Gecombineerde infusie en stimulatie met Fast-Scan cyclische voltammetrie (CIS-FSCV) om ventrale tegmentale gebiedsreceptorregulatie van fasische dopamine te beoordelen

Deze aanpak kan helpen om de rol van specifieke ventrale tegmentale gebied, somatodendritische receptoren en fasische dopamine-afgifte in de nucleus accumbens te verduidelijken. Het grote voordeel van deze aanpak is dat vragen over de controle van receptorfunctie over fasische dopamine-afgifte kunnen worden aangepakt in de intacte hersenen. Het optimaliseren van de koolstofvezelmicro-elektrode en de locatie van de bipolaire stimulator kan een uitdaging zijn, en een advies voor beginners is om te beginnen met opnemen in het dorsale striatum.

Vanwege het gebruik en de manipulatie van meerdere soorten elektroden, inclusief opname-, referentie- en stimulerende elektroden, zal een visuele gids van wanneer en waar deze elektroden worden geïmplanteerd nuttig zijn. Na bevestiging van een gebrek aan reactie op de pedaalreflex, maak de schedel van een verdovingsmiddel ondergaande rat schoon met drie opeenvolgende jodopovidonej en 70% ethanol scrubs. Na de laatste scrub, gebruik gesteriliseerde pincet en chirurgische schaar om voldoende schedelweefsel weg te snijden om ruimte te maken voor de geïmplanteerde elektroden.

Maak voorzichtig het blootgestelde schedeloppervlak schoon met gesteriliseerde wattenstaafjes voordat u twee tot drie druppels 3% waterstofperoxide aanbrengt om lambda en bregma te helpen identificeren. Gebruik vervolgens een boortje van één millimeter ingesteld op ongeveer 20.000 omwentelingen per minuut om een gat van 1,5 millimeter diameter te maken, 2,5 millimeter anterieur en 3,5 millimeter lateraal van de bregma. Implanteer een schroef met een buitendiameter van 1,59 millimeter en een lengte van 3,2 millimeter ongeveer halverwege het gat tot de schroef stevig op zijn plaats is.

Boor vervolgens een referentie-elektrodegat met een diameter van één millimeter in de linkerhemisfeer, 1,5 millimeter anterieur en 3,5 millimeter lateraal van de bregma. Breng ongeveer twee millimeter referentiedraad in het gat terwijl u de draad om en onder de kop van de geïmplanteerde schroef wikkelt. Implanteer vervolgens de schroef volledig en zet de referentie-elektrode op zijn plaats.

In de rechterhemisfeer, boor een gat met een diameter van 1,5 millimeter, 1,2 millimeter anterieur en 1,4 millimeter lateraal van de bregma, en gebruik pincet om de dunne buitenste laag van het hersenmembraan voorzichtig te verwijderen. Voor de stimulerende elektrode, boor een vierkant gat van twee millimeter anterieur-posterieur en vijf millimeter mediaal-lateraal gecentreerd op 5,2 millimeter posterieur en één millimeter lateraal van de bregma. Gebruik stereotactische armstaven om de bipolaire stimulerende elektrode-geleidercannula vijf millimeter onder de dunne buitenste laag van het hersenmembraan te laten zakken.

Gebruik de stereotactische armstaven om de koolstofvezelmicro-elektrode vier millimeter onder de dunne buitenste laag van het hersenmembraan op de meest dorsale delen van het striatum te laten zakken en verbind de referentiedraad en de koolstofvezel met een potentiostaat. Breng vervolgens een min 0,4 tot 1,4 volt, 400 volt per seconde driehoekige golfvorm aan gedurende 15 minuten bij 60 Hertz, gevolgd door een 10-minuten stimulatie bij 10 Hertz. Om de locatie van de stimulerende elektrode te optimaliseren, stelt u de stimulator in om een bipolaire elektrische golfvorm te produceren met een frequentie van 60 Hertz, 24 pulsen, 300 microamp stroom en een pulsbreedte van twee milliseconden per fase.

Laat de stimulator voorzichtig in stappen van 0,2 millimeter zakken van 5 tot 7,8 millimeter onder de dunne buitenste laag van het hersenmembraan, waarbij de VTA bij elke stap wordt gestimuleerd. Blijf de bipolaire stimulerende elektrode-geleidercannula laten zakken tot een stimulatie fasische dopamine-afgifte produceert bij de koolstofvezelmicro-elektrode binnen het dorsale striatum. Zodra een dopamine-afgifte is waargenomen, laat de koolstofvezelmicro-elektrode zakken tot deze zich op zijn minst zes millimeter onder de dunne buitenste laag van het hersenmembraan in het meest dorsale deel van de nucleus accumbens kern bevindt.

Wanneer de elektrode op zijn plaats is, stimuleert u de VTA en neemt u de piekamplitude van de dopaminepiek op, vervolgens laat u de koolstofvezelmicro-elektrode zakken of stijgen tot de site die de grootste dopamine-afgifte produceert, waarbij u ervoor zorgt dat de piek van de dopaminerespons wordt weergegeven als een duidelijke oxidatiepiek bij 0,6 volt en een reductiepiek bij min 0,2 volt. Zodra de locatie van de koolstofvezel en de stimulerende elektrode-geleidercannula is geoptimaliseerd, stimuleert u het dier om de drie minuten gedurende 20 tot 30 minuten. Nadat een stabiele basislijn is bereikt, laat u de interne cannula voorzichtig met de hand in de geleidercannula zakken die vooraf in de bipolaire stimulator is geplaatst en verkrijgt u nog eens twee tot drie basislijnopnamen om te bevestigen dat de cannula-inbreng geen verandering in het opgewekte signaal heeft veroorzaakt.

Zodra een basislijnrespons is vastgesteld, gebruikt u een spuitpomp en een microspuit om 0,5 microliters van de oplossing van het geneesmiddel van belang in de VTA te infunderen gedurende een periode van twee minuten. Laat na de infusie de interne cannula gedurende ten minste één minuut op zijn plaats voordat u hem verwijdert en blijf de respons om de drie minuten opnemen om de effecten na de infusie te meten. Zoals aangetoond in deze representatieve kleurenplots, verandert infusie met zoutoplossing niet de gestimuleerde fasische dopamine-afgifte.

De infusie van NMDA produceert een robuuste toename van de gestimuleerde fasische dopamine-afgifte, terwijl de NMDA-receptorcompetitieve antagonist, AP5, een robuuste afname produceert. Zowel de niet-competitieve nicotine acetylcholinereceptor-antagonist mecamylamine als de niet-selectieve competitieve muscarine acetylcholinereceptor-antagonist scopolamine produceren een robuuste afname in de gestimuleerde fasische dopamine-afgifte. In deze grafiek kan een samenvatting van de effecten van de geteste geneesmiddelen in de tijd worden waargenomen.

De infusiecannula moet zorgvuldig in de bipolaire stimul