immunolabeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+in+combination+with+tyramide+signal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Multiple immunolabeling with antibodies from the same host species in combination with tyramide signal amplification.</a> Acta Histochemica. 120 (5), 405-411 (2018).</li>
<li>Bauer, M., Schilling, N., Spanel-Borowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitation+of+microwave+treatment+for+double+immunolabelling+with+antibodies+of+the+same+species+and+isotype%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Limitation of microwave treatment for double immunolabelling with antibodies of the same species and isotype.</a> Histochemistry and Cell Biology. 116 (3), 227-232 (2001).</li>
<li>Pirici, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+elution+method+for+multiple+immunohistochemistry+on+primary+antibodies+raised+in+the+same+species+and+of+the+same+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody elution method for multiple immunohistochemistry on primary antibodies raised in the same species and of the same subtype.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (6), 567-575 (2009).</li>
<li>Glass, G., Papin, J. A., Mandell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMPLE%3A+a+sequential+immunoperoxidase+labeling+and+erasing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">SIMPLE: a sequential immunoperoxidase labeling and erasing method.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 57 (10), 899-905 (2009).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+5-plex+fluorescent+immunohistochemistry+with+tyramide+signal+amplification+and+same+species+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Fully automated 5-plex fluorescent immunohistochemistry with tyramide signal amplification and same species antibodies.</a> Laboratory Investigation. 97 (7), 873-885 (2017).</li>
<li>Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+biotin+as+a+marker+of+adrenocortical+cells+with+steroidogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).</li>
<li>Bussolati, G., Gugliotta, P., Volante, M., Pace, M., Papotti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrieved+endogenous+biotin%3A+a+novel+marker+and+a+potential+pitfall+in+diagnostic+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Retrieved endogenous biotin: a novel marker and a potential pitfall in diagnostic immunohistochemistry.</a> Histopathology. 31 (5), 400-407 (1997).</li>
<li>Wang, H., Pevsner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+endogenous+biotin+in+various+tissues%3A+novel+functions+in+the+hippocampus+and+implications+for+its+use+in+avidin-biotin+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of endogenous biotin in various tissues: novel functions in the hippocampus and implications for its use in avidin-biotin technology.</a> Cell and Tissue Research. 296 (3), 511-516 (1999).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Multiplex immunostaining is nuttig om de cellulaire colokalisatie van twee of meer antigenen te onderzoeken. Deze veel gebruikte techniek geeft overtuigende colokalisatie resultaten wanneer primaire antilichamen worden geconjugeerd met verschillende verslaggevers (directe kleuring). Echter, directe kleuring biedt meestal zwakkere signalen in vergelijking met indirecte vlekken, waarbij geconjugeerde secundaire antilichamen om de primaire antilichamen te detecteren. Bij indirecte kleuring is een hoogwaardig multiplex immun...

In multiplex immunostaining, directe vlekken met behulp van geconjugeerde primaire antilichamen kan informatieve resultaten opleveren. Zonder gebruik te maken van secundaire antilichamen, de directe kleuring methode heeft een laag risico van valse colokalisatie signalen van antilichaam cross-reactiviteit. Echter, de geconjugeerde verslaggevers (fluorophore, enzymen) of biotine op het primaire antilichaam beperken het toekomstige gebruik ervan. Als alternatief geeft indirecte immunovlekken meestal sterkere signalen met behulp van een ongeconjugeerd primair antilichaam met een gelabeld secundair antilichaam. Idealiter moeten ongeconjugeerde primaire antilichamen die worden gebruikt in multiplex immunostaining afkomstig zijn van verschillende gastheersoorten om cross-reactiviteit van antilichamen te voorkomen. De juiste combinatie van primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten is echter niet altijd beschikbaar.
Er zijn verschillende methoden vastgesteld om het risico te elimineren dat het secundaire antilichaam reageert met een ongewenst primair antilichaam. Een veel voorkomende methode is het gebruik van een F(ab) monomeric antilichaam om eventuele resterende bindende epitopen op het eerste primaire antilichaamcomplex te blokkeren voordat het wordt bevlekken met het tweede primaire antilichaam1. Antilichaam strippen, die vergelijkbaar is met de strip en reprobe van een westerse vlek blad, verwijdert de eerder gekleurde antilichaam complex zonder strippen van de afzetting van detecteerbare reporter moleculen zoals 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)2 en de fluorescerende tyramide afzetting3. Met deze methode kunnen reportermoleculen in verschillende kleuren een multiplexresultaat op dezelfde dia weergeven. De multiplex kleuring is ook haalbaar door de volledige verwijdering van de eerder gedeponeerde lagen antilichamen en de uitlijning van vervolgens verworven beelden van andere antilichamen4,5. Deze methoden geven allemaal betrouwbare resultaten, hoewel elke methode zijn beperkingen heeft en ingewikkelde procedures of een speciaal beeldvormingssysteem vereist.
Het huidige protocol toont de toepassing van een antilichaam strippen methode met het gebruik van algemeen beschikbare buffers. Dit protocol kan worden gebruikt voor het uitvoeren van multiplex immunofluorescente vlekken op formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties met twee niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten.

<table><tbody><tr><td>Antifade Mounting Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated donkey anti-mouse</td><td>JacksonImmuno</td><td>715-066-151</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Biotinylated donkey anti-rabbit</td><td>JacksonImmuno</td><td>711-066-152</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>BioLegend</td><td>422801</td><td>2 &mu;g/mL in gedistilleerd water</td></tr><tr><td>Fluorescentiemicroscoop</td><td>ECHO</td><td>Revolve 4</td><td></td></tr><tr><td>Horseradish peroxidase-geconjugeerd streptavidin</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-030-084</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Microgolfoven, 700 W</td><td>General Electric</td><td>JEM3072DH1BB</td><td></td></tr><tr><td>Muis anti-CYP2F2</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-374540</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Muis anti-TH</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-25269</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Normaal ezelsserum</td><td>JacksonImmuno</td><td>017-000-121</td><td>2% serum in PBST</td></tr><tr><td>Konijn anti-20&alpha;HSD</td><td>Kerafast</td><td>EB4002</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Konijn anti-3&beta;HSD</td><td>TransGenic</td><td>KO607</td><td>1:250 verdunning</td></tr><tr><td>Konijn anti-TH</td><td>NOVUS</td><td>NB300-109</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>Konijn anti-&beta;-catenin</td><td>Abcam</td><td>ab32572</td><td>1:500 verdunning</td></tr><tr><td>Streptavidin Horseradish Peroxidase (SA-HRP)</td><td>JacksonImmuno</td><td>016-303-084</td><td>1:1.000 verdunning</td></tr><tr><td>TSA Cy3 Tyramide</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT704B001EA</td><td>1:100 verdunning</td></tr><tr><td>TSA Fluorescein Tyramide</td><td>PerkinElmer</td><td>SAT701001EA</td><td>1:100 verdunning</td></tr></tbody></table>

microwaving en fluorophore-tyramide voor multiplex immunostaining op muis bijnieren − met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten

Microwaving and Fluorophore-Tyramide for Multiplex Immunostaining on Mouse Adrenals &#8722; Using Unconjugated Primary Antibodies from the Same Host Species

Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om het cellulaire expressiepatroon van een bepaald eiwit aan te tonen. Multiplex immunostaining maakt etikettering met behulp van meerdere primaire antilichamen mogelijk. Om cross-reactiviteit van antilichamen te minimaliseren, vereist multiplex immunostaining met indirecte kleuring niet-gelabelde primaire antilichamen van verschillende gastheersoorten. De juiste combinatie van verschillende soortenantilichamen is echter niet altijd beschikbaar. Hier beschrijven we een methode voor het gebruik van niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten (bijvoorbeeld, in dit geval zijn beide antilichamen van konijn) voor multiplex immunofluorescentie op formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) muis bijniersecties. Deze methode maakt gebruik van dezelfde procedure en reagentia die in de antigeenterugwinningsstap worden gebruikt om de activiteit van het eerder gekleurde primaire antilichaamcomplex te ontdoen. Dia's werden gekleurd met het eerste primaire antilichaam met behulp van een algemeen immunostaining protocol gevolgd door een bindende stap met een biotinylated secundair antilichaam. Vervolgens werd een avidin-biotine-peroxidase signaal ontwikkelingsmethode gebruikt met fluorophore-tyramide als substraat. De immunoactiviteit van het eerste primaire antilichaamcomplex werd gestript door onderdompeling in een microgolfkokende natriumcitraatoplossing voor 8 min. De onoplosbare fluorophore-tyramideafzetting bleef op het monster staan, waardoor de dia kon worden vastgehouden met andere primaire antilichamen. Hoewel deze methode elimineert de meeste vals-positieve signalen, sommige achtergrond van antilichaam cross-reactiviteit kan blijven. Als de monsters zijn verrijkt met endogene biotine, kan een geperoxideerd secundair antilichaam worden gebruikt ter vervanging van het biogetinylated secundair einlichaam om het vals-positieve van teruggewonnen endogene biotine te voorkomen.

De resultaten werden verkregen uit monsters die werden behandeld met alle beschreven stappen, waaronder de stap 1.2 voor het ophalen van antigeen. Alle secundaire antilichamen die hier werden gebruikt waren biotinylated. Fluorophore-tyramide werd gebruikt om signalen te ontwikkelen van de eerste en tweede primaire antilichamen. Beelden werden vastgelegd met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een FITC kubus (voor groene fluorescentie), een TxRED kubus (voor Cy3) en een DA...

Er zijn verschillende methoden vastgesteld voor multiplex immunostaining met primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort. Hier beschrijven we het gebruik van microgolf-gemedieerde antilichaam strippen en van fluorophore-tyramide om antilichaam cross-reactiviteit te blokkeren tijdens multiplex immunostaining op formaline-vaste paraffine-embedded muis bijnier secties.

Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten

Immunostaining is widely used in biomedical research to show the cellular expression pattern of a given protein. Multiplex immunostaining allows labeling ...

Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om de locatie van een eiwit van belang te identificeren. Multiplex immunostaining kan meerdere doelen op hetzelfde monster detecteren met behulp van verschillende primaire antilichamen. Het voordeel van deze methode is het gebruik van algemeen beschikbare buffers om antilichaam kruisreactiviteit te elimineren waardoor immunostaining met behulp van twee of meer niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort.Het aantonen van de procedure zal Sophia Zheng, een afgestudeerde student, en Qiongxia Lyu, een bezoekende geleerde van mijn lab. Voor het beitsen, de-wax en rehydraat formaline vaste paraffine-embedded dia's met vijf minuten onderdompes in elke oplossing zoals aangegeven. Na de tweede gedestilleerde wateronderdompeling, plaats de glijbanen in 275 milliliter kokende natrium citraat oplossing op de bodem van een pipet tip box met een deksel en plaats de doos in een 700 watt magnetron op 75%vermogen gedurende acht minuten.Open aan het einde van de behandeling het deksel en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de glijbanen wast met drie vijf minuten durende wasbeurten van verse PBST in een Coplin-pot. Om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, schudt u na de laatste wasbeurt de overtollige PBST van elke dia en bedekt u de dia's met een voldoende volume van een geschikte blokkeringsoplossing. Na 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer, schud de overtollige blokkeren oplossing van elke dia en voeg 250 microliter van de eerste primaire antilichaam van belang aan elk monster.Om te voorkomen dat monsters uitdrogen, kunnen de dia's worden bedekt met een stuk paraffinefilm. Na een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer, was de glijbanen drie keer met verse PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Schud de overtollige PBST af en bedek elke dia snel met 250 microliters van een geschikte secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van een uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBST zoals aangetoond en voeg 250 microliters van vers bereide streptavidin mierikswortel peroxidase aan elke dia. Na 30 minuten op kamertemperatuur, was de glijbanen drie keer in verse PBST. Schud vervolgens de overtollige PBST af en bedek elke dia met 250 microliters van vers bereide fluorofofoof-tyramide oplossing.Een minuut later, dompel de glijbanen in verse PBST, gevolgd door drie twee minuten wasbeurten in verse PBST. Breng na de laatste wasbeurt een paar druppels van een één-op-één glycerol-naar-PBS-oplossing aan op de secties en controleer op de aanwezigheid van een fluorescentiesignaal door fluorescentiemicroscopie. Om het eerste antilichaamcomplex te strippen, plaatst u de antilichaamgelabelde dia's gedurende ten minste acht minuten in 275 milliliter kokende natriumcitraatoplossing, zoals aangetoond.Open aan het einde van de behandeling het deksel en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de glijbanen drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt wast. Om te vlekken voor het tweede doeleiwit van belang, na het blokkeren van niet-specifieke binding zoals aangetoond, etiketteerde elk monster met 250 microliter van het tweede primaire antilichaam van belang bij vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend was je de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in verse PBST per wasbeurt voordat je elke dia bedekt met 250 microliters van een geschikte secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBST zoals aangetoond en voeg 250 microliters van vers bereide streptavidin mierikswortel peroxidase aan elke dia. Om het signaal voor het tweede doeleiwit van belang te ontwikkelen, behandel de dia's na drie PBST-wasbeurten met de fluorofofofreed tyramide in een ander fluorescentiespectrum. Om de ontwikkeling van het tyramidesignaal te stoppen, dompelt u de dia's onder in PBST.Bevlek vervolgens de monsters met een geschikte nucleaire kleurstof. Voor beeldvorming door fluorescentie microscopie, monteer elke nucleaire kleurstof gelabeld dia met een druppel van een geschikte montage medium in een coverslip. Gebruik de 4X doelstelling om het weefsel op de dia te lokaliseren.Schakel over naar de 10X-doelstelling voor beeldvorming en pas de belichtingstijd aan op 100 tot 400 milliseconden met de lichtbron tussen 40 en 80%-intensiteit. Verkrijg vervolgens afbeeldingen in elk kanaal zonder het podium te verplaatsen. De afbeeldingen van elk kanaal kunnen worden samengevoegd tot een fluorescerende afbeelding.Zonder te strippen tussen de eerste en secundaire antilichaam kleuring, de tweede kleuring voor tyrosine hydroxylase zal pikken signalen van het eerste doel eiwit van belang wat resulteert in een vals positieve tyrosine hydroxylase kleuring, bijvoorbeeld in dit monster in de bijnierschors. Om de antilichaam kruisreactiviteit in de mierikswortelperoxidase te verwijderen vanaf de eerste immunostaining, kan een minuut en acht minuten microgolf-gemedieerde strippen worden uitgevoerd wat resulteert in schone dubbele kleuringsresultaten. Er wordt geen significant signaal opgenomen in negatieve controlemonsters.Acht minuten strippen in kokende citraat buffer is ook voldoende om antilichaam cross-reactiviteit te elimineren voor veel antilichamen vaak gebruikt in de bijnier. In sommige gevallen is een zwak vals-positief signaal echter nog steeds detecteerbaar en een toename van 20 minuten naar de microgolfbehandeling kan de kruisreactiviteit van het antilichaam nog steeds niet volledig verwijderen. Tijdens fluorescentiebeeldvorming is het belangrijk om het stadium niet te verplaatsen bij het schakelen van kanalen.Het kan echter nodig zijn om de focus aan te passen om duidelijke beelden van elk kanaal te verkrijgen. Zorg ervoor dat u voor elk kanaal de belichtingstijd aanpast om ervoor te zorgen dat de signalen op de juiste manier worden belicht zonder overbelichte pixels of gebieden in de afbeeldingen. Tijdens de kleuringsprocedure is het belangrijk om de dia's gehydrateerd te houden van de ontwas en de dia's kunnen meerdere keren worden gestript met dezelfde stripmethoden om multiplex-vlekken mogelijk te maken.

microwaving-fluorophore-tyramide-for-multiplex-immunostaining-on

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

This video demonstrates an assay to perform multiplex immunostaining using primary antibodies from the same host species. In this method, an adrenal tissue section undergoes a two-step immunostaining process. Initially, the section is stained with antibodies specific for markers in the cortex, followed by stripping the bound antibody and restaining with antibodies specific for markers in the medulla.

A Multiplex Immunostaining Method Using Primary Antibodies from the Same Host Species

Deze video-artikel illustreert een uitgebreid protocol om alle stadia van neurogenese van de hippocampus bij volwassenen binnen dezelfde weefselsectie te detecteren en te kwantificeren. We hebben een methode ontwikkeld om de beperkingen van indirecte meervoudige immunofluorescentie te overwinnen die zich voordoen wanneer geschikte antilichamen van verschillende gastheersoorten niet beschikbaar zijn.

Immunohistochemie en Multiple Labeling met antilichamen van dezelfde Host te onderzoeken soorten volwassen hippocampus Neurogenese

Immunohistochemmie is een krachtige laboratoriumtechniek voor het evalueren van eiwitlokalisatie en -expressie in weefsels. Huidige semi-automatische methoden voor kwantificering introduceren subjectiviteit en leiden vaak tot onherhaalbare resultaten. Hier beschrijven we methoden voor multiplexte immunohistochemmie en objectieve kwantificering van eiwitexpressie en co-lokalisatie met behulp van multispectrale beeldvorming.

Kwantificering van eiwitexpressie en Co-localisatie behulp multiplexverzending Immuno-histochemische kleuring en multispectrale

Het lokaliseren van genexpressie naar specifieke celtypen kan een uitdaging zijn vanwege het ontbreken van specifieke antilichamen. Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige driedubbele detectie van genexpressie door dubbele fluorescentie RNA in situ hybridisatie te combineren met immunokleuring.

De combinatie van Double Fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie met immunolabel voor detectie van de expressie van drie genen in de hersenen van muizen Secties

Hier presenteren we een methode om te isoleren van de bijnieren van muizen, repareren de weefsels, sectie hen en uitvoeren immunofluorescentie kleuring.

Afzondering, fixatie en immunofluorescentie beeldvorming van muis bijnieren

Hier beschrijven we een protocol voor multiplex fluorescerende immunohistochemische kleuring en imaging voor de gelijktijdige localisatie van meerdere kanker-geassocieerde antigenen in lymfoom. Dit protocol kan worden uitgebreid tot de colocalization analyse van biomarkers binnen alle weefselsecties.

Multiplexed fluorescerende immunohistochemische kleuring, Imaging en analyse in histologische monsters van lymfoom

Multiplex fluorescerende immunohistochemie is een opkomende technologie die het mogelijk maakt de visualisatie van meerdere celtypen binnen intact formalin-vaste, paraffine ingesloten (FFPE) weefsel. Gepresenteerd zijn richtlijnen voor het waarborgen van een succesvol 7-kleuren multiplex met instructies voor het optimaliseren van antilichamen en reagentia, het voorbereiden van dia's, ontwerp en tips voor het vermijden van veelvoorkomende problemen.

Optimalisatie, ontwerp en Vermijd valkuilen in handmatige multiplex fluorescerende immunohistochemie

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.

Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerpen van een multiplex immunofluorescentie-antilichaampaneel voor op DNA-barcodes gebaseerde beeldvorming van muizen FFPE-melanoomweefsels. We beschrijven ook een pijplijn voor beeldanalyse met behulp van open-source tools voor het genereren van ruimtelijke proteomics-inzichten in de immuunmicro-omgeving van de muizenmelanoomtumor.

Op DNA-barcode gebaseerde multiplex immunofluorescentiebeeldvorming om FFPE-monsters van genetisch geherprogrammeerd muizenmelanoom te analyseren

Leer multiplex immunostaining met microwaves en fluorophore-tyramide voor muis bijnieren. Deze methode blokkeert antilichaamkruisreactiviteit en maakt gebruik van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde soort.

Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten (Video) | JoVE Journal

Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten

Meer video's verkennen