Name: Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: Leer geavanceerde methoden voor bemonstering en analyse van geursignalen bij dieren. Deze techniek combineert headspace solid-phase microextractie met gaschromatografie-massaspectrometrie voor inzicht in chemische communicatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Keith Holding voor zijn hulp bij chemische analyses in het Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, en Ben Mantle voor de productie van de video. We zijn ook prof. Gloriano Moneti, dr. Giuseppe Pieraccini en de leden van het Mass Spectrometry Center van de Universiteit van Florence, Florence, en prof. Luca Calamai en dr. Marco Michelozzi van het ARCA Lab van de CNR, Florence, dankbaar voor hun hulp bij het opzetten van deze methodologie. De onderzoeksprojecten die de in het manuscript beschreven bemonsterings- en analysemethoden omvatten, werden ondersteund door twee Marie Skłodowska-Curie Intra European Fellowships (Grant Agreement ID's: 327083, 703611), een kleine beurs ('The sensory enriched primate') van de Primate Society of Great Britain en een kleine onderzoeksbeurs ('Hebben jager-verzamelaars een speciaal reukvermogen?') van de British Academy/The Leverhulme Trust aan S.V. Het laboratoriumwerk dat nodig was om deze methodologie op te zetten, ontving ook financiering van de Jaarlijkse Financieringswedstrijd van de Faculteit Bètawetenschappen en Ingenieurs (Wolverhampton) aan S.V.

1. Monsterverzameling
<ol><li>Monstergeuren die een van de volgende zijn:<ol>
<li>Verzamel spontaan vrijgegeven door gewennende proefpersonen (bijv. dierentuin primaten) via geurmarkering op steriel filterpapier (bijv. geur-kliergeurafscheidingen) of rechtstreeks in flacons (bijv. urine).</li>
		<li>Verzamel door steriele wattenstaafjes te wrijven na de training van proefpersonen met behulp van positieve versterkingstraining.</li>
		<li>Verzamelen door steriele wattenstaafjes te wrijven na sedatie van proefpersonen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plaats monsters in steriele 10 ml schroefgedoppen doorzichtige glazen flacons en sluit af met schroefdoppen met FTFE/siliconen septa. Bewaar ze onmiddellijk bij -20 °C. OPMERKING: Het is van vitaal belang om schone persoonlijke beschermingsmiddelen te gebruiken, zoals nitrilhandschoenen; ze regelmatig te wijzigen; vermijd direct huidcontact met monsters en flacons. Het verdient de voorkeur om gloednieuwe flacons te gebruiken; in het geval van gebruikte flacons is het echter van vitaal belang om de flacons vooraf schoon te maken en vervolgens hetzelfde protocol te gebruiken.</li>
	<li>Neem omgevingsvlekken elke keer dat geurvlekken worden verzameld. Verzamel bijvoorbeeld de bemonsteringsmedia (bijv. filterpapier of wattenstaafje) en een flacon met hoofdruimte die tijdens de bemonstering aan de omgeving worden blootgesteld.</li>
</ol>2. Monstervoorbereiding
<ol><li>Bereid monsters in het veld voor door met een mes een vierkant van ongeveer 10 mm van een met geur gemarkeerd filterpapier of de kop van het wattenstaafje te snijden en in een flacon met schroefruimte van 10 ml te plaatsen.</li>
	<li>Nadat elk monster is bereid, verwijdert of reinigt u het mes dat wordt gebruikt om de bemonsteringsmedia te snijden met een geschikt antibacterieel doekje en/of alcohol en droogt u het grondig.</li>
	<li>Bewaar alle monsters bij -20 °C. OPMERKING: Voorkeur bij -20 °C of anderszins zo laag mogelijk in het veld.</li>
</ol>3. Voorbereiding op de analyse
<ol><li>Haal de monsters uit de vriezer en laat het op natuurlijke wijze opwarmen tot kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.</li>
	<li>Stel de analysemethode op de GC-MS als volgt in:<ol>
<li>Volg voor SPME-analyseomstandigheden de aanwijzingen van de fabrikant om SPME-vezels voor het eerste gebruik te conditioneren: vezelvoorconditionering (260 °C gedurende 5 min), monster incubatie (40 °C gedurende 2 min), extractietijd (15 min), desorptietijd (2 min) en vezel na de conditie (260 °C gedurende 20 min).</li>
		<li>Gebruik de volgende GC-omstandigheden: kolom (HP5-MS 30 m x 0,25 mm; 0,25 μm), injectortemperatuur (270 °C), debiet (1 ml/min), injectiemodus (splitless), GC-ovenprofiel (45 °C gedurende 2 min; 4 °C/min tot 170 °C; 20 °C/min tot 300 °C), MSD-overdrachtsleiding (2°C). OPMERKING: Om de consistentie van de bewaartijd van het monster te verbeteren, is de analysemethode retentietijd vergrendeld).</li>
		<li>Gebruik de volgende MSD-omstandigheden: oplosmiddelvertraging (2,5 min) en scanbereik (29 tot 400 amu). OPMERKING: In de vorige protocollen4werd een bereik van 10 tot 400 gebruikt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorg ervoor dat de spoelgastoevoer naar de vezelconditioneringseenheid is ingeschakeld. OPMERKING: Het is van vitaal belang dat de SPME-assemblage correct in de auto-sampler is geïnstalleerd en dat deze is uitgelijnd op de auto-sampler trays, fiber conditioning unit en GC inlaatpoort. Onjuiste uitlijning kan leiden tot beschadiging of vernietiging van de SPME-vezel.</li>
</ol>4. Analyse
<ol><li>Plaats een lege flacon met hoofdruimte (om als systeem leeg te fungeren) in de eerste positie van de GC-MS auto-sampler lade. Plaats de milieu blank in de tweede positie van de auto-sampler tray. Plaats de monsters voor analyse in de volgende posities van de lade voor automatisch monster.</li>
	<li>Maak een analytische volgorde om elk monster in de monsterlade te analyseren.<ol>
<li>Selecteer In het startscherm van MassHunter Sequence | Laadvolgorde.</li>
		<li>Vul de volgtabel voor alle spaties en monsters in door de juiste informatie in te voegen. Sla de voltooide volgtabel op. OPMERKING: De exacte informatie voor de volgtabel is afhankelijk van de opmaak van de laboratoria voor de tabel. Minimale informatie omvat normaal gesproken het monstertype, de monsternaam, de locatie en het nummer van de flacon, de analysemethode en de locatie en naam van het gegevensbestand (toewijzing van een gegevensbestandnaam die overeenkomt met de voorbeeldnaam helpt toekomstige gegevensverwerking). Tijdens de analyse kunnen extra monsters aan de reeks worden toegevoegd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer de reeks uit door | Reeks uitvoeren.</li>
	<li>Breng na analyse de monsters zo snel mogelijk terug in de vriezer. OPMERKING: het is mogelijk om monsters opnieuw te analyseren, maar er moet worden opgemerkt dat sommige vluchtige componenten tijdens de eerste analyse volledig zijn geëxtraheerd en dat sommige verbindingen thermische en bacteriële afbraak bij 40 °C hebben ondergaan, zodat het resulterende chromatogram mogelijk niet grondig representatief is voor de oorspronkelijke geurmarkering.</li>
</ol>5. Gegevensanalyse
OPMERKING: De eerste gegevensanalyse omvat de integratie van chromatogrammen om retentietijd- en piekgebiedgegevens te verkrijgen, samen met voorlopige identificatie van pieken met behulp van ChemStation-software en NIST (National Institute of Standards and Technology) massaspectraal databases, versie MSD F.01.01.2317. Data-analyse kan handmatig of via een semi-geautomatiseerde methode worden uitgevoerd. Als de semi-geautomatiseerde methode wordt gebruikt, is het soms nuttig om een zekere mate van handmatige gegevensanalyse uit te voeren om voorlopige identificaties te verifiëren.
<ol><li>Open het gegevensbestand door op het juiste bestand in de linkernavigatiebalk te klikken. Het totale ionenchromatogram (TIC) wordt weergegeven in het bovenste venster van het scherm voor gegevensanalyse.</li>
	<li>Als u de TIC wilt integreren met behulp van de RTE-integrator, selecteert u Chromatogram | Integreren.</li>
	<li>Pas integratieparameters aan zodat pieken die groter zijn dan 3 x basislijnruis worden geïntegreerd. Selecteer Chromatogram | MS-signaalintegratieparameters. Pas in het uitvoervak het minimale piekgebied aan indien van toepassing (1.0 levert in onze voorbeelden acceptabele resultaten op).</li>
	<li>Als u pieken wilt identificeren en een overzichtsrapport wilt genereren, selecteert u Rapporten exporteren | Zoekresultaten bibliotheek rapporteren aan XLS. OPMERKING: De spectrale bibliotheken die moeten worden doorzocht, samen met het aantal bibliotheekmatches dat moet worden weergegeven, moeten in de software worden ingesteld voordat een bibliotheekzoekopdracht kan worden uitgevoerd.</li>
	<li>Het resulterende spreadsheetrapport bevat integratiegegevens voor elke piek en een voorlopige spectrale bibliotheekmatch om identiteit toe te wijzen. Normaal gesproken moet de overeenkomst tussen bibliotheekkwaliteit en bibliotheek worden >80 om de voorlopige identificatie te accepteren. Sla de spreadsheet op.</li>
	<li>Identificeer een piek rechtstreeks vanuit de TIC.<ol>
<li>Kies de piek van interesse.</li>
		<li>Als de piek klein is, zoomt u in door een vak rond de piek te tekenen door de linkermuisknop ingedrukt te houden, het vak over de piek te strekken en los te laten.</li>
		<li>Plaats de cursorlijn zo dat deze zich op het hoogste punt van de piek (of net erna) bevindt.</li>
		<li>Dubbelklik op de rechtermuisknop en het massaspectrum voor de piek verschijnt in het onderste venster van het gegevensanalysescherm.</li>
		<li>Als u de spectrale bibliotheek wilt doorzoeken, verplaatst u de cursor ergens in het spectrale venster en dubbelklikt u op de rechtermuisknop. De zoekresultaten van de bibliotheek worden in een nieuw venster weergegeven.</li>
		<li>Om de achtergrondruis uit een interessant spectrum te verwijderen, dubbelklikt u eerst op de rechtermuisknop op de betreffende piek. Dubbelklik vervolgens op de rechtermuisknop in een gebied zonder pieken direct voor de piek van interesse. Selecteer Chromatogram | Trek spectra af. Het afgetrokken spectrum wordt weergegeven in het onderste venster van het gegevensanalysescherm en geeft '(-)' weer naast de SCAN-gegevens in de vensterkop.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wyatt, T. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWyatt%2C+TD+%22Pheromones+and+Animal+Behavior%3A+Chemical+Signals+and+Signatures%22">Pheromones and Animal Behavior: Chemical Signals and Signatures</a>. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2014).</li>
<li>Heymann, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neglected+sense-olfaction+in+primate+behavior%2C+ecology%2C+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution.</a> American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).</li>
<li>Drea, C. M., Boulet, M., DelBarco-Trillo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22secret%22+in+secretions%3A+Methodological+considerations+in+deciphering+primate+olfactory+communication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The "secret" in secretions: Methodological considerations in deciphering primate olfactory communication.</a> American Journal of Primatology. 75 (7), 621-642 (2013).</li>
<li>Vaglio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sternal+gland+scent-marking+signals+sex%2C+age%2C+rank+and+group+identity+in+captive+mandrills%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Sternal gland scent-marking signals sex, age, rank and group identity in captive mandrills.</a> Chemical Senses. 41 (2), 177-186 (2016).</li>
<li>Marneweck, C., Jürgens, A., Shrader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dung+odours+signal+sex%2C+age%2C+territorial+and+oestrous+state+in+white+rhinos%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dung odours signal sex, age, territorial and oestrous state in white rhinos.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 284 (1846), (2016).</li>
<li>Shear, W. A., Jones, T. H., Miras, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+phylogenetic+signal+in+milliped+chemical+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Systematics+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">A possible phylogenetic signal in milliped chemical defenses.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 35, 838-842 (2007).</li>
<li>Kimura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+substances+in+feces%2C+urine+and+urine-marked+feces+of+feral+horses%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Volatile substances in feces, urine and urine-marked feces of feral horses.</a> Canadian Journal of Animal Science. 81 (3), 411-420 (2001).</li>
<li>Vaglio, S., Minicozzi, P., Bonometti, E., Mello, G., Chiarelli, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volatile+signals+during+pregnancy%3A+a+possible+chemical+basis+for+mother-infant+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Ecology%22%5BJournal%5D)">Volatile signals during pregnancy: a possible chemical basis for mother-infant recognition.</a> Journal of Chemical Ecology. 35 (1), 131-139 (2009).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+composition+of+scent-gland+secretions+in+an+Old+World+monkey+%28Mandrillus+sphinx%29%3A+influence+of+sex%2C+male+status%2C+and+individual+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Chemical composition of scent-gland secretions in an Old World monkey (Mandrillus sphinx): influence of sex, male status, and individual identity.</a> Chemical Senses. 35 (3), 205-220 (2010).</li>
<li>Setchell, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odour+signals+MHC+genotype+in+an+Old+World+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Odour signals MHC genotype in an Old World monkey.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 278 (1703), 274-280 (2011).</li>
<li>Pawliszyn, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawliszyn%2C+J+%22Solid+phase+microextraction%3A+theory+and+practice%22">Solid phase microextraction: theory and practice</a>. , Wiley-VCH. New York, US. (1997).</li>
<li>Janda, E. D., Perry, K., Hankinson, E., Walker, D., Vaglio, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+scent-marking+in+captive+red-ruffed+lemurs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">Sex differences in scent-marking in captive red-ruffed lemurs.</a> American Journal of Primatology. 81 (1), 22951(2019).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Het gebruik van controlemonsters, zowel milieucontroles die zijn gemaakt op het moment van monsterverzameling als systeem blanks, zijn cruciaal voor de interpretatie van de geurmerkmonsters. Pieken die worden toegeschreven aan de bemonsteringsomgeving of het instrumentele systeem moeten worden uitgesloten van geursponsmonsters, zodat alleen de pieken van belang in elke interpretatie worden opgenomen. Deze controles kunnen ook een rol spelen bij het beoordelen en monitoren van de "gezondheid" van de instrumentatie.
<p...

Er is zeer weinig bekend over de chemische veranderingen die ten grondslag liggen aan de reuksignalen bij dieren1, ook vanwege methodologische uitdagingen bij het registreren en kwantificeren van vluchtige chemische profielen van geuren2. Er zijn verschillende mogelijke valkuilen bij het werken met zeer complexe, chemische matrices; deze omvatten bij het bemonsteren en analyseren van de geurmonsters3.
In het Rosalind Franklin Science Center, University of Wolverhampton, zijn we bezig met de analyse van geuren en geurmerken om te begrijpen hoe ze door dieren kunnen worden gebruikt. We combineren semiochemie met gedragsecologie, endocrinologie en cytologie om ons begrip van de rol van reuksignalen in dierlijke communicatie te verbeteren.
We hebben een methodologie ontwikkeld en vervolgens geuren en markeringen geanalyseerd van verschillende soorten, waaronder verschillende niet-menselijke primaten (d.w.z. gekroonde maki's, roodharige maki's, Japanse makaken, olijfbavianen, chimpansees) en andere zoogdieren (d.w.z. katten, koeien). We hebben een verscheidenheid aan monsters verzameld en geanalyseerd, waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen. Deze geuren en geurmerken bestaan uit complexe mengsels van verbindingen en daarom moet elke methodologie die voor hun analyse wordt gebruikt, een vorm van separatorietechniek bevatten. Zoals geïllustreerd, komen ze ook voor in een reeks matrices die het gebruik van technieken vereisen om de componenten van belang te extraheren.
Eerdere studies van Vaglio et al.4 en andere auteurs5 gebruikten dynamische headspace-extractie (DHS) met gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), terwijl ook directe oplosmiddelextractie6 en complexe oplosmiddelextracties7 zijn gebruikt. Bij dynamische headspacebemonstering gaat het met name om het zuiveren van de headspace met een bekend volume inert gas dat uiteindelijk alle vluchtige stoffen verwijdert, met uitzondering van die welke een sterke affiniteit voor de monstermatrix vertonen (bijvoorbeeld polaire verbindingen in waterige monsters).
Voor de huidige methodologie hebben we de techniek van headspace solid-phase microextractie (HS-SPME) in combinatie met GC-MS overgenomen. In het bijzonder hebben we de methodologie ontwikkeld en verbeterd die al door Vaglio et al. werd gebruikt in zijn vorige GC-MS-laboratorium8,9,10.
Oplosmiddelloze extractietechnieken zijn zeer effectief voor het analyseren van kleine, zeer vluchtige verbindingen (die anders gemakkelijk uit een monster kunnen worden verloren) omdat deze methoden verbindingen immobiliseren op een stabiele, solide faseondersteuning. De HS-SPME maakt gebruik van een vezel bedekt met een adsorberend polymeer om vluchtige stoffen in de monsterhoofdruimte op te vangen of om opgeloste verbindingen te extraheren door onderdompeling in een waterige biologische vloeistof11. De polymeercoating bindt de verbindingen niet sterk, daarom kunnen ze door verhitting in de injectiepoort van de GC worden verwijderd. Deze methode is krachtiger dan oplosmiddelextractietechnieken en ook effectiever dan DHS.
In de huidige aanpak zitten monsters in glazen flacons. Deze flacons worden opgewarmd tot een temperatuur van 40 °C om de lichaamstemperatuur van de dieren te simuleren om de vluchtige componenten van de geurmarkering te bevorderen om de hoofdruimte van de flacon in te nemen. Een SPME-vezel, bedekt met 65 μm polydimethylsiloxaan/divinylbenzeen (PDMS/DVB) sorbentmateriaal, wordt blootgesteld aan de headspace-omgeving en vluchtige componenten uit het monster worden op de vezel geadsorbeerd. Bij het verwarmen van de vezel in de inlaatpoort van een GC-MS worden de vluchtige componenten uit de vezel gedesorbeerd en vervolgens gescheiden door de GC. Massaspectrale fragmentatiepatronen worden verkregen voor elk onderdeel met behulp van de MS. Door deze massaspectra te vergelijken met massaspectraal databases, kan het mogelijk zijn om voorlopig de componenten van het geurmerk te identificeren. Door het gebruik van een auto-sampler zijn we in staat om meerdere samples in batches op een consistente manier te analyseren.
Aangezien elk type SPME-vezel een andere affiniteit heeft met polaire chemicaliën, wordt de vezel meestal gekozen afhankelijk van de polariteit en/ of het molecuulgewicht van de doelchemische verbindingen. Bovendien worden de GC-omstandigheden gewijzigd afhankelijk van het type GC-kolom en de kenmerken van de doelchemische verbindingen.
Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurmarkeringen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die componenten van de geurmarkering kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering.
De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn:
<ul style="list-style-type: square;"><li>Het bereik van voorbeeldtypen die kunnen worden geanalyseerd.</li>
	<li>Er zijn geen complexe monstervoorbereidingen of extracties nodig.</li>
	<li>Het vermogen om vluchtige componenten te analyseren.</li>
	<li>De mogelijkheid om de componenten van een mengsel te scheiden.</li>
	<li>Om de gedetecteerde componenten te kunnen identificeren.</li>
	<li>De mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten.</li>
</ul>

<table><tbody><tr><td>10 mL autosampler vials</td><td>Agilent</td><td>5188-5392</td><td>10 ml schroefdopbuisjes met</td></tr><tr><td>18 mm vial caps</td><td>Agilent</td><td>8010-0139</td><td>Magneet met PTFE/siliconen septa</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Agilent</td><td>GC120 PAL autosampler</td><td></td></tr><tr><td>Capillary column</td><td>Agilent</td><td>HP5-MS</td><td>30 m x 0.25 mm; 0.25 &micro;m</td></tr><tr><td>Data analysis software</td><td>Agilent</td><td>-</td><td>ChemStation</td></tr><tr><td>Gas Chromatograph</td><td>Agilent</td><td>7890B</td><td></td></tr><tr><td>Inlet septa</td><td>Agilent</td><td>5182-3442</td><td>Merlin microseal</td></tr><tr><td>Mass Selective Detector</td><td>Agilent</td><td>5977A</td><td></td></tr><tr><td>Reporting software</td><td>Microsoft</td><td>-</td><td>Excel</td></tr><tr><td>Spectral library</td><td>NIST</td><td>-</td><td>NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library</td></tr><tr><td>Spectral library search program</td><td>NIST</td><td>-</td><td>MS Search v.2.2</td></tr><tr><td>Splitless Inlet liner</td><td>Agilent</td><td>5190-4048</td><td></td></tr><tr><td>SPME fibres</td><td>Agilent</td><td>SU57345U</td><td>65 &micro;m PDMS/DVB vezel</td></tr></tbody></table>

bemonstering en analyse van geursignalen van dieren

Sampling and Analysis of Animal Scent Signals

We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen, door gebruik te maken van headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie, om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in dierlijke communicatie. Deze techniek maakt de semi-kwantitatieve analyse van de vluchtige componenten van geurafscheidingen mogelijk door de scheiding en voorlopige identificatie van de componenten in het monster mogelijk te maken, gevolgd door de analyse van piekgebiedverhoudingen om te zoeken naar trends die verbindingen kunnen betekenen die betrokken kunnen zijn bij signalering. De belangrijkste sterke punten van deze huidige aanpak zijn het bereik van steekproeftypen die kunnen worden geanalyseerd; het ontbreken van een complexe monstervoorbereiding of extracties; het vermogen om de componenten van een mengsel te scheiden en te analyseren; de identificatie van de gedetecteerde componenten; en de mogelijkheid om semi-kwantitatieve en potentieel kwantitatieve informatie te verstrekken over de gedetecteerde componenten. De belangrijkste beperking van de methodologie heeft betrekking op de monsters zelf. Aangezien de componenten van specifiek belang volatiel zijn en deze gemakkelijk verloren kunnen gaan of hun concentraties kunnen worden gewijzigd, is het belangrijk dat de monsters na het verzamelen op de juiste manier worden opgeslagen en vervoerd. Dit betekent ook dat de opslag- en transportomstandigheden van monsters relatief duur zijn. Deze methode kan worden toegepast op een verscheidenheid aan monsters (waaronder urine, uitwerpselen, haar en geur-klier geur afscheidingen). Deze geuren bestaan uit complexe mengsels, die voorkomen in een reeks matrices, en vereisen dus het gebruik van technieken om de afzonderlijke componenten te scheiden en de verbindingen van biologisch belang te extraheren.

Volgens dit protocol identificeerden we voorlopig in totaal 32 vluchtige chemische stoffen uit de analyse van 14 ano-genitale geursporen die spontaan op filterpapier werden vrijgegeven door rood-ruches maki's (Varecia variegata rubra) en vergeleken geurprofielen met kenmerken van de signaalgever12. Natuurlijk voorkomende vluchtige stoffen, zoals koolwaterstoffen, terpenen, terpeenalcoholen en ketonen, waren aanwezig in deze profielen en omvatten verbindingen die eerder waren gevonden als ...

We hebben een effectieve methodologie ontwikkeld voor het bemonsteren en analyseren van geursignalen om te begrijpen hoe ze kunnen worden gebruikt in diercommunicatie. In het bijzonder gebruiken we headspace solid-phase microextractie in combinatie met gaschromatografie-massaspectrometrie om de vluchtige componenten van dierlijke geuren en geurmarkeringen te analyseren.

Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren

We have developed an effective methodology for sampling and analysis of odor signals, by using headspace solid-phase microextraction coupled with gas ...

De rol van geur in dierlijke communicatie wordt momenteel onderschat en dus onderbelicht. Er is met name zeer weinig bekend over de chemische veranderingen die ten grondslag liggen aan de reuksignalen bij dieren, waaronder mensen. En dit is ook te wijten aan methodologische uitdagingen, het registreren en kwantificeren van chemische verbindingen van geuren die door dieren worden gebruikt om te communiceren.Er zijn verschillende potentiële uitdagingen bij het werken met zeer complexe chemische mengsels en deze omvatten ook bij het bemonsteren en analyseren van de geurmonsters. We voeren de analyse uit van geuren die door dieren worden gebruikt om te begrijpen hoe ze door hen kunnen worden gebruikt wanneer ze met elkaar communiceren. We combineerden cytochemie met bio-ecologie endocrinologie en cytologie om ons begrip van de rol van geur in dierlijke communicatie te verbeteren.Voor onze huidige methodologie in Wolverhampton hebben we de techniek van Headspace solid phase microstructure in combinatie met gaschromatografie massaspectrometrie aangenomen, gebouwd op en een ongeziene van de methodologie worden gebruikt in het verleden. Monstergeuren worden op een van de volgende manieren verzameld. Eén, spontaan vrijgegeven monstergeuren van gewenneerde proefpersonen.Zo verzamelen dierentuin primaten geurafscheidingen door geurmarkering op steriel filterpapier of urinemonsters rechtstreeks in flacons. Twee, na het trainen van proefpersonen met behulp van positieve versterking verzamelen geur afscheidingen door wrijven geur blik met steriele wattenstaafjes. Drie, na sedatie van proefpersonen verzamelen geurafscheidingen door geurklieren te wrijven met steriele wattenstaafjes, door monsters in steriele 10 milliliter schroef afgedekte, heldere glazen flacons en afdichting met schroef bedekte doppen met P T F E siliconensector.Bewaar de flesjes onmiddellijk bij min 20 graden Celsius. Houd er rekening mee dat het van vitaal belang is dat tijdens de bemonstering schone persoonlijke beschermingsmiddelen zoals nitrilhandschoenen worden gebruikt. Wisselhandschoenen vermijden vaak direct huidcontact met monsters en flacons.Het verdient de voorkeur om gloednieuwe flacons te gebruiken. In het geval van gebruikte flacons is het echter van vitaal belang om de flacons vooraf schoon te maken en vervolgens hetzelfde protocol te gebruiken. Neem omgevingsvlekken elke keer dat geurvlekken worden verzameld.Doe dit door een ongebruikt filterpapier of wattenstaafje en flacons aan het milieu bloot te stellen terwijl de bemonstering wordt uitgevoerd. Monsters worden in het veld bereid. Voor een geur gemarkeerd filterpapier snijdt u ongeveer 10 millimeter vierkant van het papier en plaatst u het in een 10 milliliter schroef met kopruimteflacon.Voor een wattenstaafje snijdt u de swabkop helemaal aan het einde van de swabschacht af en plaatst u deze in een flacon met hoofdruimte. Nadat elk monster is bereid, verwijdert of reinigt u het mes om de bemonsteringsmedia te snijden, met een geschikt antibacterieel doekje en of alcohol en droogt u het grondig. Bewaar alle monsters bij min 20 graden Celsius.Opmerking, monsters moeten worden opgeslagen bij min 20 graden Celsius, maar in het veld opslaan bij de laagst mogelijke temperatuur en zo snel mogelijk overbrengen naar min 20 graden Celsius. Verwijder vóór de analyse monsters uit de vriezer en laat ze minstens een uur op natuurlijke wijze op kamertemperatuur lopen. Stel de analysemethoden op het GCMS als volgt in voor SPMS-analyseomstandigheden volg de aanwijzingen van de fabrikant om SBME-vezels te conditioneren voor het eerste gebruik.Het is van vitaal belang dat de SBME-assemblage correct is geïnstalleerd in de automatische sampler en dat deze is uitgelijnd op de fiberconditioneringseenheid en GC-inlaatpoort van de autosamprilaten. Onjuiste uitlijning kan leiden tot schade of vernietiging van de Sbme-vezel. Zorg ervoor dat de baarsgastoevoer naar de vezelconditioneringseenheid is ingeschakeld.Om de consistentie van de monsterretentietijd te verbeteren, is de analysemethode retentietijd vergrendeld Voeg de monsterflacons toe aan de automatische monsterlade plaats een lege deur met hoofdruimte om als systeem leeg te fungeren in de eerste positie van de automatische monsterlade. Plaats de omgevings blank in de tweede positie en plaats vervolgens alle resterende monsters voor analyse in de volgende posities van de auto sampler tray. Maak een analytische volgorde om elk monster in de monsterlade te analyseren.Selecteer in het startscherm van mass hunter de volgorde voor de menubalk en laad de volgorde in het vervolgkeuzemenu. Een lege volgtabel wordt weergegeven, vul de volgtabel voor alle spaties en voorbeelden in door de juiste informatie in te voegen, behalve als voltooide volgtabel. Let op, de exacte informatie voor de volgtabel is afhankelijk van de laboratoriumopmaak van de tabel.Minimale informatie omvat normaal gesproken de voorbeeldnaam van het monstertype, de bestandslocatie en de analysemethode voor het nummer en de locatie van het gegevensbestand en de naamtoewijzing van een gegevensbestand dat overeenkomt met de voorbeeldnaam verouderde toekomstige gegevensverwerking. Tijdens de analyse kunnen extra monsters aan de reeks worden toegevoegd. Voer de reeks uit door de volgorde in de menubalk te selecteren en voer vervolgens de volgorde uit.Na analyse zijn de monsters zo snel mogelijk terug in de vriezer. Let op, het is mogelijk om monsters opnieuw teanalyseren. Maar opgemerkt moet worden dat sommige vluchtige componenten volledig kunnen zijn geëxtraheerd tijdens de eerste analyse en sommige verbindingen kunnen thermische en bacteriële ontbinding hebben ondergaan bij 40 graden Celsius.Het resultaat van chromatogram is dus mogelijk niet volledig representatief voor de oorspronkelijke geurmarkering. De eerste gegevensanalyse omvat de integratie van chromatogrammen om retentietijd- en piekgebiedgegevens te verkrijgen, samen met voorlopige identificatie van pieken met behulp van camstationsoftware en nestmassaspectraaldatabases. Data-analyse kan handmatig of via een semi-geautomatiseerde methode worden uitgevoerd.Als de semi-geautomatiseerde methode wordt gebruikt, is het soms nuttig om een zekere mate van handmatige gegevensanalyse uit te voeren om voorlopige identificaties te verifiëren. Om gegevensanalyse te starten, opent u het gegevensbestand door op het juiste bestand in de linkernavigatiebalk te klikken. Het totale ionenchromatogram TIC wordt weergegeven in het bovenste venster van het gegevensanalysescherm.Om de TIC te integreren met behulp van de RTE-integrator, selecteert u eerst chromatogram in de menubalk en selecteert u vervolgens integrator in het vervolgkeuzemenu opent een pop-upvenster en kiest u de RTE-integrator. Ga terug naar het chromatogrammenu en selecteer nu integreren. Als u integratieparameters wilt aanpassen zodat pieken of tot meer dan drie keer de basislijnruis worden geïntegreerd, selecteert u opnieuw een chromatogram in de menubalk en vervolgens MS Signal-integratieparameters in het vervolgkeuzemenu.Pas in het pop-upvak het minimale piekgebied aan, indien van toepassing, 1.0 levert acceptabele resultaten op in onze voorbeelden. Als u pieken wilt identificeren en een overzichtsrapport wilt genereren, selecteert u rapporten exporteren vanuit de menubalk en vervolgens rapport met zoekresultaten naar XLS. Opmerking, de spectrale bibliotheken die moeten worden doorzocht, samen met het aantal bibliotheekovereenkomsten dat moet worden weergegeven, moeten vooraf worden ingesteld in de software voordat een bibliotheekzoekopdracht kan worden uitgevoerd.Het resulterende spreadsheetrapport bevat integratiegegevens voor elke piek en een voorlopige spectrale bibliotheekmatch om identiteit toe te wijzen. Meestal moet de bibliotheekkwaliteit of bibliotheekmatch groter zijn dan 80 om de voorlopige identificatie te accepteren. Sla de spreadsheet op.Als u een piek rechtstreeks vanuit de TIC wilt identificeren, kiest u de piek van belang. Als de piek klein is, zoomt u in door een vak rond de piek te tekenen, door de linkermuisknop ingedrukt te houden, strekt u het vak uit over de piek en laat u de muisknop los. Plaats de cursorlijn zo dat deze zich op het hoogste punt van de piek of net erna bevindt.Dubbelklik, de rechtermuisknop en het massaspectrum voor de piek verschijnen in het lage venster van het gegevensanalysescherm. Als u een spectrale bibliotheek wilt doorzoeken, verplaatst u de cursor ergens in het spectrale venster en dubbelklikt u op de rechtermuisknop die de zoekresultaten van de bibliotheek in een nieuw venster zullen verschijnen. Om eerst de achtergrondruis uit een interessant spectrum te verwijderen, dubbelklikt u op de rechtermuisknop op de betreffende piek en klikt u vervolgens op de rechtermuisknop in een gebied zonder pieken direct voor de piek van interesse, klikt u op de aftrekkingsknop in het menulint of selecteert u chromatogram voor de menubalk en trekt u vervolgens spectra af van het vervolgkeuzemenu.Afgetrokken spectrum wordt weergegeven in het onderste venster van het gegevensanalysescherm en geeft een streepje weer naast de scangegevens in de vensterkop. Volgens dit protocol identificeerden we voorlopig in totaal 32 vluchtige chemische verbindingen uit de analyse van 14 genitale geursporen die spontaan op filterpapier werden vrijgegeven door rode gegolfde maki's en vergeleken geurprofielen met kenmerken van de signaalgever die van nature vluchtige stoffen zoals koolwaterstoffen, terpenen, Turpin-alcoholen en ketonen bevatten in deze profielen en de verbindingen bevatten waarvan eerder was vastgesteld dat ze als geslachtshormonen en signalen voor fitness werkten bij andere diersoorten. De verbindingen die voorlopig zijn geïdentificeerd, worden vermeld in tabel één.Representatieve chromatogrammen één van een besturingselement en één van een Lima-geurmerk worden weergegeven in figuur één. Het aantal en de relatieve overvloed van de componenten varieerden van steekproef tot steekproef over verschillende studieonderwerpen. In alle monsters waren echter zes verbindingen aanwezig met het label A tot en met F op het chromatogram.Deze verbindingen waren respectievelijk buigingen uit aan hoogte aan het eiland van E hexanal paracrystal zes paramentha twee acht kleurstof twee pineen vier en pentodecane. De resultaten van deze studie suggereerden dat rode ruches maki's verzonden markering gebruiken om informatie over seks en vrouwelijke leeftijd over te brengen zonder genitale markering die een rol speelt in sociaal seksuele communicatie. Een andere representatieve uitkomst na het gebruik van dit protocol was onze studie van vruchtbaarheidsreclame door vrouwelijke olijfbavianen.We identificeerden in totaal 74 vluchtige stoffen uit de analyse van 395 vrouwelijke bavianen vaginale geurmonsters. Deze omvatten een reeks natuurlijk voorkomende geurige vluchtige stoffen zoals ketonen, alcoholen, aldehyden, terpenen, vluchtige vetzuren en koolwaterstoffen. Typische chromatogrammen die worden gebruikt om lege trollen en vrouwelijke bavianen vaginale geurmonsters uit vruchtbare en niet-vruchtbare periodes te vergelijken, worden weergegeven in figuur twee.We onderzoeken de relaties tussen vaginale geurprofielen en seksuele ontvankelijkheid van vrouwelijke bavianen. Onze resultaten toonden aan dat de totale hoeveelheid vaginale geur verschilt met vruchtbaarheid, wat suggereert dat geur een rol kan spelen bij het signaleren van vrouwelijke bavianenvruchtbaarheid. We vonden ook verschillen in vaginale geur tussen groepstypen, maar we konden de effecten van groepssamenstelling, vrouwelijke leeftijdsimpariteit niet onderscheiden.Het zijn de gecombineerde voordelen van de bemonstering en het gebruik van het GCMS. Dus met behulp van head space solid phase micro extraction kan een breed scala aan verschillende monsters worden geanalyseerd met GCMS. We zijn in staat om de componenten van deze complexe markeringen te scheiden en vervolgens elk van die afzonderlijke componenten te identificeren met behulp van de massaspectrometer.En dan, dus de hele gecombineerde techniek is zeer krachtig en geeft ons veel informatie over deze geurmarkeringen, die in het verleden veel monstervoorbereidingsextractie zouden hebben gehad om de resultaten te kunnen verkrijgen.

sampling-and-analysis-of-animal-scent-signals

Research

JoVE Journal

Behavior

Gedrag

In deze video artikel beschrijven we een nieuwe methode waardoor de bouw van odorant hellingen met een stabiele en controleerbaar geometrieën. We in het kort laten zien hoe deze gradiënten gebruikt kunnen worden om te screenen op olfactorische defecten (volledige en gedeeltelijke anosmie) en meer subtiele kenmerken van chemotaxis gedrag te bestuderen.

Hoge-resolutie Meting van Geur-Driven gedrag in Drosophila Larven

Fundamenteel, maar toch unieke eigenschappen van het knaagdieren olfactorisch systeem hebben ertoe geleid dat het toenemende onderzoek onder biologen. Een relatief eenvoudige beoordeling van de functie is dan ook noodzakelijk. Hier beschrijven we gevoelige tests voor de karakterisering van de muis olfactorische gevoeligheid en voorkeur.

Olfactorische Behavioral Testen in de Adult Mouse

De vergelijkende soort aanpak maakt het mogelijk gedrag neurowetenschappers te verkennen verschillende neurobiologische factoren die samenhangen met specifiek gedrag gezien als kenmerk van een specifiek dier model. Door gebruik te maken van natuurlijk voorkomende verschillen in gedrag tussen nauw verwante soorten, werkt deze techniek niet nodig invasieve technieken om de expressie van het gedrag te manipuleren.

Met behulp van een vergelijkende Soorten aanpak van de neurobiologie van Paternal antwoorden Onderzoek

Olfactorische signalen bemiddelen veel verschillende gedragingen in insecten, en zijn vaak complexe mengsels bestaat uit tientallen tot honderden vluchtige verbindingen. Met gaschromatografie met meerkanaals opname in het insect antennelid lobe beschrijven we een werkwijze voor de identificatie van bioactieve verbindingen.

Identificatie van Olfactorische Vluchtige stoffen met behulp van gaschromatografie-en meergezins-Recordings (GCMR) in de Insect antennaal Lobe

We tonen variaties van de extracellulaire multi-unit opname techniek om geur-reacties van de consument te karakteriseren in de eerste drie fasen van de ongewervelde olfactorische pad. Deze technieken kunnen gemakkelijk worden aangepast aan ensemble activiteit onderzocht andere neurale systemen.

Multi-unit Opname Methoden om neurale activiteit karakteriseren in de Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Olfactorische Circuits

We beschrijven een protocol voor het gebruik van insectantennes in de vorm van elektroantennogrammen (EAG's) op autonome robots. Ons experimentele ontwerp maakt stabiele opnames binnen een dag mogelijk en lost individuele geurvlakken op tot 10 Hz op. De efficiëntie van EAG-sensoren voor olfactorische zoekopdrachten wordt gedemonstreerd bij het besturen van een robot naar een geurbron.

Met behulp van Insect Electroantennogram Sensoren op autonome robots voor olfactorische zoekopdrachten

Muizen produceren een complex multisyllabic repertoire van ultrasone vocalisaties (USV's). Deze USV's worden op grote schaal gebruikt als uitlezingen voor neuropsychiatrische stoornissen. Dit protocol beschrijft enkele van de praktijken die we hebben geleerd en ontwikkeld om consequent de akoestische eigenschappen en syntaxis van muisliedjes te induceren, verzamelen en analyseren.

Eliciting and Analyzing Male Mouse Ultrasonic Vocalization (USV) Songs

Dit protocol worden de stappen beschreven voor het gebruik van de nieuwe software, SwarmSight, voor het bijhouden van de frame-voor-frame van insecten antenne en proboscis posities van conventionele web camera video's met behulp van conventionele computers. De gratis, open-source software verwerkt frames ongeveer 120 keer sneller dan mensen en presteert op beter dan menselijke nauwkeurigheid.

SwarmSight: Real-time Tracking van insecten antenne bewegingen en Proboscis extensie Reflex met een gemeenschappelijke voorbereiding en conventionele Hardware

De Controlled Odor Mimic Permeation System is een eenvoudige, veld-draagbare, low-cost methode van geur levering voor reuktesten en training. Het is opgebouwd uit een geurstof bewaard op een adsorberend materiaal en bevat binnenkant van een doorlaatbare polymeer zak waardoor gecontroleerde afgifte van de geurdamp na verloop van tijd.

Gecontroleerde geur Mimic Permeation Systems voor Olfactorische training en veldtesten

Dit protocol onderzoekt de relatie tussen hersenen en gedrag in hippocampus CA1 bij muizen die door een geurpluim navigeren. We bieden een stapsgewijs protocol, inclusief chirurgie om toegang te krijgen tot beeldvorming van de hippocampus, gedragstraining, miniscope GCaMP6f-opname en verwerking van de hersenen, en gedragsgegevens om de muispositie te decoderen van ROI neurale activiteit.

Miniscoop registreert calciumsignalen op de hippocampus van muizen die door een geurpluim navigeren

Dit protocol stelt methoden vast voor het extraheren en kwantificeren van reacties op het vluchtige seksferomoon in C. elegans, en biedt hulpmiddelen om chemische communicatie en navigatietraject te bestuderen.

Vluchtige seksferomoonextractie en chemo-aantrekkingstest bij Caenorhabditis elegans

Leer geavanceerde methoden voor bemonstering en analyse van geursignalen bij dieren. Deze techniek combineert headspace solid-phase microextractie met gaschromatografie-massaspectrometrie voor inzicht in chemische communicatie.

Bemonstering en analyse van geursignalen van dieren

Meer video's verkennen