Name: Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Leer verbeterde methoden voor ex vivo 3D-hydrogelkweek van patiënt-afgeleide xenografts op een geperfuseerd microfluïdisch platform. Deze techniek verhoogt levensvatbaarheid en ondersteunt high-throughput screenings voor oncologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health National Cancer Institute SBIR Fase I (HHSN26120700015C) en P01CA098912.

Tumorweefsel werd verkregen met toestemming van de patiënt en volgens een goedgekeurd Institutional Review Board (IRB) protocol. Xenografts werden geïmplanteerd, geteeld en geoogst volgens een geaccepteerd Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) protocol.
OPMERKING: Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden. Alle stappen moeten worden uitgevoerd bij kamertemperatuur, tenzij anders bepaald.
1. Bereiding van materialen voor PDX-verwerking
<ol><li>Autoclave tang en scalpel handvat of scheermesjes.</li>
	<li>Dooi dissociatie enzym oplossing bij 4 °C 's nachts of bij kamertemperatuur op dezelfde dag als weefsel dissociatie. OPMERKING: Ontdooien bij 37 °C wordt afgeraden, omdat dit sommige dissociatieenzymen kan inactiveren.</li>
	<li>Bereid ten minste 100 mL PDX-kweekmedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium-nutriëntenmengsel F-12 [DMEM-F12] met 100 U/mL penicilline en streptomycin en 30% foetaal runderserum [FBS]), en ten minste 25 mL PDX-verwerkingsmedium (DMEM-F12 met 100 U/mL penicilline en streptomycine en geen FBS). Bewaar op 4 °C tot het gebruiksklaar is.</li>
</ol>2. PDX-dissociatie en initiële zuivering van stromale component
<ol><li>Verzamel autoclaved gebruiksvoorwerpen, 70 μm cel strainers (2−3), 60 mm ronde weefselkweekschotels (2), 6-well weefselkweekplaten, steriele 50 mL conische centrifugebuizen en steriele 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Warme cultuurmedium tot 37 °C en laat dissociatie enzym oplossing te komen tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Wanneer PDX-weefsel een diameter van 1,0−1,5 cm in een muishost heeft bereikt, verwijder de tumor chirurgisch uit de muis met standaardmiddelen (bijvoorbeeld onder geaccepteerde anesthesie) en bewaar op ijs in een buis van 50 mL met PDX-kweekmedium (Figuur 2A). Verwerk het weefsel onmiddellijk, via de onderstaande stappen, om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren, bij voorkeur binnen 1−2 uur na de oogst.</li>
	<li>Breng tumorweefsel over naar een voorgewogen steriele 50 mL conische buis. Spoel 6x met 30 mL steriele PBS om bloed en verontreinigingen te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof en weeg het tumorweefsel.</li>
	<li>Breng tumorweefsel naar een 60 mm ronde weefselkweekschaal en gehakt in ~1 mm3-stukken met behulp van een steriel scheermesje of scalpel.</li>
	<li>Voeg 5 mL PDX-verwerkingsmedium toe om tumordrijfmest te verzamelen en over te brengen naar een nieuwe steriele buis van 50 mL. Spoel de kweekschotel met nog eens 5 mL PDX-verwerkingsmedium, vervolgens met dissociatieenzymoplossing (10 mL/g tumor, ten minste 5 mL), waarbij alle spoelingen aan de 50 mL-buis worden toegevoegd.</li>
	<li>Incubeer 20 min bij 37 °C met zacht schudden. Draai de buis zachtjes halverwege de incubatietijd.</li>
	<li>Pipet zachtjes op en neer met een serologische pipet om klonten te breken. Filtercellen met een 70 μm celzeef geplaatst over een nieuwe steriele 50 mL buis. LET OP: Er kan meer dan één zeef nodig zijn.</li>
	<li>Centrifuge op 200 x g gedurende 5 min tot pelletcellen. Verwijder supernatant en resuspend in 2−3 mL van PDX cultuurmedium. Tel cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller.</li>
	<li>Gebruik tabel 1 om het vereiste aantal gescheiden PDX-afgeleide cellen te schatten dat nodig is om de gewenste celdichtheid per chip te bereiken. OPMERKING: De waarden in tabel 1 zijn bedoeld als uitgangspunt. Werkelijke waarden zullen variëren als gevolg van weefsel levensvatbaarheid / cellulaire en celverlies van bevriezing / herstel. PDX tumoren zijn individuen, zelfs binnen een bepaald type kanker, zodat deze waarden empirisch moeten worden aangepast.</li>
	<li>Van het getal berekend in stap 2.9, plaat 1−2 x 106 cellen in 5 mL van PDX cultuurmedium per put van een 6-well weefsel kweekplaat. Incubatie (37 °C, 5% CO2, 95% luchtvochtigheid) voor 48 uur met zacht schudden (50−55 tpm) om clustervorming te bevorderen (figuur 2B). Nadat cluster is gevormd, gaat u verder naar sectie 3 voor centrifugatie.</li>
	<li>Cryopreserve ongebruikte PDX cellen van de initiële dissociatie in 50% FBS + 40% DMEM-F12 + 10% dimethylsulfoxide (DMSO) of een commercieel verkrijgbaar primair celbevrief medium. OPMERKING: Aanhangende muis stromal cellen kunnen ook worden hersteld van het weefsel plaat oppervlak, indien gewenst, door spoelen kort met cultuur medium en uit te breiden met standaard middelen.</li>
	<li>Voor later gebruik van cryopreserved PDX tumorcellen/muis stroma, dooicellen in een 37 °C waterbad gedurende 2 min. Tel en plaat in een 6-well weefselkweekplaat zoals beschreven in stap 2.10 voordat u doorgaat naar sectie 3. Verhoog het aantal PDX-cellen met ~ 20% om levensvatbaarheid verliezen van cryopreservatie tegemoet te komen.</li>
</ol>3. Dichtheidsgradiëntcentrifugatiegebaseerde scheiding van PDX-afgeleide clusters uit afzonderlijke cellen
<ol><li>Bereid 20 mL van 100% dichtheidgradiëntoplossing voor door 18 mL dichtheidsgradiëntecentrifugatieoplossing grondig te mengen met 2 mL steriele 10x Hanks' uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) in een steriele conische buis van 50 mL. Maak 10 mL elk van 20%, 30%, 40% en 55% dichtheidgradiëntoplossingen door deze 100% oplossing te verdunnen met steriele 1x HBSS en goed te mengen. OPMERKING: Deze volumes zijn voldoende voor twee 15 mL gradiënten die kunnen worden gebruikt om ~15 x 106 cellen per stuk te scheiden. Als het scheiden van minder dan ~ 15 x 106 cellen, moet het tweede verloop worden gebruikt als een evenwicht voor centrifugatie.</li>
	<li>Voeg 3 mL van 55% dichtheidgradiëntoplossing toe aan de onderkant van een conische buis van 15 mL. Houd de buis onder een hoek, zeer voorzichtig laag 3 mL van 40% dichtheid gradiënt oplossing op de top van de 55% laag, langzaam af te geven van de vloeistof op de schuine kant van de buis om te voorkomen dat het mengen van de lagen. Herhaal dit met de 30% dichtheidgradiëntoplossing.</li>
	<li>Verzamel de supernatant van PDX rotatieculturen met een 5 mL serologische pipet, spoelplaat oppervlak voorzichtig. Centrifuge op 200 x g gedurende 2 min tot pelletcellen.</li>
	<li>Verwijder supernatant en resuspend de celpellet in 3 mL van 20% dichtheidgradiënt oplossing op basis van het aantal gradiënten die nodig zijn om de cellen te scheiden. Voorzichtig laag 20% dichtheid gradiënt oplossing met cellen op de bovenkant van het verloop(en). Als u slechts één verloopbuis voor cellen gebruikt, staat u bovenaan de balansgradiëntbuis met een 20% dichtheidsgradiëntoplossing van 20%.</li>
	<li>Dop de buizen en centrifuge in een zwenk emmer rotor centrifuge voor 30 min bij 4 °C, 2.000 x g, en 0 rem.</li>
	<li>Na centrifugatie zullen breuken zichtbaar zijn (figuur 2C). Verzamel 2−3 mL fracties in verse buizen van 15 mL. Voeg 3−4 volumes steriele 1x HBSS toe aan elke fractie en om te keren om grondig te mengen.</li>
	<li>Centrifuge op 1.000 x g gedurende 3 min tot pelletcellen. Verwijder supernatant en resuspend de celpellet in 1−2 mL van PDX verwerkingsmedium. OPMERKING: Levensvatbare PDX-celclusters worden meestal gevonden op de 40-55% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface (Figuur 2D) met enkele dode/stervende cellen die zich ophopen op de 20−40% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface voor de meeste geteste PDX's.</li>
	<li>Verwijder een klein, representatief aliquot (50−100 μL) voor re-dissociatie met een gelijk volume van dissociatieenzymoplossing om celnummer in de geclusterde celsuspensie te beoordelen. Tel cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller.</li>
</ol>4. Hydrogelbereiding en microfluïde plaatverzaaiing
<ol><li>Reconstitute HA hydrogel oplossingen (thiol-modified HA, HA-SH; thiol-reactive polyethyleen glycol diacrylaat, PEGDA) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Voeg met behulp van een multichannel pipet 50 μL HBSS toe aan alle putten in de kolommen van het observatievenster (kolom 3, 7, 11, 15, 19, 23) van een 2-baans microfluïde plaat om de vochtigheid van de cultuur en optimale beeldomstandigheden te behouden.</li>
	<li>Bereken het volume van de celsuspensie van sectie 3 die nodig is voor 50 μL hydrogel bij de gewenste celdichtheid (d.w.z. 5.000 cellen/μL). Voor het zaaien van een microfluïde plaat, aliquot het berekende volume in elk van 4 steriele 1,5 mL centrifuge buizen. LET OP: HA hydrogels hebben een vaste tijd tot gelatie. Pas het volume van de geloplossing aliquots voor de efficiëntie van de gebruiker bij het afgeven als voortijdige gelatie optreedt.</li>
	<li>Pas de pH van de HA-SH-oplossing direct voor gebruik aan op 8.0 met 1 N NaOH. Voer een testgelatie uit door 40 μL HA-SH te mengen met 10 μL PEGDA en gelatie na verloop van tijd te monitoren. Gelation begint meestal 5−8 min na het mengen van HA-SH met de PEGDA crosslinker.</li>
	<li>Centrifuge cel suspensie aliquots gedurende 2 min (200 x g, kamertemperatuur) tot pelletcellen. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend cellen in het juiste volume van HA-SH. OPMERKING: De uiteindelijke hydrogel is een 4:1 HA-SH:PEGDA-oplossing (in volume) zodat cellen opnieuw moeten worden opgetrokken in 40 μL HA-SH voor een eindvolume van 50 μL.</li>
	<li>Voeg 10 μL PEGDA toe aan één aliquot van cellen in HA. Meng goed en wacht 1−3 min (afhankelijk van de gelatietijd vanaf stap 4.4) voordat u de microfluïde plaat zaait. OPMERKING: Het toestaan van de gelatiereactie van start voor het zaaien helpt om de celbezinking te minimaliseren.</li>
	<li>Breng een tip aan voor het afgeven van 1,5 μL-volumes op een herhaalpipet met één kanaal en laad met cellen in HA hydrogel-oplossing. Vergeet niet om de hydrogel aliquot goed gemengd te houden om een gelijkmatige celverdeling te garanderen.</li>
	<li>Om de microfluidic plaat te zaaien, lijnt upijppunt loodrecht op de plaat terwijl u voorzichtig de punt in het midden van de gelinlaat plaatst (kolommen 1, 5, 9, 13, 17, 21) om contact te garanderen, maar geen druk bij het afgeven van de hydrogel-oplossing. Werken snel om voortijdige hydrogel stolling te voorkomen, afzien van 1,5 μL gel oplossing in elke gel inham.</li>
	<li>Observeer de vulstatus van de microfluïde kanalen door vanaf de bovenkant van de plaat, de onderkant van de plaat of per microscoop te bekijken en beoordeel de belasting, met behulp van figuur 3 als leidraad (succesvol laden in figuur 3A, pipetpositioneringsbegeleiding in figuur 3B, gemist in figuur 3C, niet gevuld om te eindigen in figuur 3D, overloop in figuur 3E). Identificeer de noodzakelijke aanpassingen in de techniek die het vulsucces voor de volgende ronde chips kunnen verbeteren (zie discussie voor tips voor het oplossen van problemen).</li>
	<li>Herhaal stap 4.6−4.9 met de overige 3 aliquots cellen in HA-oplossing. Omkeren van de plaat tijdens de voorbereiding van de volgende aliquot (~ 1 min). OPMERKING: De wachttijd van 1 min en de inversie van de plaat verbeteren de 3D-verdeling van de cellen door de celbezinking te verminderen naarmate gelatie optreedt.</li>
	<li>Nadat alle chips zijn gevuld, ontcunificeren de plaat bij 37 °C in een bevochtigde couveuse tot gelatie is voltooid (~ 45 min).</li>
	<li>Zorg er met behulp van de meegeleverde handleiding voor dat de perfusierotator in de celkweek incubator wordt geïnstalleerd met de juiste perfusie-instellingen (14° hoek, intervallen van 4 min).</li>
	<li>Voeg 50 μL PDX-kweekmedium toe aan alle medium inhammen (kolommen 2, 6, 10, 14, 18, 22) en controleer of de kanalen goed gevuld worden door de plaat om te draaien. Tik de plaat voorzichtig tegen een oppervlak om de vloeistof aan te moedigen om de microfluïde kanalen te vullen.</li>
	<li>Voeg 50 μL DMEM-F12 (10% FBS) toe voor alle middelgrote verkooppunten (kolom 4, 8, 12, 16, 20, 24). Als er luchtbellen in het perfusiekanaal zitten, verwijder dan door de plaat voorzichtig tegen een oppervlak te tikken.</li>
	<li>Met behulp van een microscoop en plaat lay-out vorm (Aanvullende figuur 1), record chip vullen succes. Sluit verkeerd gevulde chips uit voor verder experimenteel gebruik.</li>
	<li>Plaats de plaat op een kantelende tuimelschakelaar die op een 14° kanteling en een 4 min cyclus wordt geplaatst om perfusie te beginnen. Vervang PDX-kweekmedium om de 2 dagen (eerst 50 μL in de inlaat, dan 50 μL in uitlaat).</li>
</ol>5. Celvlekken, beeldvorming en beeldkwantificering
<ol><li>Bereid een cel levensvatbaarheid test oplossing met drie fluorescerende kleurstoffen (Hoechst 33342, ethidium homodimer-1, calcein acetoxymethyl [AM]).<ol>
<li>Bereid voorraadoplossingen van elke kleurstof als volgt voor: Hoechst 33342 bij 1,6 mM (1 mg/mL) in gedeïmiseerd water; calcein AM op 4 mM in watervrije DMSO; ethidium homodimer-1 bij 2 mM in DMSO/H2O (1:4, v/v). LET OP: De stock calcein AM en ethidium homodimer-1 oplossingen zijn opgenomen in de nota kit in Table of Materials.</li>
		<li>Bereid een enkele werkoplossing voor in HBSS of fenol roodvrij medium, met alle drie de kleurstoffen. Optimaliseer de uiteindelijke werkconcentratie voor elk celtype en -matrix, binnen het bereik van 1,6−8,0 μM voor Hoechst 33342, 0,1−10 μM voor calceine AM en 0,1−10 μM voor ethidium homodimer-1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijder kweekmedium en breng de werkbare heidskleurstofoplossing aan op gewenste microfluïde chips (75 μL in inlaat, 25 μL in uitlaat) en plaats 1 uur lang terug op de perfusierocker in de celkweek incubator.</li>
	<li>Afbeelding van de observatievensters van de gekleurde culturen met behulp van een handmatige of geautomatiseerde confocale microscoop(Tabel van materialen) met fluorescerende filters (vermeld als excitatie / emissie golflengten, in nm) alle kernen (Hoechst 33342, 350/461), dode celkernen (ethidium homodimer-1, 528/617) en levend celcytoplasma (calcein AM, 494/517) waar te nemen.</li>
	<li>Leg 140 μm Z-stacks vast met een stapgrootte van ≤1 μm met behulp van een 20x luchtdoelstelling. Er zijn drie gezichtsvelden nodig om het hele microkanaal met een kleine overlapafbeelding te maken. Om dubbele bemonstering te voorkomen, afbeelding slechts twee velden van de weergave per chip. OPMERKING: Beeldvormingscondities moeten worden geoptimaliseerd om een goede NyQuist-bemonstering te garanderen. In de ervaring van auteurs is een snel beeldvormingssysteem, gebaseerd op deconvolutie van een conventionele epifluorescentiebron of resonantiescanmodus op een confocale, noodzakelijk om een complete Z-stack, met drie laserkleuren, binnen een redelijke hoeveelheid tijd volledig te testen op een plaat (ongeveer 3,5 uur met geautomatiseerde beeldvorming, inclusief setup).</li>
	<li>Met behulp van software voor beeldanalyse u de Z-stack-afbeeldingen testen op de gewenste gekwantificeerde gegevens, zoals morfologie, aggregatiestatus of andere functies. Als u de levensvatbaarheid van cellen wilt kwantificeren, telt u het aantal dode cellen (rood) en de totale celkernen (blauw).</li>
</ol>

<ol><li>Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Generation+and+Application+of+Patient-Derived+Xenograft+Model+for+Cancer+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research+and+Treatment%3A+Official+Journal+of+Korean+Cancer+Association%22%5BJournal%5D)">The Generation and Application of Patient-Derived Xenograft Model for Cancer Research.</a> Cancer Research and Treatment: Official Journal of Korean Cancer Association. 50 (1), 1-10 (2018).</li>
<li>Malaney, P., Nicosia, S. V., Dave, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mouse%2C+one+patient+paradigm%3A+New+avatars+of+personalized+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">One mouse, one patient paradigm: New avatars of personalized cancer therapy.</a> Cancer Letters. 344 (1), 1-12 (2014).</li>
<li>Meehan, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX-MI%3A+Minimal+Information+for+Patient-Derived+Tumor+Xenograft+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">PDX-MI: Minimal Information for Patient-Derived Tumor Xenograft Models.</a> Cancer Research. 77 (21), 62-66 (2017).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel-Based+3D+Model+of+Patient-Derived+Prostate+Xenograft+Tumors+Suitable+for+Drug+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Hydrogel-Based 3D Model of Patient-Derived Prostate Xenograft Tumors Suitable for Drug Screening.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2040-2050 (2014).</li>
<li>Fong, E. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+in+vitro+model+of+patient-derived+prostate+cancer+xenograft+for+controlled+interrogation+of+in+vivo+tumor-stromal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A 3D in vitro model of patient-derived prostate cancer xenograft for controlled interrogation of in vivo tumor-stromal interactions.</a> Biomaterials. 77, 164-172 (2016).</li>
<li>Engel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+Acid-Based+Hydrogel+Formulations+Suitable+for+Automated+3D+High+Throughput+Drug+Screening+of+Cancer-Stromal+Cell+Cocultures%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic Acid-Based Hydrogel Formulations Suitable for Automated 3D High Throughput Drug Screening of Cancer-Stromal Cell Cocultures.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (11), 1664-1674 (2015).</li>
<li>Lanz, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapy+response+testing+of+breast+cancer+in+a+3D+high-throughput+perfused+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Therapy response testing of breast cancer in a 3D high-throughput perfused microfluidic platform.</a> BMC Cancer. 17 (1), 709(2017).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+compound+evaluation+on+3D+networks+of+neurons+and+glia+in+a+microfluidic+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput compound evaluation on 3D networks of neurons and glia in a microfluidic platform.</a> Scientific Reports. 6, 38856(2016).</li>
<li>Vulto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phaseguides%3A+a+paradigm+shift+in+microfluidic+priming+and+emptying%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Phaseguides: a paradigm shift in microfluidic priming and emptying.</a> Lab on a Chip. 11 (9), 1596-1602 (2011).</li>
<li>Patru, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD133%2C+CD15%2FSSEA-1%2C+CD34+or+side+populations+do+not+resume+tumor-initiating+properties+of+long-term+cultured+cancer+stem+cells+from+human+malignant+glio-neuronal+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">CD133, CD15/SSEA-1, CD34 or side populations do not resume tumor-initiating properties of long-term cultured cancer stem cells from human malignant glio-neuronal tumors.</a> BMC Cancer. 10, 66(2010).</li>
<li>Harma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+panel+of+three-dimensional+models+for+studies+of+prostate+cancer+growth%2C+invasion+and+drug+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses.</a> PLoS One. 5 (5), 10431(2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een methode voor het verwerken en kweken van levensvatbare PDX-afgeleide tumorcellen in een hoge doorvoer, geperfuseerd 3D-kweeksysteem. Hoewel dit protocol pca PDX-weefsel gebruikt, is het even effectief voor andere epitheliale tumoren. Tumorkenmerken variëren tussen individuele PDX-lijnen, zelfs binnen hetzelfde weefsel van oorsprong (prostaat, borst, enz.). Sommige PCa PDX lijnen zijn meer fibrotische en moeilijk te isoleren levensvatbare cellen uit, terwijl anderen zijn meer cellulaire. De tumor g...

In de afgelopen tien jaar heeft het gebied van kankeronderzoek aangetoond hernieuwde enthousiasme voor patiënt-afgeleide xenografts (PDXs) als een instrument voor de beoordeling van kankercel traject afhankelijkheid en drug gevoeligheid1. De meest voorkomende PDX-modellen worden vastgesteld door onderhuidse of orthotopische implantatie van menselijke tumorcellen - een tumorfragment, een cluster van gescheiden tumorcellen of een monster van geïsoleerde circulerende tumorcellen (CTC's) -in een knaagdierhost. Als de tumor "nemen" succesvol is, zullen de xenograft cellen zich vermenigvuldigen, vasculariseren en anderszins interageren met het gastheerweefsel om een tumor te creëren, die kan worden geoogst op een optimale grootte, onderverdeeld en opnieuw geïmplanteerd in andere gastheren. Onder hun vele voordelen als modelsysteem behouden PDX's doorgaans een aanzienlijk deel van de heterogeniteit van de inheemse tumorcelpopulatie en maken het de beoordeling van mensspecifieke trajecten en celreactiesmogelijk 2,3. De in vivo context maakt tumorinteractie met vasculatuur en andere aangrenzende stroma mogelijk en recapituleert weefselkenmerken zoals drugsdiffusiedynamiek, zuurstofspanning en extracellulaire matrix die de progressie van de tumor biologisch en mechanisch beïnvloeden. Een negatief aspect van PDXs is hun afhankelijkheid van een knaagdier gastheer, zowel voor tumor expansie en uiteindelijk voor hypothese testen. Omdat veel PDX's zich niet kunnen aanpassen aan de traditionele tweedimensionale (2D)-cultuur op weefselkweek polystyreen zonder veel van hun wenselijke kenmerken te verliezen, is er een minimale middenweg voor onderzoekers tussen deze relatief gecontroleerde in vitro-methode en de aanzienlijke toename van de kosten, faciliteiten en tijdsvereisten voor in vivo PDX-gebruik.
We hebben meerdere in vitro modellen beschreven die 3D-celcultuur implementeren binnen een ondersteunende matrix, en onlangs uitgebreid dat werk aan te tonen de ex vivo cultuur van meervoudige prostaatkanker (PCa)-afgeleide PDX's, zowel alleen als in co-cultuur met beenmerg-afgeleide fibroblasten4,5. Hyaluronzuur (HA)-gebaseerde hydrogelmatrices bieden aanpasbare en biologisch relevante ondersteuning voor beide celtypen, met facile controle over hydrogelkenmerken en optische helderheid voor beeldvorming door de hydrogeldiepte6.
Volwassen PDX tumorweefsels bestaan uit een variabel mengsel van heterogene menselijke kankercellen en muisstroma (fibroblasten, endotheelcellen, enz.). Om cel-type specifieke bijdragen aan tumorprogressie in vitro te bestuderen, kan het voordelig zijn om tumoren te scheiden, de celpopulaties te scheiden en experimenteel op een georganiseerde manier op te nemen om trajecten van intercellulaire communicatie te ontleden. De gemengde celpopulaties in weefselvertgates hebben differentiële compatibiliteit met specifieke kweekomstandigheden. Bijvoorbeeld, tumor-geassocieerde fibroblast levensvatbaarheid vereist ofwel oppervlak aanhankelijkheid of 3D matrices gefunctionaliseerd met integrin liganden, terwijl epitheel-afgeleide PDX cellen hebben meestal niet deze eisen, in plaats daarvan ten gunste van celcel interacties. Deze verschillen kunnen worden benut om een effectieve scheiding van PDX-cellen van besmettende muisstromalcellen te bereiken. Rotatiecultuur van weefselvert verteert maakt stromale celtrouw aan het weefselkweekoppervlak mogelijk, terwijl celcelverklevingen PDX-cellen drijven die boven het roterende kweekoppervlak zweven om meercellige clusters in het supernatant te vormen in 24−48 uur. De specifieke kenmerken van deze clusters variëren met de PDX (bijvoorbeeld grote, strakke, zeer bolvormige clusters of kleinere, lossere aggregaten die lijken op trossen druiven), maar zijn meestal van biologisch relevante afmetingen (50−250 μm diameter), voldoende voor het beoordelen van cellulaire interacties die afhankelijk zijn van intercellulaire contacten.
Tumor retrieval en verwerking onvermijdelijk resulteert in een zekere mate van collateral cell dood, hetzij als gevolg van schade op korte termijn van mechanische / enzymatische verstoring, of op lange termijn onverenigbaarheid van subpopulaties met de gekozen cultuur voorwaarden. Ondanks het nut van rotatiecultuur als eerste bulkscheiding, worden dode of stervende cellen onvermijdelijk overgebracht met de PDX clusters en kunnen de resulterende cultuur beïnvloeden. Deze dode cellen zijn vaak individuele PDX cellen die niet werden geïntegreerd in een cluster, muis stromale fibroblasten die niet kunnen overleven in geselecteerde cultuuromstandigheden, of bijzonder fragiele endotheelcellen. Dergelijke stervende cellen kunnen experimentele resultaten van "overlevenden" beïnvloeden en kunnen een aanzienlijke invloed hebben op kwantificering, bijvoorbeeld via fluorescerende op beelden gebaseerde screeningtesten op basis van beeld. Om de selectie van levende PDX-cellen uit deze methode te verbeteren, hebben we centrifugatiemethoden aangepast met dichtheidsstappen om individuele dode/stervende cellen gemakkelijk te verwijderen uit PDX-mengsels en overwegend levende meercellige clusters te behouden.
Om de studie van resulterende PDX-afgeleide clusters in de 3D-cultuur te verbeteren, hebben we gebruik gemaakt van een microfluidics-gebaseerde perfusiecultuurplatform, de OrganoPlate (figuur 1), een hoog-doorvoerorgaan-op-een-chip-platform dat simultane cultuur van maximaal 96 individuele perfusie, 3D-culturen op een 384-wellitert microbordbasis (Figuur 1A)7,8. In de 2-baans microfluidic plaat wordt een enkele weefselchip verbonden door twee microfluïde kanalen (Figuur 1B, gelkanaal: rood, perfusiekanaal: blauw) die vier putten op een rij omspannen. De twee microfluidic kanalen worden gescheiden door een korte plastic nok genaamd een Phaseguide die overloop van een kanaal in zijn aangrenzende buurman kanaal voorkomt, en tegelijkertijd zorgt voor een membraan-vrije interface tussen de inhoud van de gel en perfusie kanaal9. Omdat de bodem van de microfluidic plaat bestaat uit microfluïde glas, kunnen de culturen in het observatievenster via de bodem van de plaat worden bekeken met een standaard of geautomatiseerde microscoop. Perfusie is gevestigd in de microfluïde plaat met een programmeerbare rocker, met behulp van de zwaartekracht om media te rijden door de microfluïde kanalen, tussen reservoirputten (Figuur 1C). De perfusie stroom-nabootst meer samenvatten de tumor micromilieu dan statische cultuur, waardoor voor de integratie van schuifspanning en verbeterde distributie van gassen en voedingsstoffen. De voordelen van het behoud van een geperfundeerde kankercelcultuur in de microfluïde plaat zijn eerder beschreven als geperfundeerde borstkankerculturen die een optimale levensvatbaarheid vertoonden in vergelijking met een statische 3D-cultuur van dezelfde cellen7.
Het onderhavige rapport beschrijft een aangepaste dichtheidsgradiëntcentrifugatiemethode voor het isoleren van levende meercellige PDX-clusters en toont zijn nut bij het vestigen van 3D PDX-culturen binnen perfusable microfluïde platen. Omdat een toenemend aantal onderzoekslaboratoria methoden zoekt om het gebruik van PDX te vergemakkelijken, verwachten we dat de hier gepresenteerde protocollen van onmiddellijke nut zullen zijn.

<table><tbody><tr><td>1N NaOH</td><td></td><td></td><td>elke geschikte weefselkweekkwaliteit</td></tr><tr><td>60 mm ronde weefselkweekschalen</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>6-well weefselkweekplaten</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>70 &micro;m celstrainers</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5810R met geschikte rotor en emmers voor 15/50 mL kegelcentrifugebuizen</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Dichtheidsgradiënt centrifugatie oplossing</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644</td><td>Percoll</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td></td><td></td><td>elke geschikte weefselkweekkwaliteit</td></tr><tr><td>Dissociatie-enzymoplossing</td><td>StemCell Technologies</td><td>07921</td><td>ACCUMAX</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11039021</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Pincetten</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>HA hydrogel kit</td><td>ESI BIO</td><td>GS311</td><td>HyStem (Hyaluronzuur-SH en PEGDA)</td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution</td><td>Lonza</td><td>10-527F</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Heat-inactivated foetaal bovien serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B Hausser BrightLine</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>H1398</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Beeldverwerkingssoftware</td><td>Oxford Instruments</td><td>Imaris 9.3</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Cell Viability/Cytotoxicity Kit (Calcein-AM/Ethidium Homodimer-1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Microfluidische kweekplaat</td><td>Mimetas</td><td>9603-400-B</td><td>2-lane OrganoPlate</td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Meerkanaals pipet</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>PDX-afgeleid tumorweefsel</td><td></td><td></td><td>verkregen onder IRB-goedkeuring voor menselijk weefsel en IACUC-goedkeuring voor dierlijke gastheer</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Perfusie rocker</td><td>Mimetas</td><td>OrganoPlate Perfusion Rocker Mini</td><td></td></tr><tr><td>pH strips (pH 5-9)</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde zoutoplossing</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Schermessen</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>Roterende xy-shaker</td><td>VWR</td><td>Advanced 3500 Orbital Shaker</td><td>of gelijkwaardig</td></tr><tr><td>Scalpelgreep</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>Eenkanaals herhaalpipet</td><td>Eppendorf</td><td>22260201</td><td></td></tr><tr><td>Steriele, 15mL kegelcentrifugebuizen</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr><tr><td>Steriele, 50mL kegelcentrifugebuizen</td><td></td><td></td><td>elke geschikte</td></tr></tbody></table>

verbeterde levensvatbaarheid voor ex vivo 3d hydrogel culturen van patiënt-afgeleide xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Patiënt-afgeleide xenografts (PDX), gegenereerd wanneer resected patiënt tumorweefsel rechtstreeks wordt geënt in immuungecompromitteerde muizen, blijven biologisch stabiel, waardoor het behoud van moleculaire, genetische en histologische kenmerken, evenals heterogeniteit van de oorspronkelijke tumor. Echter, het gebruik van deze modellen om een veelheid van experimenten uit te voeren, met inbegrip van screening op geneesmiddelen, is onbetaalbaar, zowel in termen van kosten en tijd. Driedimensionale (3D) cultuursystemen worden algemeen gezien als platforms waarin kankercellen hun biologische integriteit behouden door middel van biochemische interacties, morfologie en architectuur. Ons team heeft uitgebreide ervaring met het kweken van PDX cellen in vitro met behulp van 3D matrices bestaande uit hyaluronzuur (HA). Om muisfiblast stromalcellen in verband met PDX's te scheiden, gebruiken we rotatiecultuur, waarbij stromale cellen zich hechten aan het oppervlak van weefselkweekbehandelde platen terwijl gescheiden PDX-tumorcellen zweven en zichzelf associëren in meercellige clusters. Ook drijvend in de supernatant zijn enkele, vaak dode cellen, die een uitdaging vormen bij het verzamelen van levensvatbare PDX-clusters voor downstream inkapseling in hydrogels voor 3D-celcultuur. Om deze enkele cellen te scheiden van levende celclusters, hebben we dichtheidsstapgradiëntcentrifugatie gebruikt. Het hier beschreven protocol zorgt voor de uitputting van niet-levensvatbare enkele cellen uit de gezonde populatie van celclusters die zullen worden gebruikt voor verdere in vitro experimenten. In onze studies nemen we de 3D-culturen op in microfluïde platen die mediaperfusie tijdens de cultuur mogelijk maken. Na de beoordeling van de resulterende culturen met behulp van een fluorescerende image-based levensvatbaarheidstest van gezuiverde versus niet-gezuiverde cellen, tonen onze resultaten aan dat deze extra scheidingsstap het aantal niet-levensvatbare cellen uit onze culturen aanzienlijk verminderde.

Een programmeerbare perfusie rocker werd bereid in een standaard water-jacked cel cultuur incubator, en twee-lane microfluïde platen werden bereid in een standaard biosafety kast voor het laden (Figuur 1). Een MDA-PCA-118b PDX tumor werd uitgebreid in vivo, geoogst wanneer het een maximale grootte had bereikt, en gescheiden zoals beschreven in protocol sectie 2 om een drijfmest suspensie van cellen te creëren, op ongeveer een eencellige toestand (Figuur 2A). De ...

Dit protocol toont methoden om een uitgebreide in vitro cultuur van patiënt-afgeleide xenografts (PDX) mogelijk te maken. Een stap verbetert de algehele levensvatbaarheid van meercellige clusterculturen in 3D hydrogels, door eenvoudige verwijdering van niet-levensvatbare enkele cellen. Een secundaire stap toont best practices voor PDX-cultuur in een geperfundeerd microfluïdisch platform.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Verbeterde kweekmethoden voor door patiënten afgeleide tumormonsters zijn van cruciaal belang omdat het veld zich afbeweet van het gebruik van conventionele cellijnen. Dit protocol maakt de in vitro cultuur van patiënt-afgeleide tumorcellen in een platform dat vatbaar is voor een hoge doorvoer en hoge inhoud screening, in tegenstelling tot in vivo kanker modellen. Het platform met PDXs stelt ons in staat om meer heterogene systemen te beoordelen die reflecteren op inheemse tumoren.Dit kan inzicht geven in medicijnmechanismen en snellere screening van geneesmiddelen mogelijk maken. De methode kan worden uitgebreid door de integratie van stroma, endotheel en immuuncellen. Deze co-culturen kunnen nog meer een afspiegeling zijn van de inheemse tumorpopulatie en architectuur.Oefen het laden van de microfluïde platen met gemakkelijk uitgevouwen cellijnen om zeer bedreven te worden voordat u overstapt op meer kostbare cellen zoals PDXs. Uitlijning tijdens plaatdosering heeft grote gevolgen voor het succes en een visuele demonstratie kan dit concept gemakkelijk overbrengen. Om te beginnen, overdracht tumorweefsel naar een vooraf gewogen steriele 50-milliliter conische buis.Spoel zes keer met 30 milliliter steriele PBS om bloed en verontreinigingen te verwijderen. Verwijder zoveel mogelijk vloeistof, en weeg het tumorweefsel. Breng het tumorweefsel naar een 60-millimeter ronde weefselkweekschotel en gebruik een steriel scheermesje of een scalpel om het in stukken van één millimeter te hakken.Voeg vijf milliliter PDX-verwerkingsmedium toe om de tumordrijfmest te verzamelen. Voeg vijf milliliter dissociatie enzym oplossing om de tumor drijfmest te verzamelen. Spoel de kweekschotel af met nog eens vijf milliliter dissociatieenzymoplossing.Voeg vervolgens vijf milliliter PDX-verwerkingsmedium toe. Incubeer 20 minuten bij 37 graden Celsius met zacht schudden. Halverwege de incubatietijd, draai de buis zachtjes.Na incubatie, pipet op en neer zachtjes met een serologische pipet te breken klonten. Plaats een 70-micron cel zeef over een nieuwe steriele 50-milliliter buis, en filter de cellen. Dan centrifugeren bij 1, 200 rpm gedurende twee minuten om de cellen pellet.Verwijder de supernatant en resuspend in twee tot drie milliliter pdx cultuur medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of geautomatiseerde cel teller. Gebruik deze tabel om het vereiste aantal van de bijbehorende PDX-afgeleide cellen te schatten die nodig zijn om de gewenste celdichtheid per chip te bereiken.Plaat een tot twee keer 10 tot de zes cellen in vijf milliliter PDX cultuurmedium per put van een zes-goed weefsel kweekplaat. Incubeer gedurende 48 uur bij 37 graden Celsius, 5% kooldioxide en 95% vochtigheid met zacht schudden bij 50 tot 55 rpm om clustervorming te bevorderen. Nadat de clusters zijn gevormd, ga je over tot centrifugatie.Bereid eerst 20 milliliter van 100% dichtheidgradiëntoplossing voor door grondig 18 milliliter dichtheidsgradiëntecentrifugatieoplossing met twee milliliter steriele 10X HBSS in een steriele conische buis van 50 milliliter te mengen. Verdun deze 100%-oplossing met steriele 1X HBSS om 10 milliliter per stuk 20%30%40% en 55% dichtheidgradiëntoplossingen te maken. Voeg drie milliliter van 55% dichtheid gradiënt oplossing aan de onderkant van een 15-milliliter conische buis.Houd de buis onder een hoek, langzaam afzien van drie milliliter van 40% dichtheid gradiënt oplossing op de schuine kant van de buis en op de top van de 55%-laag. Herhaal dit met de 30%-dichtheidsgradiëntoplossing. Verzamel vervolgens de supernatant van PDX-rotatieculturen met een serologische pipet van vijf milliliter in een buis, waarbij het plaatoppervlak voorzichtig wordt spoelen.Centrifuge bij 1,200 tpm gedurende twee minuten naar pelletcellen. Verwijder de supernatant, en resuspend de cel pellet in drie milliliter van 20% dichtheid gradiënt oplossing. Leg de 20%-dichtheidsgradiëntoplossing voorzichtig met cellen op de bovenkant van het verloop in de buis van 15 milliliter.Dop de buizen en centrifuge in een swing-emmer rotor centrifuge 30 minuten op vier graden Celsius, 2,000 keer G, en nul pauze. Na centrifugatie zijn breuken zichtbaar. Levensvatbare PDX-celculturen worden meestal gevonden op de 40 tot 55% dichtheidsgradiëntoplossingsinterface.Verzamel twee tot drie milliliter van elke fractie in verse buizen van 15 milliliter. Voeg drie tot vier volumes steriele 1X HBSS toe aan elke fractie en om te keren om grondig te mengen. Centrifuge op 1.000 keer G gedurende drie minuten om de cellen te pelleteren.Verwijder de supernatant. Resuspend de cel pellet in een tot twee milliliter van PDX processing medium. Breng een kleine aliquot tussen 50 tot 100 microliter in een buis, en voeg een gelijk volume van dissociatie enzym oplossing voor redissociatie.Beoordeel het celnummer in de geclusterde celsuspensie. Tel de cellen met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller. Reconstitute hyaluronzuur hydrogel oplossingen volgens de instructies van de fabrikant.Voeg met behulp van een multi-channel pipet 50 microliters hbss toe aan alle putten in observatievensterkolommen van een tweebaans microfluïde plaat om de vochtigheid van de cultuur en optimale beeldvormingsomstandigheden te behouden. Bereken het volume van de celsuspensie die nodig is voor 50 microliters hydrogel bij de gewenste celdichtheid, bijvoorbeeld 5.000 cellen per microliter. Voor het zaaien van een microfluïde plaat, aliquot het berekende volume in elk van vier steriele 1,5-milliliter centrifuge buizen.Pas de pH van de HA thiol-oplossing onmiddellijk voor gebruik in op acht met 1 normale natriumhydroxide. Voer een testgelatie uit door 40 microliter ha thiol met 10 microliter PEGdA te mengen en gelatie na verloop van tijd te monitoren. Vervolgens centrifugeren de cel suspensie aliquots gedurende twee minuten op 200 keer G en kamertemperatuur om de cellen pellet.Verwijder voorzichtig de supernatant, en resuspend de cellen in 40 microliter van HA thiol voor een 50-microliter eindvolume. Voeg 10 microliter PEGdA toe aan een aliquot van de cellen van HA thiol. Meng goed, en wacht een tot drie minuten voordat het zaaien van de microfluïde plaat.Breng een tip aan voor het afgeven van 1,5 microliter op een single-channel herhalende pipet en laad met de cellen in HA hydrogel-oplossing. Vergeet niet om de waterstof aliquot goed gemengd te houden om zelfs celdistributie te garanderen. Om de microfluidic plaat te zaaien, lijnt u de pipetpunt loodrecht op het blad uit terwijl u de punt voorzichtig in het midden van de gelinlaat plaatst om contact te garanderen, maar geen druk bij het afgeven van 1,5 microliter hydrogeloplossing.Let op de vulstatus van de microfluïde kanalen door vanaf de bovenkant van de plaat, de onderkant van de plaat of per microscoop te bekijken. Beoordeel de belasting met behulp van dit cijfer als een gids. Het ene moment na het laden, omkeren van de plaat tijdens de voorbereiding voor de volgende aliquot.Herhaal het zaaien van de microfluïde plaat voor de overige drie aliquots van cellen in HA-oplossing. Nadat alle chips zijn gevuld, incubeer de plaat op 37 graden Celsius in een bevochtigde couveuse 45 minuten tot gelatie is voltooid. Zorg er daarna met behulp van de meegeleverde handleiding voor dat de perfusierocker in de celkweek incubator wordt geïnstalleerd met de juiste oversmeerstandinstelling onder een hoek van 14 graden en intervallen van vier minuten.Voeg 50 microliter PDX-celkweekmedium toe aan alle medium inhammen. Tik de plaat voorzichtig tegen een oppervlak om de vloeistof aan te moedigen om de microfluïde kanalen te vullen. Draai vervolgens de plaat om te controleren of de kanalen goed zijn gevuld.Voeg 50 microliter DMEM/F-12 toe voor alle mediakanalen. Als er luchtbellen in het perfusiekanaal zitten, verwijder dan door zachtjes op de plaat tegen een oppervlak te tikken. Met behulp van een microscoop en plaat lay-out vorm, record chip vullen succes.Sluit verkeerd gevulde chips uit voor verder experimenteel gebruik. Plaats de plaat op een kantelende tuimelschakelaar ingesteld op een 14-graden kantelen en een cyclus van vier minuten om perfusie te beginnen. Elke twee dagen, vervang de PDX cultuur medium, eerst 50 microliter in de inhammen, dan 50 microliter in de verkooppunten.In deze studie werd een programmeerbare perfusierocker geïnstalleerd in een standaard celkweek incubator met waterjas, en tweebaans microfluïde bladen werden bereid in een standaard bioveiligheidskast voor het laden. 3D microfluïde PDX cultuur levensvatbaarheid en morfologie werden geëvalueerd in zowel ongescheiden en dichtheid-gradiënt centrifugatie-gescheiden omstandigheden. Op dag één, die culturen die de scheidingsmethode ondergingen tentoonstelden tienvoudige minder enige dode cellen in vergelijking met ongescheiden culturen.Belangrijk is dat de gescheiden clusters voornamelijk bestonden uit levende cellen. Er is geen statistisch significant verschil vastgesteld voor de clustergrootteverdeling. Culturen werden verder gehandhaafd in de microfluïde plaat voor zeven dagen.Het totale aantal levende cellen bleef consistent en clusters behielden ongeveer 80% levensvatbaarheid gedurende het leven van de cultuur. Vergeet niet dat elke PDX-lijn uniek is, dus het gemak van tumorvertering, de fenotypische grootte en morfologie van clusters, en de locatie van het cluster binnen de gradiëntzuivering zal variëren. PDX culturen vastgesteld met behulp van deze methode kan worden getesteerd met beeld-of plaat-reader-gebaseerde levensvatbaarheid testen, vast en immunofluorescently gelabeld, of gescheiden om cel lysates te verzamelen voor andere protocollen.De methode zal onderzoekers in staat stellen om de tumor micro-omgeving samen te vatten om biologie of drug reactie van tumorcellen te verkennen. Gebruikers moeten de standaard training voor menselijke proefpersonen en door bloed overgedragen pathogenen voltooien voordat ze met door mensen afgeleide weefsels worden gevolgd. Er moeten passende persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen.

enhanced-viability-for-ex-vivo-3d-hydrogel-cultures-patient-derived

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Een methode om cultuur een endotheelcel monolaag het gehele inwendige oppervlak van een 3D microfluïdische apparaat met microvasculaire grootte kanalen (&lt;30 pm) beschreven.

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Dit manuscript bevat een spuitgiet methode om microvaten dat fysiologische eigenschappen van endotheel recapituleren ingenieur. De microfluïdische-based proces creëert patent 3D vasculaire netwerken met tailorable omstandigheden, zoals stroom, cellulaire samenstelling, geometrie, en biochemische hellingen. Het fabricageproces en voorbeelden van mogelijke toepassingen worden beschreven.

Micropatterning en montage van 3D microvaten

Dit is een methode om een ​​3-dimensionale celcultuur scaffold aan pulmonale extracellulaire matrix te creëren. Intact long verwerkt tot hydrogelen die de groei van cellen in drie dimensies kan ondersteunen.

Tunable Hydrogels van Pulmonary extracellulaire matrix voor 3D-Cell Culture

Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.

Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Endotheliale voor ouders die zijn afgeleid van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC-EPs) hebben het potentieel om de behandeling van cardiovasculaire aandoeningen te revolutioneren en om de creatie van meer getrouwe cardiovasculaire ziekte modellen mogelijk te maken. Hierin wordt de inkaping van iPSC-EPs in driedimensionale (3D) collageen micro omgevingen en een kwantitatieve analyse van het vasculogene potentieel van deze cellen beschreven.

Een in vitro 3D-model en computationele pijpleiding om het Vasculogenic potentieel van door iPSC afgeleide Endotheelprogenitors te kwantificeren

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Het huidige protocol beschrijft een experimenteel platform om de effecten van mechanische en biochemische signalen op chemotherapeutische reacties van patiënt-afgeleide glioblastoomcellen in 3D matrix-mimetische culturen te beoordelen met behulp van een op maat gemaakt UV-verlichtingsapparaat dat high-throughput photocrosslinking van hydrogels met instelbare mechanische kenmerken mogelijk maakt.

Hydrogel-arrays maken een verhoogde doorvoer mogelijk voor screeningseffecten van matrixcomponenten en therapeutica in 3D-tumormodellen

Een in vitro model van de vasculaire niche van het beenmerg wordt vastgesteld door mesenchymale en endotheelcellen te zaaien op pre-cast 3D PEG-hydrogels. De endotheelnetwerken, ECM-componenten en ALP-activiteit van de niches variëren afhankelijk van de gebruikte groeifactor. Het platform kan worden gebruikt voor geavanceerde kankermodellen.

Eenvoudige oprichting van een gevasculariseerde osteogene beenmergniche met behulp van pre-cast poly (ethyleenglycol) (PEG) hydrogels in een beeldvormende microplaat

Dit protocol presenteert de opzet en werking van een nieuw ontwikkelde, 3D-geprinte bioreactor voor de ex vivo kweek van bloedvaten in perfusie. Het systeem is ontworpen om gemakkelijk door andere gebruikers te worden overgenomen, praktisch, betaalbaar en aanpasbaar aan verschillende experimentele toepassingen, zoals basisbiologie en farmacologische studies.

Ex Vivo Perfusiecultuur van grote bloedvaten in een 3D-geprinte bioreactor

Leer verbeterde methoden voor ex vivo 3D-hydrogelkweek van patiënt-afgeleide xenografts op een geperfuseerd microfluïdisch platform. Deze techniek verhoogt levensvatbaarheid en ondersteunt high-throughput screenings voor oncologisch onderzoek.

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform (Video) | JoVE Journal

Verbeterde levensvatbaarheid voor Ex vivo 3D Hydrogel Culturen van patiënt-afgeleide Xenografts in een perfused microfluïdisch platform

Meer video's verkennen