Karakterisering van in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door RNA-Seq Analyse
16 mei 2020
Hier gepresenteerd is een stapsgewijze procedure voor in vitro differentiatie van de menselijke primaire keratinocyten door contactremming gevolgd door karakterisering op moleculair niveau door RNA-seq analyse.
In dit protocol beschrijven we een procedure met twee delen. Ten eerste, een monolayer 2D keratinocyten differentiatie methode in vitro door contactremming. Ten tweede, de moleculaire karakterisering door RNA-seq.
De 2D in vitro differentiatie methode is eenvoudig en eenvoudig uit te voeren. Het kan worden gebruikt om opperhuiddifferentiatie te bestuderen, vooral wanneer een groot aantal cellen nodig zijn. Bijvoorbeeld in epigenomische analyse.
De gedetailleerde RNA-seq analyse pijplijn is duidelijk en transparant voor onderzoekers met fundamentele bioinformatica vaardigheden, en het kan worden gebruikt voor elke bulk RNA-seq analyse. Houd er bij het uitvoeren van het differentiatieprotocol voor de allereerste keer rekening mee dat de zaaidichtheid lastig kan zijn. Probeer meerdere zaaien dichtheden om uit te vinden welke het beste werkt met uw cellijn.
Begin met de voorbereiding van keratinocyten groeimedium of KGM en 500 milliliter elk van proliferatie medium en differentiatie medium volgens manuscript richtingen. Zaad primaire keratinocyten bij een dichtheid van 5 tot 20.000 cellen per vierkante centimeter en voeg genoeg proliferatiemedium toe om de cellen te bedekken. Twee dagen na het zaaien, verfrissen de cellen met de proliferatie medium.
Controleer de cellen regelmatig onder de microscoop en verfris het medium om de andere dag. Wanneer de cellen 90% samenvloeiing bereiken, induceert u differentiatie door het medium te veranderen in het differentiatiemedium. Om cellen te verzamelen voor verdere RNA-analyses, was je de cellen twee keer met DPBS en voeg je vervolgens lysebuffer toe.
Verzamel cellen op differentiatiedagen nul, twee, vier en zeven. Na RNA-isolatie wordt dubbelstrengs cDNA geconverteerd en worden RNA-seq-bibliotheken voorbereid op de volgende generatie sequencing. Na de volgorde worden de volgorde-reads gedownload en in kaart gebracht aan het menselijk genoom.
Na het downloaden en installeren van R-pakketten, genereren account tabel van de readspergene.out. tabbestanden en schrijf een voorbeeldgegevensbestand met alle bestandsnamen, de dag van differentiatie en andere relevante voorbeeldgegevens. Raadpleeg bijvoorbeeld de aanvullende coderingsbestanden.
Gebruik vervolgens de teltabel en voorbeeldgegevens om een deseq2-object te genereren dat zowel de telbare als de voorbeeldgegevens bevat. Voor normalisatie van genexpressie normaliseert u de teltabel in het deseq2-object met behulp van deseq2RLD- of VST-normalisatie. Hoewel RLD-normalisatie de voorkeur heeft, is VST-normalisatie veel sneller.
Gebruik de dist-functie in R om de monsterafstand in kaart te brengen op basis van de genormaliseerde leestellingsintensiteiten en voer vervolgens hclustclustering uit op basis van de monsterafstand. Vervolgens plot de warmtekaart met pheatmapfunctie. Tot slot, het genereren van een principe component analyse of PCA plot van de genormaliseerde gelezen tellen intensiteiten met behulp van de plotPCA functie van deseq2.
PCA dient als een instrument in verkennende data-analyse en kan worden gebruikt om afstand en verbinding tussen verschillende monsters te visualiseren. Voer zeer variabele genexpressie analyse met de rowVars functie die de top 500 zeer variabele genen extraheert door te bestellen op de variantie tussen monsters uit verschillende tijdstippen. Deze genen hebben de hoogste standaarddeviatie van hun genormaliseerde intensiteit over dagen van differentiatie.
Voer k-means clustering uit op de zeer variabele genen om ze te clusteren door verschillende expressiepatronen. Visualiseer de genen in een heat map met het pheatmappakket. De intensiteit uitgezet in de heat map is de deseq2 genormaliseerde intensiteit met de mediaan waarde afgetrokken.
Genereer een lijst van uitgedrukte achtergrondgenen die alle genen met meer dan 10 tellingen in één enkel monster omvat en maak een lijst met genen van elk cluster. Ten slotte voert u Gen Ontologie-analyse uit met GOrilla. Gebruik de achtergrondgenlijst als achtergrondset en de lijst met zeer variabele genen in clusters als doelset en klik vervolgens op met zoeken verrijkte GO-termen.
Als alternatief kunnen meer geavanceerde R-gebruikers het pakketclusterProfiler gebruiken om go-termenverrijkingsanalyse te automatiseren. Keratinocytenlijnen van vijf individuen werden gebruikt voor differentiatie in RNA-seq-analyses. De belangrijkste componentanalyse toonde aan dat keratinocyten die differentiatie ondergingen, verbonden waren, maar verschillende algemene genexpressieprofielen hadden.
Zeer variabele genen werden geclusterd om de dynamiek en patronen van genexpressie tijdens differentiatie te visualiseren. Elke cluster van genen werd vertegenwoordigd door de keratinocyten differentiatie kenmerken genen en Gene Ontologie annotatie toonde een duidelijk verschil in genfuncties. In het tweede experiment werden celmorfologie en genexpressieverschillen vergeleken tussen keratinocyten van gezonde controles en cellijnen afkomstig van patiënten die P63-mutaties droegen.
De belangrijkste componentanalyse toonde aan dat de controlecellijnen duidelijk een differentiatiepatroon volgden, maar het genexpressiepatroon van gemuteerde cellen tijdens differentiatie blijft grotendeels vergelijkbaar met dat van zich vermenigvuldigende of ongedifferentieerde cellen. In de clusteringanalyse werden genen in cluster één gesorgeerd in controlecellen en gedeeltelijk gesorgeerd in patiëntencellen die R204W- en R279H-mutaties droegen, maar bleven hoog in cellen die R304W droegen. Deze genen spelen waarschijnlijk een rol in celproliferatie, zoals blijkt uit gene ontologie analyse.
Cluster twee genen werden eerst geïntroduceerd en vervolgens gesorgeerd in controlecellen. Deze genen zijn waarschijnlijk betrokken bij keratinocyten differentiatie als epidermale differentiatie en keratinisatie functies waren sterk verrijkt voor dit cluster. Genen in cluster drie werden pas aan het einde van differentiatie in controlecellen geïnduceerd, wat aangeeft dat ze een rol kunnen spelen in de buitenste laag van de opperhuid.
Bij het analyseren van RNA-seq data is het belangrijk om van tevoren te weten wat je verwachten. Dit zal u helpen zowel met de interpretatie van de kwaliteitscontrole en de PCA plot en bij het beoordelen of uw resultaten zinvol zijn. Onze methoden kunnen worden gebruikt om gentranscriptie te bestuderen, zowel in de epidermale biologie als in andere biologische systemen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een stapsgewijze procedure voor de in vitro differentiatie van menselijke primaire keratinocyten door contactremming, gevolgd door moleculaire karakterisering met behulp van RNA-seq-analyse.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genomics
Achtergrond
- Keratinocyten zijn essentieel voor epidermale differentiatie.
- Het begrijpen van hun differentiatie is cruciaal voor de huidbiologie.
- RNA-seq biedt inzichten in genexpressieprofielen.
- Contactremming is een sleutelmechanisme in celdifferentiatie.
Doel van het onderzoek
- Om een betrouwbare methode voor keratinocytendifferentiatie in vitro te ontwikkelen.
- Om de moleculaire veranderingen tijdens differentiatie te karakteriseren.
- Om studies in epidermale biologie en aanverwante gebieden te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- In vitro cultivatie van menselijke primaire keratinocyten.
- Inductie van differentiatie door contactremming.
- RNA-seq-analyse voor moleculaire karakterisering.
- Beoordeling van genexpressieveranderingen tijdens differentiatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle differentiatie van keratinocyten werd bereikt.
- Onderscheiden genexpressieprofielen werden geïdentificeerd via RNA-seq.
- Contactremming induceerde effectief differentiatie.
- De methode is geschikt voor grootschalige studies.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige aanpak voor keratinocytendifferentiatie.
- RNA-seq-analyse onthult belangrijke moleculaire inzichten.
- Deze methode kan onderzoek in huidbiologie en epigenomica bevorderen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Robust in vitro differentiation and RNA-seq profiling of human primary keratinocytes provide a scalable platform for dissecting epidermal biology and disease mechanisms. This workflow enables high-confidence target validation and mechanistic de-risking at the discovery stage, supporting translational continuity for dermatological and epithelial research portfolios. The approach facilitates quantitative, reproducible molecular characterization essential for early-stage decision-making in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of differentiation pathways and gene regulatory networks in human keratinocytes.
- Supports functional target validation by linking gene expression dynamics to phenotypic outcomes.
- Facilitates mechanistic de-risking for candidate targets implicated in epidermal disorders.
- Provides a quantitative framework for portfolio triage based on molecular signatures.
Screening & Assay Development
- Establishes validated, reproducible 2D keratinocyte differentiation systems for downstream assays.
- Delivers standardized RNA-seq outputs for benchmarking compound or genetic perturbation effects.
- Enables high-throughput readiness for screening gene expression modulators in disease-relevant contexts.
- Supports platform reuse across multiple cell lines and experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro gene expression patterns with in vivo epidermal stratification for translational relevance.
- Enables comparative analysis of healthy versus disease-mutant keratinocytes for biomarker discovery.
- Supports risk-adjusted advancement of targets with validated differentiation phenotypes.
- Provides mechanistic insights to inform preclinical model selection and validation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven gene expression analysis and functional validation in human keratinocytes.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing and pathway clarification through quantitative transcriptomic profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression readouts for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Provides statistical outputs such as PCA, clustering, and GO enrichment to compare differentiation states and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to disease-relevant biology by modeling patient-derived mutations and phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, scalable workflow adaptable to diverse keratinocyte lines and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes differentiation and RNA-seq analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early molecular de-risking.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of dermatology and epithelial biology programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA-seq library preparation, and bioinformatics analysis.
- Needs access to next-generation sequencing platforms and computational infrastructure for data processing.
- Demands cross-team standardization of seeding density, differentiation timing, and data normalization.
- Adaptable to various keratinocyte lines and patient-derived models with protocol optimization.
- Dependent on robust quality control and statistical analysis to ensure data interpretability.
