Name: Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Leer hoe je multi-component lipid nanotube netwerken fabriceert met behulp van de gliding kinesin motility assay. Deze methode maakt efficiënte zelfassemblage van lipide nanobuizen mogelijk zonder menselijke tussenkomst.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het Amerikaanse ministerie van Energie, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). Kinesinesynthese en fluorescentiemicroscopie werden uitgevoerd via een gebruikersproject (ZIM) in het Center for Integrated Nanotechnologies, een Office of Science User Facility die wordt beheerd door het Office of Science van het Amerikaanse ministerie van Energie (DOE).

1. Bereiding van voorraad microtubule oplossingen
LET OP: Veiligheidsbril, handschoenen en een laboratoriumjas moeten altijd worden gedragen tijdens het protocol.
<ol><li>Bereid 5x BRB80-buffer: voeg 24,19 g PIPES (piperazine-N,N′-bis[2-ethaansulfonzuur]) en 0,38 g EGTA (ethyleenglycol-bis[β-aminoethylether]-N,N,N′,N′-tetra-azijnzuur) toe aan een glazen fles van 1 L. Voeg 1 ml 1 M MgCl2 toe en stel de pH in op 6,9 met KOH. Voeg gedeïoniseerd water toe om de oplossing op een eindvolume van 500 ml te brengen.</li>
	<li>Bereid 100 mM voorraad GTP-oplossing: weeg 52 mg GTP af en suspensie in 1 ml gedestilleerd water. Verdeel 100 mM oplossing in 20 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Gpem-oplossing bereiden: meng 200 μL 5x BRB80, 10 μL 100 mM GTP-oplossing, 100 μL 100% glycerol en 600 μL gedeïoniseerd water. Verdeel de GPEM-oplossing in 100 μL aliquots en bewaar in -20 °C.</li>
	<li>Bereid microtubulioplossing door injectieflacons met in de handel verkrijgbare, gelyofiliseerde tubuline (één injectieflacon elk van gebiotinyleerd, fluorescerend geëtiketteerd en niet-geëtiketteerd) in koude (4 °C) GPEM-oplossing te reconstrueren tot een voorraadconcentratie van 5 mg/ml.</li>
	<li>Voer microtubulepolymerisatie uit door 4 μL biotinylated tubulin, 4 μL fluorescerend gelabeld tubuline en 24 μL ongelabeld tubuline (allemaal bij concentraties van 5 mg / ml) te mengen om een verhouding van 1: 1: 6 te creëren bij een eindvolume van 32 ml. Houd het op ijs. Verdeel het tubulinemengsel in 2 μL aliquots en bewaar het bij -80 °C totdat het nodig is. OPMERKING: Efficiënte polymerisatie vereist dat de concentratie tubuline gelijk is aan of hoger is dan de kritische concentratie (5 mg / ml)14. Hier wordt de selectie van de tubulineverhouding geoptimaliseerd voor een voldoende concentratie gebiotinyleerd tubuline om streptavidin en GUVs efficiënt te binden, evenals een voldoende concentratie fluorescerende tubuline voor microscopische karakterisering.</li>
</ol>2. Bereiding van gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs)
<ol><li>Agarose filmvoorbereiding OPMERKING: Dit protocol is aangepast van Greene et al.15.<ol>
<li>Bereid een oplossing van 1% w/v door 1 g agarose in 100 ml gedeïoniseerd water in een Erlenmeyer van 250 ml te mengen. Gebruik een standaard magnetron om de agarose-oplossing gedurende 1-2 minuten te verwarmen. OPMERKING: De oplossing wordt doorschijnend zodra de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing voor gebruik afkoelen tot 65-75 °C.</li>
		<li>Gebruik een gesneden pipetpunt van 1.000 μL om 300-400 μL agarose-oplossing op een glazen afdeklip van 25 mm x 25 mm te pipeten. Terwijl u de rand van de coverslip met gehandschoende vingers vasthoudt, gebruikt u nog een pipetpunt van 1.000 μL om de gesmolten agarose gelijkmatig over de coverslip te verspreiden. OPMERKING: Door de agarose op 65-75 °C te houden, kunt u efficiënt op het oppervlak van de afdekplaat worden verspreid.</li>
		<li>Droog de met agarose gecoate dekplaten in een incubator van 37 °C gedurende ten minste 2 uur, waarna de agarose transparant wordt. Bewaar de coverslips door het agarose gecoate oppervlak naar boven gericht op een schoon oppervlak te plaatsen, zoals pluisvrij papier of op was gebaseerde film bij kamertemperatuur (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Lipide formulering<ol>
<li>Haal in chloroform opgeloste lipiden uit een vriezer van -20 °C en plaats ze in een chemische zuurkast totdat ze RT bereiken.</li>
		<li>Bereken het volume lipidevoorraad van elke component lipide die nodig is voor de formulering met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq1.jpg"> Waarbij: V-lipide het te gebruiken lipidevolume is, mol % het molaire percentage van de lipidecomponent, n het totale aantal mol lipide dat in de formulering wordt gebruikt en M de concentratie van lipide in molaire eenheden. OPMERKING: Als u bijvoorbeeld een formulering gebruikt die 45 mol% 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) bevat met een stockoplossingsconcentratie van 12,72 mM en 1 micromol totaal lipiden in de formulering, is het volume DOPC-voorraad dat in de formulering wordt gebruikt: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq2.jpg">
</li>
		<li>Meng de lipiden samen in de berekende verhouding in een glazen injectieflacon in de chemische zuurkast.</li>
		<li>Pipetteer 30 μL lipideoplossing op de met agarose gecoate coverslips op een voorverwarmde hete plaat die boven het smeltpunt van de verzadigde lipidecomponent van de formulering is geplaatst (bv. hete plaat van 50 °C voor een lipide met Tm van 40 °C).</li>
		<li>Verdeel de oplossing in een cirkelvormige beweging over de agarosefilm met behulp van de lange rand van een naald van 18 G totdat de chloroform is verdampt en een uniforme laag lipide is gevormd. Houd de rand van de coverslip vast met gehandschoende vingers tijdens het uitvoeren van deze stap. OPMERKING: Zorg ervoor dat de agaroselaag niet met de naald wordt beschadigd.</li>
		<li>Plaats de coverslip met agaroselaag en lipidefilm in een met aluminiumfolie bedekte petrischaal, filmzijde naar boven gericht, en plaats de petrischaal gedurende ten minste 2 uur in een vacuümdesiccator om het resterende oplosmiddel te verwijderen.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid ondertussen 560 mM sucrose-oplossing door 1,92 g sucrose te mengen met 10 ml gedeïoniseerd water. OPMERKING: De concentratie van de sucrose-oplossing is afhankelijk van de osmolariteit van de buffer-GUVs waarin wordt verdund. Doorgaans mag de osmolariteit van de sucroseoplossing niet meer dan 10% groter zijn dan de buffer waarin de GUVs worden verdund, met name de motiliteitsbuffer (zie stap 3.11).</li>
	<li>GUV-formatie<ol>
<li>Bevestig een kleefkamer aan de coverslip bedekt met de lipidefilm door de kleefkamer voorzichtig op de met lipiden gecoate coverslip te drukken met de lipidefilm naar boven gericht, zodat een strakke afdichting wordt gevormd.</li>
		<li>Voeg 400 μL 560 mM sucrose-oplossing (bereid in stap 2.3) toe aan de kamer.</li>
		<li>Plaats de dekselslip in de vochtigheidskamer en sluit het deksel.</li>
		<li>Plaats de vochtigheidskamer op een voorverwarmde kookplaat boven het smeltpunt van de verzadigde lipidecomponent van de formulering.</li>
		<li>Laat blaasjes zich ≥1 uur vormen voordat u herstelt. OPMERKING: De vorming van blaasjes kan worden gecontroleerd met fluorescentiemicroscopie met een 40x luchtobjectieflens.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Bereiding van motiliteitstestvoorraden en reagentia
<ol><li>Bereiding van caseïnevoorraden<ol>
<li>Voeg 3 g droge caseïne toe aan een conische centrifugebuis van 50 ml, voeg vervolgens 30 ml 1x BRB80 toe en draai tot de oplossing stroperig wordt. Centrifugeer de buis bij 15.000 x g gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Breng het supernatant over in een andere conische centrifugebuis van 50 ml en gooi de pellet weg. Filtreer de oplossing door een spuitfilter van 1 μm en verzamel de oplossing in een conische injectieflacon van 50 ml. Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 μm en verzamel de oplossing in een conische injectieflacon van 50 ml.</li>
		<li>Bepaal de eiwitconcentratie door de absorptie bij 280 nm te meten met behulp van een UV-Vis spectrofotometer en kwarts cuvette.</li>
		<li>Bereken de caseïneconcentratie in mg/ml met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq3.jpg">
</li>
		<li>Verdun de oplossing tot 20 mg/ml in 1x BRB80, verdeel in aliquots van 100 μL en bewaar bij -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid glucoseoxidase (2 mg/ml) stamoplossing door 2 mg glucoseoxidase te mengen met 1 ml 1x BRB80. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid catalase (0,8 mg/ml) stockoplossing door 0,8 mg catalase te mengen met 1 ml 1x BRB80. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid 2 M glucose-oplossing door 0,3 g D-glucose in 1 ml gedeïoniseerd water te suspenseren. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid 100 mM DTT-voorraad door 0,015 g DTT in 1 ml gedeïoniseerd water te suspenseren. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid 100 mM Mg-ATP voorraad door 0,055 g dinatrium ATP te suspenseren in 1 ml oplossing van 100 mM MgCl2. Verdeel in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid 100 mM Mg-AMP-PNP-oplossing door 0,055 g AMP-PNP op te schorten in een 1 ml-oplossing van 100 mM MgCl2, verdeel vervolgens in 100 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid 100 mM Trolox-oplossing door 25,03 mg Trolox toe te voegen aan 1 ml methanol en bewaar bij -20 °C.</li>
	<li>Bereid 10 mg/ml streptavidinoplossing door 1 mg streptavidin toe te voegen aan 100 μL BRB80, verdeel vervolgens in 2 μL aliquots en bewaar bij -80ۛ °C.</li>
	<li>Bereid BRB90CAT door 200 μL 5x BRB80, 20 μL caseïneoplossing, 10 μL MgATP-oplossing, 10 μL Trolox, 5 μL paclitaxeloplossing en 765 μL DI-water te mengen. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid de motiliteitsoplossing door 192 μL BRB80CAT, 2 μL D-glucoseoplossing, 2 μL glucoseoxidaseoplossing, 2 μL DTT-oplossing en 2 μL catalaseoplossing te mengen. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid een kinesineoplossing van 1 μM door de stockkineïneoplossing in BRB80CAT te verdunnen (bijv. 2 μL 50 mM kinesineoplossing in 98 μL BRB80CAT) en bewaar bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid een microtubuleoplossing van 10 μg/ml door 10 μL gestabiliseerde microtubuli te verdunnen in 90 μL BRB80CAT bij kamertemperatuur. Winkel bij RT.</li>
	<li>Bereid een streptavidinoplossing van 10 μg/ml door 0,1 μL 10 mg/ml streptavidinoplossing toe te voegen aan 99,9 μL motiliteitsoplossing. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid een 12x GUV-oplossing door 5 μL GUV-bouillon te verdunnen tot 55 μL motiliteitsoplossing. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Polymerisatie van tubuline tot microtubuli<ol>
<li>Haal een vooraf bereide aliquot tubuline van 2 μL uit de vriezer van -80 °C (bereid in stap 1.5) en plaats gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.</li>
		<li>Bereid een paclitaxeloplossing van 2 mM door toevoeging van 1,71 mg paclitaxel in 1 ml watervrije DMSO, verdeel in 10 μL aliquots en bewaar bij -20 °C.</li>
		<li>Bereid BRB80T vers door 99,5 μL 1x BRB80 te mengen met 0,5 μL 2 mM paclitaxel.  Verwarm 100 μL BRB80T tot 37 °C in het waterbad.</li>
		<li>Voeg na 30 minuten de 100 μL BRB80T toe aan het tubuline aliquot om de microtubuli te stabiliseren. Winkel bij RT.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Glijdende motiliteitstest (GMA)
<ol><li>Bereid een stroomkamer voor door twee stroken dubbelzijdige tape, gescheiden door 5 mm, op een glazen schuif te bevestigen. Herhaal dit proces totdat elke strip drie lagen tape bevat.</li>
	<li>Plaats een coverslip op de tape en druk vervolgens zachtjes op de coverslip / tape-interface met een pincet of pen om voldoende hechting te garanderen. OPMERKING: Het kanaal moet 5 mm breed en 25 mm lang en 300 mm hoog zijn.</li>
	<li>Pipetteer 30 μL 1 mm kinesineoplossing (bereid in stap 3.12) in de stroomcel en laat deze gedurende 5 minuten incuberen. OPMERKING: De caseïne vormt een dubbellaag op het oppervlak van de coverslip / glasschuif en vergemakkelijkt de bevestiging van de kinesinestaart aan het oppervlak.</li>
	<li>Pipetteer 30 μL van 10 μg/ml microtubulioplossing (bereid in stap 3.13) in de stroomcel, met behulp van een laboratoriumdoekje dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 5 min.</li>
	<li>Was de flowcel 1x–3x met 1x motiliteitsoplossing op RT (bereid in stap 3.11). OPMERKING: Fluorescentiemicroscopie met behulp van een 40x luchtobjectief kan op dit punt worden gebruikt om de aanhechting en beweeglijkheid van microtubuli te bevestigen. Microtubuli verschijnen als fluorescerende filamenten (tientallen micron lang) die met ~0,5 μm/s over het oppervlak bewegen (glijden).</li>
	<li>Pipetteer 30 μL van 10 μg/ml streptavidinoplossing (bereid in stap 3.14) in de stroomcel met behulp van een laboratoriumveeg dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 10 min.</li>
	<li>Laat 30 μL 12x GUV-oplossing (bereid in stap 3.15) in de stroom stromen met behulp van een laboratoriumdoekje dat zachtjes tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal wordt gedrukt om de uitwisseling van oplossingen te vergemakkelijken. Incubeer gedurende 30 min.</li>
	<li>Voeg 2 μL 100 mM AMP-PNP-oplossing (bereid in stap 3.7) toe om de beweeglijkheid te stoppen en sluit de kamer vervolgens af met kit.</li>
</ol>5. LNT-netwerkkarakterisering
<ol><li>Breng de stroomkamer over naar een omgekeerde microscoop voor beeldvorming.</li>
	<li>Kies de juiste filterset op basis van de golflengten van de gebruikte fluorescerende lipiden of tubuline. Gebruik bijvoorbeeld bij het gebruik van Texas Red-gelabelde lipiden een 560 nm / 25 nm excitatiefilter en een 607 nm / 36 nm emissiefilter.</li>
	<li>Gebruik een 100x olieobjectief om te focussen op het oppervlak van de coverslip.</li>
	<li>Breng de LNT-netwerken in beeld met behulp van fluorescentiemicroscopie. OPMERKING: LNT's zijn lineaire structuren die extruderen uit de grotere blaasjes. LNT's zijn veel kleiner dan GUVs en hebben zwakkere fluorescentiesignalen. De belichting en het contrast moeten dus worden aangepast aan de LNT's van afbeeldingen. Deze aanpassingen leiden ook tot overbelichting van de GUVs, en daarom wordt aanbevolen om de lamellriteit en fasescheiding in GUVs onafhankelijk te karakteriseren.</li>
	<li>Richt de microscoop op een interessant netwerk en maak een standaard of betegelde afbeelding.</li>
	<li>Pas de belichtingstijd en neutrale dichtheidsfilters aan om de LNT's in beeld te brengen en de verzadigde belichting van de GUVs te minimaliseren. Verkrijg afbeeldingen in zowel rode als groene kanalen. OPMERKING: Hier maakt het rode kanaal visualisatie van de Texas-Red lipiden mogelijk, terwijl het groene kanaal visualisatie van de microtubuli mogelijk maakt (bijv. Oregon Green lipiden en HiLyte488 kleurstoffen).</li>
	<li>Maak een samengestelde afbeelding door de rode en groene kanalen te bedekken (afbeelding 1).</li>
	<li>Karakterisering van LNT-netwerken door LNT-lengte te meten<ol>
<li>Open de verkregen afbeeldingen met behulp van een beeldanalysesoftware zoals ImageJ.</li>
		<li>Kalibreer de schaal voor de microscoop met behulp van de functie Ingestelde schaal, vul de pixels in op de mm-conversiefactor en klik op OK. OPMERKING: De conversiefactor is afhankelijk van de microscoop, objectieflens en camera en kan worden verkregen met behulp van een microscoopkalibratiedia. Het wordt over het algemeen uitgedrukt in pixels/mm.</li>
		<li>Gebruik het gereedschap Meerpuntslijn om de lengte van de nanobuisjes te meten vanaf de bovenliggende GUV. Houd Ctrl +M ingedrukt om de lengte te meten.</li>
		<li>Ga door met het meten van de lengtes van afzonderlijke buizen volgens de bovenstaande stappen. De beeldverwerkingstool slaat elke nieuwe meting op in het resultatenvenster.</li>
		<li>Houd Ctrl + D ingedrukt na het tekenen van elke lijn om bij te houden welke buizen zijn gemeten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>LNT-dikte meten (figuur 2)<ol>
<li>Open de afbeelding in ImageJ en selecteer de functie Drempel onder het tabblad Afbeelding .</li>
		<li>Klik op Toepassen om de drempel toe te passen.</li>
		<li>Teken een rechthoek van bekende lengte over de gewenste buis (zwarte pixels hebben een waarde van 0 en rode pixels hebben een waarde van 255).</li>
		<li>Meet de geïntegreerde dichtheid van het gebied.</li>
		<li>Deel de dichtheid door de lengte (in pixels) van de LNT om de dikte (in pixels) te verkrijgen. OPMERKING: De diktemetingen mogen alleen worden vergeleken tussen afbeeldingen wanneer de beeldinstellingen en drempelwaarde identiek zijn ingesteld.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bepaling van de lipidepartitionering in knooppunten van LNT's (figuur 3)<ol>
<li>Open de afbeelding in ImageJ.</li>
		<li>Gebruik het gereedschap Lijn om een lijn over het gewenste knooppunt te tekenen.</li>
		<li>Meet de knooppuntintensiteit in zowel de Oregon Green- als de Texas Red-kanalen.</li>
		<li>Verplaats de lijn naar de LNT en meet de LNT-intensiteit in zowel de Oregon Green- als de Texas Red-kanalen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouxsein, N. F., Carroll-Portillo, A., Bachand, M., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+network+of+lipid+nanotubes+fabricated+from+the+gliding+motility+of+kinesin+powered+microtubule+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">A continuous network of lipid nanotubes fabricated from the gliding motility of kinesin powered microtubule filaments.</a> Langmuir. 29 (9), 2992-2999 (2013).</li>
<li>Paxton, W. F., Bouxsein, N. F., Henderson, I. M., Gomez, A., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+assembly+of+polymer+nanotube+networks+via+kinesin+powered+microtubule+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dynamic assembly of polymer nanotube networks via kinesin powered microtubule filaments.</a> Nanoscale. 7 (25), 10998-11004 (2015).</li>
<li>Leduc, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+extraction+of+membrane+nanotubes+by+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cooperative extraction of membrane nanotubes by molecular motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (49), 17096-17101 (2004).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Roberts, T. H., Hirschberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretory+protein+trafficking+and+organelle+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Secretory protein trafficking and organelle dynamics in living cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 16, 557-589 (2000).</li>
<li>Belting, M., Wittrup, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubes%2C+exosomes%2C+and+nucleic+acid-binding+peptides+provide+novel+mechanisms+of+intercellular+communication+in+eukaryotic+cells%3A+implications+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nanotubes, exosomes, and nucleic acid-binding peptides provide novel mechanisms of intercellular communication in eukaryotic cells: implications in health and disease.</a> Journal of Cell Biology. 183 (7), 1187-1191 (2008).</li>
<li>Rustom, A., Saffrich, R., Markovic, I., Walther, P., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotubular+highways+for+intercellular+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nanotubular highways for intercellular organelle transport.</a> Science. 303 (5660), 1007-1010 (2004).</li>
<li>Onfelt, B., Nedvetzki, S., Yanagi, K., Davis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+Membrane+nanotubes+connect+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: Membrane nanotubes connect immune cells.</a> Journal of Immunology. 173 (3), 1511-1513 (2004).</li>
<li>Sciaky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+tubule+traffic+and+the+effects+of+brefeldin+A+visualized+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Golgi tubule traffic and the effects of brefeldin A visualized in living cells.</a> J Cell Biol. 139 (5), 1137-1155 (1997).</li>
<li>Sprong, H., van der Sluijs, P., van Meer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+move+lipids+and+lipids+move+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins move lipids and lipids move proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (7), 504-513 (2001).</li>
<li>Keenan, T. W., Morre, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipid+class+and+fatty+acid+composition+of+golgi+apparatus+isolated+from+rat+liver+and+comparison+with+other+cell+fractions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Phospholipid class and fatty acid composition of golgi apparatus isolated from rat liver and comparison with other cell fractions.</a> Biochemistry. 9 (1), 19-25 (1970).</li>
<li>Imam, Z. I., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+and+Multiphase+Lipid+Nanotubes+Formed+by+Gliding+Microtubule-Kinesin+Motility+and+Phase-Separated+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Multicomponent and Multiphase Lipid Nanotubes Formed by Gliding Microtubule-Kinesin Motility and Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles.</a> Langmuir. 35 (49), 16281-16289 (2019).</li>
<li>Wesolowska, O., Michalak, K., Maniewska, J., Hendrich, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+unilamellar+vesicles+-+a+perfect+tool+to+visualize+phase+separation+and+lipid+rafts+in+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochimica+Polonica%22%5BJournal%5D)">Giant unilamellar vesicles - a perfect tool to visualize phase separation and lipid rafts in model systems.</a> Acta Biochimica Polonica. 56 (1), 33-39 (2009).</li>
<li>Momin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+lipids+for+selective+partitioning+into+liquid+ordered+membrane+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Designing lipids for selective partitioning into liquid ordered membrane domains.</a> Soft Matter. 11 (16), 3241-3250 (2015).</li>
<li>Fygenson, D. K., Braun, E., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagram+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Phase diagram of microtubules.</a> Physical Review E. 50, 1579(1994).</li>
<li>Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forming+Giant-sized+Polymersomes+Using+Gel-assisted+Rehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Bachand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+1D+microtubule+nano-arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+of+Chemistry+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of 1D microtubule nano-arrays.</a> Royal Society of Chemistry Advances. 4 (97), 54641-54649 (2014).</li>
</ol>

Sandia National Laboratories is een multi-missie laboratorium beheerd en beheerd door National Technology &Engineering Solutions van Sandia, LLC., een volledige dochteronderneming van Honeywell International, Inc., voor de Amerikaanse DOE's National Nuclear Security Administration onder contract DE-NA-0003525. Dit artikel beschrijft objectieve technische resultaten en analyses. Alle subjectieve opvattingen of meningen die in de paper kunnen worden geuit, vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de standpunten van het Amerikaanse ministerie van Energie of de regering van de Verenigde Staten.

LNT-netwerken zijn een nuttig hulpmiddel voor in vitro studies naar membraaneigenschappen en het transport van biomoleculen zoals transmembraaneiwitten. Bovendien maakt het gebruik van complexe lipideformuleringen om LNT-netwerken te fabriceren meer biologisch relevante studies mogelijk. Andere fabricagestudies hebben 1) eenvoudige lipideformuleringen en multilamellaire blaasjes of 2) meer omslachtige motiliteitstechnieken gebruikt om netwerken te fabriceren van GUVs die bestaan uit complexe lipideformuleringen. De hier ...

De fabricage van lipide nanobuis (LNT) netwerken is van toenemend belang voor in vitro onderzoek van niet-evenwicht lipidestructuren 1,2,3. Cellen gebruiken lipide tubuli voor het diffusieve transport van eiwitten4 en nucleïnezuren5 en cel-naar-cel communicatie 6,7. Het endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat zijn bijzonder interessant, omdat deze membraangebonden organellen de primaire locaties zijn voor lipide- en eiwitsynthese en transport van deze integrale biomoleculen in het cytoplasma van een cel 8,9. De membranen van deze organellen bestaan uit meerdere lipidesoorten, waaronder sfingolipiden, cholesterol en fosfolipiden10 die uiteindelijk helpen bij het definiëren van hun functionaliteit. Dus, om deze organellen nauwkeuriger te repliceren en te bestuderen, moeten in vitro LNT's worden vervaardigd uit blaasjes met steeds complexere lipideformuleringen11.
Gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) worden alomtegenwoordig gebruikt voor het bestuderen van lipidemembraangedrag omdat ze betrouwbaar kunnen worden gesynthetiseerd met complexe formuleringen die cholesterol, fosfatidylcholine (PC), fosfatidylethanolamine (PE), fosfatidylserine (PS) en fosfatidylinositol (PI) bevatten 12,13. Hier wordt een methode beschreven om LNT's te fabriceren uit GUVs met verschillende lipideformuleringen met behulp van de gliding motility assay (GMA), waarbij LNT's worden geëxtrudeerd op basis van het werk dat wordt uitgevoerd door kinesinemotoren en microtubule-filamenten die op GUVs werken. In dit systeem stuwen kinesinemotoreiwitten geadsorbeerd aan een oppervlak gebiotinyleerde microtubuli aan, waardoor chemische energie van de hydrolyse van ATP wordt omgezet in nuttig werk (met name de extrusie van LNT's uit gebiotinyleerde blaasjes)11. Het resulterende LNT-netwerk biedt een modelplatform om effecten van de verschillen in lipidefasen op veranderingen in LNT-morfologie te bestuderen.
In het kort worden kinesinemotoreiwitten in een stroomkamer ingebracht in een oplossing die caseïne bevat, waardoor de motoren op het glazen oppervlak van de kamer kunnen worden geplaatst. Vervolgens stromen gebiotinyleerde microtubuli in een oplossing die ATP bevat door de kamer en mogen ze binden aan de kinesinemotoren en beginnen met motiliteit. Een streptavidin-oplossing wordt vervolgens in de kamer ingebracht en mag niet-covalent aan de microtubuli binden. Ten slotte worden GUVs met een gebiotinyleerd lipide in de kamer gebracht en binden ze aan de gestreepte microtubuli en extruderen ze vervolgens LNT's om grootschalige netwerken te vormen in de loop van 15-30 minuten. Deze methode produceert grote, vertakte LNT-netwerken met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en reagentia tegen lage kosten11.

<table><tbody><tr><td>100x/1.4 Numerical Aperture Oil Immersion Objective</td><td>Olympus</td><td>1-U2B836</td><td>Olympus UPlanSApo 100x/1.40 Oil Objective Infinity Corrected, RMS Thread Werkafstand 0,12 mm</td></tr><tr><td>3.0 ND Filter</td><td>Olympus</td><td></td><td>Neutrale dichtheidsfilter</td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2647</td><td>(&beta;,&gamma;-imidoadenosine 5&prime;-trifosfaat)</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>Adenosine 5'-trifosfaat dinatriumzout hydraat BioXtra</td></tr><tr><td>Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 filter set</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td><td> BrightLine Pinkel filterset, geoptimaliseerd voor DAPI, FITC, TRITC, Cy5 &amp; Cy7 en andere soortgelijke fluoroforen, verlicht met op LED gebaseerde lichtbronnen</td></tr><tr><td>Caseïne</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090</td><td>Caseïne hydrolysaat voor microbiologie</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>Catalase uit runderlever</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>Chloroform watervrij bevat 0,5-1,0% ethanol als stabilisator</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti</td><td>700000P</td><td>cholesterol (schapenwol, >98%) (poeder)</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>D-(+)-Glucose poeder, BioReagent, geschikt voor celcultuur, geschikt voor insectencelcultuur, geschikt voor plantencelcultuur, &ge;99,5%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375C</td><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (in chloroform)</td></tr><tr><td>DOPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870282C</td><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(biotinyl) (natriumzout)</td></tr><tr><td>DPPC</td><td>Avanti</td><td>850355P</td><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (poeder)</td></tr><tr><td>DPPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870285P</td><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-(biotinyl) (natriumzout)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>DL-Ditiotreitol oplossing 1 M</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA, Egtazic zuur, Ethylene-bis(oxyethyleenitrilo)tetraazijnzuur, Glycol ether diamine tetraazijnzuur</td></tr><tr><td>Glucose Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td>Glucose Oxidase uit Aspergillus niger Type II, &ge;10.000 eenheden/g vaste stof (zonder toegevoegd zuurstof)</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33</td><td>Glycerol (Gecertificeerd ACS), Fisher Chemical</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>Guanosine 5&prime;-trifosfaat natriumzout hydraat</td></tr><tr><td>IX-81 Olympus Microscope</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>IX81 Inverted Microscope van Olympus</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1050121000</td><td>Kaliumhydroxide</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>1,00 M magnesiumchlorideoplossing</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 Digital Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>ORCA-Flash 4.0 V3 Digital CMOS camera</td></tr><tr><td>Oregon Green-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>O12650</td><td>Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine</td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>ThermoFisher</td><td>P3456</td><td>Paclitaxel (Taxol Equivalent) - alleen voor gebruik in onderzoek</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-Piperazinediethanesulfonzuur, Piperazine-1,4-bis(2-ethaansulfonzuur), Piperazine-N,N&prime;-bis(2-ethaansulfonzuur)</td></tr><tr><td>Texas Red-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>T1395MP</td><td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Fosfoethanolamine, Triethylammoniumzout</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>(&plusmn;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromaan-2-carbonzuur</td></tr><tr><td>Tubulin, Biotin</td><td>Cytoskeleton</td><td>T333P</td><td>Tubuline-eiwit (biotine) varkensbrein</td></tr><tr><td>Tubulin, Hy-Lite 488</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL488M</td><td>Tubuline-eiwit (fluorescent HiLyte 488) varkensbrein</td></tr><tr><td>Tubulin, Unlabeled</td><td>Cytoskeleton</td><td>T240</td><td>Tubuline-eiwit varkensbrein</td></tr></tbody></table>

multi-component lipid nanotube networks fabriceren met behulp van de gliding kinesin motility assay

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipide nanobuisjes (LNT) netwerken vertegenwoordigen een in vitro modelsysteem voor het bestuderen van moleculair transport en lipide biofysica met relevantie voor de alomtegenwoordige lipide tubuli in eukaryote cellen. In vivo LNT's zijn echter zeer niet-evenwichtsstructuren die chemische energie en moleculaire motoren vereisen om te worden geassembleerd, onderhouden en gereorganiseerd. Bovendien is de samenstelling van in vivo LNT's complex, bestaande uit meerdere verschillende lipidesoorten. Typische methoden om LNT's te extruderen zijn zowel tijd- als arbeidsintensief, en ze vereisen optische pincetten, microbeads en micropipettes om nanobuisjes met geweld uit gigantische lipideblaasjes te trekken. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de gliding motility assay (GMA), waarbij grootschalige LNT-netwerken snel worden gegenereerd uit gigantische unilamellaire blaasjes (GUVs) met behulp van kinesine-aangedreven microtubule motiliteit. Met behulp van deze methode worden LNT-netwerken gevormd uit een breed scala aan lipideformuleringen die de complexiteit van biologische LNT's nabootsen, waardoor ze steeds nuttiger worden voor in vitro studies van lipidebiofysica en membraangeassocieerd transport. Bovendien is deze methode in staat om in korte tijd (<30 min) op betrouwbare wijze LNT-netwerken te produceren met behulp van veelgebruikte laboratoriumapparatuur. LNT-netwerkkenmerken zoals lengte, breedte en lipidenverdeling zijn ook instelbaar door de lipidesamenstelling van de GUVs die worden gebruikt voor het fabriceren van de netwerken te veranderen.

LNT-netwerken (figuur 4) werden vervaardigd met behulp van het beschreven protocol, dat het werk gebruikt dat wordt uitgevoerd door kinesinetransport van microtubuli om LNT's uit GUVs te extruderen. In het kort werden GUVs bereid met behulp van agarose gel rehydratie met behulp van sucrose-oplossing, en microtubuli werden gepolymeriseerd in GPEM-oplossing en gestabiliseerd in BRB80T. Vervolgens werden kinesinemotoren in een stroomcel geïntroduceerd die een actieve laag motoren op het oppervl...

Dit protocol beschrijft een proces voor het fabriceren van lipide nanobuisnetwerken met behulp van glijdende kinesinemotiliteit in combinatie met gigantische unilamellaire lipideblaasjes.

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Dit protocol maakt het mogelijk om eenvoudig grootschalige lipide nanobuisnetwerken te genereren waarin de individuele nanobuisjes fasescheidingsgedrag vertonen dat vergelijkbaar is met dat van het moederblaasje. Het belangrijkste voordeel van deze aanpak is dat we het werk van de moleculaire motoren coöpteren om de lipide nanobuisjes zelf op een zeer parallelle manier en zonder menselijke tussenkomst te assembleren. Om een glijdende motiliteitstest op te zetten, bevestigt u eerst drie sets dubbelzijdige tapestrips op een glazen schuif die vijf millimeter uit elkaar ligt.Druk voorzichtig op een afdekplaat op de tape en voeg 30 microliter kinesineoplossing van één micromolair toe aan de voorbereide stroomcel. Voeg na vijf minuten 30 microliter van een 10-microgram / milliliter microtubulioplossing toe aan de cel en druk zachtjes op een laboratoriumdoekje tegen het andere uiteinde van het stroomkanaal om de uitwisseling van de oplossing te vergemakkelijken. Was de cel na nog eens vijf minuten incubatie één tot drie keer met 50 microliter motiliteitsoplossing op kamertemperatuur per wasbeurt voordat u 30 microliter streptavidinoplossing van 10 microgram/milliliter aan de stroomcel toe

fabricating-multi-component-lipid-nanotube-networks-using-gliding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Moleculaire shuttles bestaande uit gefunctionaliseerde microtubuli glijden op het oppervlak van folie kinesine motor-eiwitten kan dienen als een nanoschaal transport systeem. Hier is de montage van een typisch shuttle systeem beschreven.

Cargo Laden op Kinesine Powered Moleculaire Shuttles

In this video, we perform an in vitro motility assay to analyze the actin-myosin interactions. The gliding movement of actin filaments on immobilized myosin molecules is visualized using fluorescence microscopy.

The Gliding Actin Filament Assay: An In Vitro Motility Assay to Study Translocation of Actin Filaments on Immobilized Myosins

Een methode om de persistentielengte of buigstijfheid van biopolymeren meten beschreven. De methode gebruikt een kinesine aangedreven microtubule gliding assay experimenteel bepalen de persistentielengte van individuele microtubuli en is aanpasbaar aan actine gebaseerde assays glijden.

Buigstijfheid Metingen van Biopolymeren gebruik Zweefvliegen Assays

We rapporteren over een slimme toepassing van koolstofnanobuizen voor de kinetische stabilisatie van lipidedeeltjes die zelf-geassembleerde nanostructuren bevatten in hun kernen. De bereiding van lipidedeeltjes vereist vrij lage concentraties van koolstofnanobuizen, wat hun gebruik mogelijk maakt in biomedische toepassingen zoals geneesmiddelafgifte.

Facile Bereiding van Intern Self-assembled Lipid Particles gestabiliseerd door koolstof nanobuisjes

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

We presenteren een protocol om te bouwen van moleculaire/naar vliegveld, waar kinesin oppervlak-in acht genomen motor eiwitten voortbewegen kleurstof-gelabelde microtubuli. Zwakke interacties van de kinesins met het oppervlak kunnen hun omkeerbare gehechtheid aan het. Dit creëert een nanoschaal-systeem dat dynamische montage en demontage van de onderdelen met behoud van zijn functionaliteit vertoont.

Monteren van moleculaire Shuttles Powered by omkeerbaar aangesloten Kinesins

Het doel van dit protocol is het vormen van ensembles van moleculaire motoren op DNA origami nanostructuren en observeren het ensemble motiliteit met behulp van totale inwendige reflectie fluorescentiemicroscopie.

Productie van Dynein en Kinesin motor ensembles op DNA origami nanostructuren voor observatie van enkelvoudige moleculen

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.

Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren

Dit artikel presenteert protocollen voor het engineeren en karakteriseren van afstembare driedimensionale composietnetwerken van co-verstrengelde actinefilamenten en microtubuli. Composieten ondergaan actieve herstructurering en ballistische beweging, aangedreven door myosine II- en kinesinemotoren, en worden afgestemd op de relatieve concentraties actine, microtubuli, motoreiwitten en passieve crosslinkers.

Reconstitueren en karakteriseren van Actin-Microtubule Composieten met instelbare motoraangedreven dynamica en mechanica

Leer hoe je multi-component lipid nanotube netwerken fabriceert met behulp van de gliding kinesin motility assay. Deze methode maakt efficiënte zelfassemblage van lipide nanobuizen mogelijk zonder menselijke tussenkomst.

Multi-Component Lipid Nanotube Networks fabriceren met behulp van de Gliding Kinesin Motility Assay

Meer video's verkennen