Microwaving en Fluorophore-Tyramide voor Multiplex Immunostaining op Muis bijnieren − Met behulp van ongeconjugeerde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoorten

Immunostaining wordt veel gebruikt in biomedisch onderzoek om de locatie van een eiwit van belang te identificeren. Multiplex immunostaining kan meerdere doelen op hetzelfde monster detecteren met behulp van verschillende primaire antilichamen. Het voordeel van deze methode is het gebruik van algemeen beschikbare buffers om antilichaam kruisreactiviteit te elimineren waardoor immunostaining met behulp van twee of meer niet-gelabelde primaire antilichamen van dezelfde gastheersoort.

Het aantonen van de procedure zal Sophia Zheng, een afgestudeerde student, en Qiongxia Lyu, een bezoekende geleerde van mijn lab. Voor het beitsen, de-wax en rehydraat formaline vaste paraffine-embedded dia's met vijf minuten onderdompes in elke oplossing zoals aangegeven. Na de tweede gedestilleerde wateronderdompeling, plaats de glijbanen in 275 milliliter kokende natrium citraat oplossing op de bodem van een pipet tip box met een deksel en plaats de doos in een 700 watt magnetron op 75%vermogen gedurende acht minuten.

Open aan het einde van de behandeling het deksel en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de glijbanen wast met drie vijf minuten durende wasbeurten van verse PBST in een Coplin-pot. Om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, schudt u na de laatste wasbeurt de overtollige PBST van elke dia en bedekt u de dia's met een voldoende volume van een geschikte blokkeringsoplossing. Na 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer, schud de overtollige blokkeren oplossing van elke dia en voeg 250 microliter van de eerste primaire antilichaam van belang aan elk monster.

Om te voorkomen dat monsters uitdrogen, kunnen de dia's worden bedekt met een stuk paraffinefilm. Na een nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius in een bevochtigde kamer, was de glijbanen drie keer met verse PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt. Schud de overtollige PBST af en bedek elke dia snel met 250 microliters van een geschikte secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van een uur in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBST zoals aangetoond en voeg 250 microliters van vers bereide streptavidin mierikswortel peroxidase aan elke dia. Na 30 minuten op kamertemperatuur, was de glijbanen drie keer in verse PBST. Schud vervolgens de overtollige PBST af en bedek elke dia met 250 microliters van vers bereide fluorofofoof-tyramide oplossing.

Een minuut later, dompel de glijbanen in verse PBST, gevolgd door drie twee minuten wasbeurten in verse PBST. Breng na de laatste wasbeurt een paar druppels van een één-op-één glycerol-naar-PBS-oplossing aan op de secties en controleer op de aanwezigheid van een fluorescentiesignaal door fluorescentiemicroscopie. Om het eerste antilichaamcomplex te strippen, plaatst u de antilichaamgelabelde dia's gedurende ten minste acht minuten in 275 milliliter kokende natriumcitraatoplossing, zoals aangetoond.

Open aan het einde van de behandeling het deksel en laat de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur voordat u de glijbanen drie keer met PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt wast. Om te vlekken voor het tweede doeleiwit van belang, na het blokkeren van niet-specifieke binding zoals aangetoond, etiketteerde elk monster met 250 microliter van het tweede primaire antilichaam van belang bij vier graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend was je de glijbanen drie keer gedurende vijf minuten in verse PBST per wasbeurt voordat je elke dia bedekt met 250 microliters van een geschikte secundaire antilichaamoplossing voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur.

Aan het einde van de incubatie, was de dia's drie keer in verse PBST zoals aangetoond en voeg 250 microliters van vers bereide streptavidin mierikswortel peroxidase aan elke dia. Om het signaal voor het tweede doeleiwit van belang te ontwikkelen, behandel de dia's na drie PBST-wasbeurten met de fluorofofofreed tyramide in een ander fluorescentiespectrum. Om de ontwikkeling van het tyramidesignaal te stoppen, dompelt u de dia's onder in PBST.

Bevlek vervolgens de monsters met een geschikte nucleaire kleurstof. Voor beeldvorming door fluorescentie microscopie, monteer elke nucleaire kleurstof gelabeld dia met een druppel van een geschikte montage medium in een coverslip. Gebruik de 4X doelstelling om het weefsel op de dia te lokaliseren.

Schakel over naar de 10X-doelstelling voor beeldvorming en pas de belichtingstijd aan op 100 tot 400 milliseconden met de lichtbron tussen 40 en 80%-intensiteit. Verkrijg vervolgens afbeeldingen in elk kanaal zonder het podium te verplaatsen. De afbeeldingen van elk kanaal kunnen worden samengevoegd tot een fluorescerende afbeelding.

Zonder te strippen tussen de eerste en secundaire antilichaam kleuring, de tweede kleuring voor tyrosine hydroxylase zal pikken signalen van het eerste doel eiwit van belang wat resulteert in een vals positieve tyrosine hydroxylase kleuring, bijvoorbeeld in dit monster in de bijnierschors. Om de antilichaam kruisreactiviteit in de mierikswortelperoxidase te verwijderen vanaf de eerste immunostaining, kan een minuut en acht minuten microgolf-gemedieerde strippen worden uitgevoerd wat resulteert in schone dubbele kleuringsresultaten. Er wordt geen significant signaal opgenomen in negatieve controlemonsters.

Acht minuten strippen in kokende citraat buffer is ook voldoende om antilichaam cross-reactiviteit te elimineren voor veel antilichamen vaak gebruikt in de bijnier. In sommige gevallen is een zwak vals-positief signaal echter nog steeds detecteerbaar en een toename van 20 minuten naar de microgolfbehandeling kan de kruisreactiviteit van het antilichaam nog steeds niet volledig verwijderen. Tijdens fluorescentiebeeldvorming is het belangrijk om het stadium niet te verplaatsen bij het schakelen van kanalen.

Het kan echter nodig zijn om de focus aan te passen om duidelijke beelden van elk kanaal te verkrijgen. Zorg ervoor dat u voor elk kanaal de belichtingstijd aanpast om ervoor te zorgen dat de signalen op de juiste manier worden belicht zonder overbelichte pixels of gebieden in de afbeeldingen. Tijdens de kleuringsprocedure is het belangrijk om de dia's gehydrateerd te houden van de ontwas en de dia's kunnen meerdere keren worden gestript met dezelfde stripmethoden om multiplex-vlekken mogelijk te maken.