Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay
26 juli 2021
Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.
Dit protocol maakt het mogelijk om eenvoudig grootschalige lipide nanobuisnetwerken te genereren waarin de individuele nanobuisjes fasescheidingsgedrag vertonen dat vergelijkbaar is met dat van het moederblaasje. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat we het werk van de moleculaire motoren coöpteren om de lipide nanobuisjes zelf op een zeer parallelle manier en zonder menselijke tussenkomst te assembleren. Om een glijdende motiliteitstest op te zetten, bevestigt u eerst drie sets dubbelzijdige tapestrips op een glazen schuif die vijf millimeter uit elkaar ligt.
Druk voorzichtig op een afdekplaat op de tape en voeg 30 microliter kinesineoplossing van één micromolair toe aan de voorbereide stroomcel. Voeg na vijf minuten 30 microliter van een 10-microgram / milliliter microtubulioplossing toe aan de cel en druk zachtjes op een laboratoriumdoekje tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal om de uitwisseling van de oplossing te vergemakkelijken. Was de cel na nog eens vijf minuten incubatie één tot drie keer met 50 microliter motiliteitsoplossing op kamertemperatuur per wasbeurt voordat u 30 microliter streptavidinoplossing van 10 microgram/milliliter aan de stroomcel toevoegt.
Voeg na 10 minuten 30 microliter van een 10X GUV-oplossing toe voor een incubatie van 30 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens twee microliter van een AMP-PNP-oplossing van 100 millimolair toe en sluit de kamer met kit. Breng de stroomkamer over naar een omgekeerde microscoop voor beeldvorming en selecteer de juiste filterset.
Gebruik een olieobjectief van 100X om eerst het oppervlak van de afdekslip scherp te stellen voordat u een afbeelding van een interessant netwerk krijgt. Open vervolgens de afbeelding in ImageJ en klik op Afbeelding, Kleur en Samenstelling om de rode en groene kanalen te bedekken om een samengestelde afbeelding te maken. Open na de beeldvorming de gewenste afbeelding en klik op Analyseren en schaal instellen om de schaal voor de microscoop te kalibreren.
Vul de pixels in op de conversiefactor van de micrometer en klik op OK. Gebruik het meerpuntslijngereedschap om de nanobuisjes te traceren vanaf de bovenliggende GUV en houd Control en M ingedrukt om de lengte te meten. De beeldverwerkingstool slaat elke nieuwe meting op in het resultatenvenster. Wanneer alle buizen zijn gemeten, selecteert u Afbeelding, Aanpassen en Drempel en klikt u op Toepassen om de drempel toe te passen.
Teken vervolgens een rechthoek van bekende lengte over de gewenste buis. Als u de geïntegreerde dichtheid van het gebied wilt meten, klikt u op Analyseren en meten Om de lipideverdeling in de vloeibare nanobuisknooppunten te bepalen, gebruikt u het lijngereedschap om een lijn over het knooppunt van belang te tekenen en de knooppuntintensiteit in zowel het groene als het rode kanaal te meten. In deze representatieve analyse werden vloeibare nanobuisnetwerken gefabriceerd, waarvan is aangetoond dat ze vloeistof-ongeordende en geordende fasen genereren, evenals fase-gescheiden blaasjes.
Blaasjes gesynthetiseerd met 45% verzadigd lipide en 55% onverzadigde lipide resulteert bijvoorbeeld in blaasjes die zich scheiden in naast elkaar bestaande vloeistof-ongeordende en vaste fasen. Als cholesterol echter wordt opgenomen, kan coëxistentie tussen vloeistof en vloeistof worden waargenomen, waardoor GUVs ontstaan die zich scheiden in naast elkaar bestaande vloeistofgeordende en vloeistof-ongeordende fasen. Bovendien kunnen knooppunten worden waargenomen binnen de fasegescheiden mengsels.
Het belangrijkste om te onthouden is om de juiste belichtingstijd en ND-filterset te kiezen om de lipide nanobuisjes te kunnen visualiseren zonder de fluoroforen te fotobleken. Door de samenstelling van het fasegedrag van de lipide nanobuisjes aan te passen, kunnen we een minimalistisch modelsysteem gebruiken om de biofysica van de tunnelende nanobuisjes die cellen verbinden te bestuderen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol maakt de eenvoudige generatie van grootschalige netwerken van lipidenanobuisjes mogelijk door gebruik te maken van glijdende kinesine-motiliteit. De individuele nanobuisjes vertonen een fasenseparatiegedrag dat vergelijkbaar is met dat van de ouder-vesikels.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Celbiologie
Achtergrond
- Lipide-nanobuizen zijn belangrijk voor het bestuderen van membraandynamiek.
- Kinesine-motoren vergemakkelijken de zelfassemblage van lipidestructuren.
- Fasescheiding in lipidsystemen kan inzicht bieden in cellulaire processen.
- Deze methode verbetert de schaalbaarheid van de productie van nanobuizen.
Doel van de studie
- Om efficiënt netwerken van lipide nanobuizen te vervaardigen.
- Om moleculaire motoren te gebruiken voor zelfassemblage zonder menselijke tussenkomst.
- Om het fasegedrag van lipide nanobuizen te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een gliding motility assay met gebruik van kinesine en microtubuli.
- Gebruik van dubbelzijdige tape om een flowcell op een glazen objectglas te maken.
- Sequentiële toevoeging van kinesine- en microtubulusoplossingen.
- Wassen en toevoegen van streptavidine om de vorming van nanobuizen te faciliteren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van lipid nanotube-netwerken.
- Demonstratie van fase-scheidingsgedrag in de nanotubes.
- Hoge schaalbaarheid van de methode door het gebruik van moleculaire motoren.
- Potentiële toepassingen bij het bestuderen van membraandynamiek en cellulaire processen.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het fabriceren van lipide-nanobuisjes.
- Het gebruik van kinesine-motoren maakt efficiënte zelfassemblage mogelijk.
- Deze benadering kan het onderzoek naar lipidbiologie en membraandynamiek bevorderen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Snelle fabricage van multi-component lipid nanotube-netwerken met behulp van de gliding kinesin motility assay maakt schaalbare, reproduceerbare in vitro-modellen mogelijk voor membraangeassocieerd transport en lipidbiofysica. Deze aanpak ondersteunt vroege ontdekkingsfasen door instelbare, biologisch relevante systemen te bieden die de complexiteit van cellulaire lipidtubuli nabootsen. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen voor mechanistische studies en portfolio-triage in therapeutisch onderzoek gericht op membranen.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar membraantransportmechanismen mogelijk in een gecontroleerd, instelbaar systeem.
- Ondersteunt functionele validatie van moleculaire targets die betrokken zijn bij lipidedynamiek en -transport.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door het modelleren van fasescheiding en lipidepartitioneringsgedrag.
- Biedt een platform voor hypothesetesten van lipide-eiwitinteracties die relevant zijn voor ziektepaden.
Screening & assayontwikkeling
- Zorgt voor reproduceerbare, schaalbare preparatie van lipide nanobuisnetwerken voor downstream-assays.
- Maakt kwantitatieve meting van de lengte en breedte van nanobuisjes en de lipidepartitie mogelijk voor standaardisatie van de assay.
- Maakt snelle generatie van complexe lipidesystemen mogelijk met behulp van standaard laboratoriumapparatuur.
- Ondersteunt het screenen van verbindingen die de membraanstructuur of transportprocessen beïnvloeden.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Biedt een ziekterevant model voor het bestuderen van tunneling nanotubes die betrokken zijn bij intercellulaire communicatie.
- Sluit aan bij de ontdekking van translationele biomarkers door analyse van lipidefasegedrag en partitievorming mogelijk te maken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie van membraangeleide interventies.
- Vermindert biologische ambiguïteit bij de selectie van preklinische modellen voor membraanactieve verbindingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege mechanistische studies tot de ontwikkeling van preklinische modellen voor membraangeassocieerde targets.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en het verduidelijken van signaalpaden voor lipide-gemedieerd transport en signalering.
- Screening: Biedt reproduceerbare, assay-klare lipide nanotube-netwerken met instelbare eigenschappen.
- Analytics: Maakt kwantitatieve meting van nanotube-dimensies en lipide-partitionering mogelijk voor comparatieve analyse.
- Translational Research: Slaat een brug tussen in vitro mechanistische inzichten en ziekterelateerde membraanfenomenen.
- Enterprise Reuse: Biedt een gestandaardiseerd, schaalbaar platform dat aanpasbaar is voor meerdere onderzoeksprogramma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek naar membraanbiologie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de fabricage, standaardisatie en reproduceerbaarheid van complexe lipidsystemen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en kapitaalefficiëntie voor portefeuilles gericht op membranen.
- Impact op de portefeuille: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van membraanactieve therapeutische kandidaten mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in lipidenbiofysica en fluorescentiemicroscopie voor kwantitatieve analyse.
- Necessiteert standaard laboratoriuminstrumentatie voor de assemblage van de flowcel en beeldvorming.
- Vereist cross-team standaardisatie van beeldvormings- en meetprotocollen.
- Aanpasbaar aan een reeks lipidensamenstellingen en modelsystemen voor diverse onderzoeksbehoeften.
- Afhankelijk van zorgvuldige controle van beeldvormingsparameters om fotobleken van fluoroforen te voorkomen.
