Validering van Whole Genome Nanopore Sequencing, met behulp van Usutu Virus als voorbeeld
11 maart 2020
We valideerden eerder een protocol voor op amplicon gebaseerde whole genome Usutu virus (USUV) sequencing op een nanopore sequencing platform. Hier beschrijven we de methoden die in meer detail worden gebruikt en bepalen we het foutenpercentage van de nanopore R10-stroomcel.
We gebruiken virus genetische sequencing om te proberen te begrijpen waar virussen vandaan komen en hoe ze zich verspreiden. En om die gegevens in realtime te kunnen gebruiken, bijvoorbeeld tijdens een uitbraak, moeten we precies begrijpen hoe nauwkeurig de gegevens zijn die we leveren. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat het relatief goedkoop is, het is snel, en het maakt real-time basisbevestiging mogelijk die kan worden gebruikt voor in-field sequencing.
Deze methode kan worden gebruikt voor het tijdig genereren van sequentiegegevens die bijvoorbeeld kunnen worden gebruikt om de oorsprong van een veelheid aan ziekteverwekkers te bepalen. Deze techniek kan complex zijn voor de eerste keer gebruikers en fundamentele Unix kennis is vereist. Speciaal voor de installatie van de verschillende softwarepakketten.
De visualisatie van deze methode helpt gebruikers om het foutenpercentage van hun specifieke sequencingprotocollen te bepalen. En om onderzoeksvragen te beantwoorden. De sequentie run wordt gestart op een MinION aangesloten op de MinIT.
Na het voorvormen van een reeks op het Nanopore-platform, laadt u de gegevensbelasting in Porechop. Om besmetting te voorkomen en de nauwkeurigheid te verbeteren, gebruikt u de vlag van de vereisenondersstreping twee, onderstuurt u de vlag van barcodes en voert u de opdracht in zoals aangegeven. Gebruik na het de-multiplexen cutadapt om primersequenties en sequenties te verwijderen met een lengte korter dan 75 nucleotiden met behulp van de opdracht zoals aangegeven.
Gebruik Minimap2 om de-multiplex-reekslezingen in kaart te brengen tegen het paneel met verschillende referentiestammen met Minimap2. En gebruik Samtools om een consensus sequentie te genereren. Voor referentiegebaseerde uitlijningen is het essentieel om een explosie vooraf te vormen en te zoeken met de gegenereerde consensusreeks om de dichtstbijzijnde referentiestam te identificeren.
Herhaal vervolgens de verwijzingsgebaseerde uitlijning met de dichtstbijzijnde referentiestam als referentie. Als u de vereiste leesdekking wilt bepalen om het foutprofiel in Nanopore-sequencing te compenseren, selecteert u de volgordemapping naar één Amplicon en gebruikt u Minimap2 om de Nanopore-reads tegen deze Amplicon in kaart te brengen. Gebruik Samtools om alleen de reads mapping naar Amplicon26 te selecteren en om het bam-bestand om te zetten in fastq met behulp van de opdrachten zoals aangegeven.
Selecteer willekeurig subsets van bijvoorbeeld 200 sequentie leest duizend keer. Alle willekeurig geselecteerde volgorde reads zijn uitgelijnd op Amplicon26. Gebruik KMA om de volgorde leest in kaart te brengen en om onmiddellijk een consensus sequentie te genereren met behulp van de geoptimaliseerde instellingen voor Nanopore sequencing zoals aangegeven door de BC nano vlag.
Als u de gegenereerde consensusreeksen wilt inspecteren, gebruikt u de opdrachten zoals aangegeven. Als u het foutenpercentage wilt weergeven in de statistieken dot txt onder het kopje, gebruikt de in kaart gebrachte basissen voor foutpercentages, de opdracht zoals aangegeven. Gebruik de opdracht zoals aangegeven om het aantal indels weer te geven dat wordt weergegeven onder de kop indels per cyclus.
Met behulp van de nieuwere stroomcel in combinatie met de basiskleur flip-flop resulteert een leesdekking van 40 keer in identieke resultaten in vergelijking met Illumina-sequencing. Een leesdekking van 30 keer resulteert in een foutenpercentage van 0,02%, wat overeenkomt met één fout in elke 585.000 nucleotiden gesequenced. Terwijl een leesdekking van 20 keer resulteert in één fout in elke 63, 529 nucleotiden gesequenced.
Een leesdekking van 10 keer resulteert in één fout in elke 3, 312 nucleotiden gesequenced. Dit betekent dat meer dan 3 nucleotiden per vier Usutu virus genoom worden genoemd verkeerd. Met een leesdekking boven de 30 keer worden er geen indels waargenomen.
Een leesdekking van 20 keer resulteert in de detecties van één indelpositie, terwijl een leesdekking van 10 keer resulteert in indels in 29 posities. Het belangrijkste om te onthouden is dat, hoewel niet altijd duidelijk, updates in software vaak voorkomen en de resultaten kunnen beïnvloeden. Er zijn verschillende opties van software te gebruiken.
We hebben de meest gebruikte programma's gedemonstreerd. Maar verschillende software en verschillende versies van deze software kan resulteren in verschillende uitkomsten. We hebben u een voorbeeld gegeven van hoe we de kwaliteit van de sequentiegegevens die we genereren controleren.
En dat is cruciaal voor betrouwbare uitbraak ondersteuning.
Overzicht
Deze studie beschrijft een gevalideerd protocol voor amplicon-gebaseerde sequencing van het volledige genoom van het Usutu-virus (USUV) met gebruik van een nanopore sequencing-platform. De methoden worden in detail beschreven, waarbij de nadruk ligt op het bepalen van de foutmarge geassocieerd met de nanopore R10 flow cell.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Virologie
- Genomics
- Sequencingtechnologie
Achtergrond
- Inzicht krijgen in de oorsprong en verspreiding van virussen door middel van genetische sequencing.
- Het belang van datanauwkeurigheid tijdens uitbraken.
- Voordelen van nanopore sequencing: kosteneffectiviteit en snelheid.
- Complexiteit voor beginnende gebruikers die basiskennis van Unix vereisen.
Doel van de studie
- Om een gedetailleerde methodologie te bieden voor de sequencing van USUV.
- Om de foutmarges van nanopore sequencing te evalueren.
- Om de nauwkeurigheid van sequencingprotocollen te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van MinION en MinIT voor sequencing.
- Gegevensverwerking met Porechop en cutadapt voor het verwijderen van primers.
- Mapping van sequenties met Minimap2 en het genereren van consensussequenties met Samtools.
- Beoordeling van foutpercentages en indel-posities op basis van variërende read-dekkingen.
Belangrijkste resultaten
- Een read-dekking van 30 keer resulteert in een foutpercentage van 0,02%.
- Bij een hogere dekking (meer dan 30 keer) worden geen indels aangetoond.
- Een lagere dekking leidt tot een toename van fouten en indels.
- Software-updates kunnen de sequeneringsresultaten aanzienlijk beïnvloeden.
Conclusies
- Nanopore-sequencing is een levensvatbare methode voor real-time ondersteuning bij uitbraken.
- Inzicht in de foutmarges is cruciaal voor het genereren van betrouwbare gegevens.
- Verschillende softwareversies kunnen tot uiteenlopende resultaten leiden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Nauwkeurige sequencing van het virale genoom is essentieel voor real-time respons op uitbraken en voor genomische epidemiologie. Inzicht in platformspecifieke foutmarges maakt een betrouwbare datageneratie mogelijk voor besluitvorming in de volksgezondheid. Het valideren van nanopore sequencing ten opzichte van gevestigde platforms waarborgt het vertrouwen in het tracken van pathogenen en de analyse van transmissie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om virale oorsprongen en transmissiepaden te onderzoeken via high-fidelity genoomsequencing.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle hypothesetoetsing tijdens uitbraken met draagbare mogelijkheden voor real-time sequencing.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt gestandaardiseerde workflows voor amplicon-gebaseerde sequenering van virale genomen met een kwantificeerbare beoordeling van de foutmarge.
- Operationele waarde: Faciliteert de reproduceerbaarheid van assays door gedefinieerde drempelwaarden voor read-dekking en optimalisatie van softwareparameters.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Genereert consensussequenties die geschikt zijn voor downstream functionele studies en antigenische karakterisering.
- Operationele waarde: Maakt schaalbare sequencing-pipelines mogelijk die met minimale infrastructuur aanpasbaar zijn aan opkomende virale dreigingen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen workflows voor virale ontdekking, van initiële detectie tot genomische karakterisering, en ondersteunt de identificatie van lead-verbindingen bij de ontwikkeling van antivirale middelen door nauwkeurige stamtracking.
- Discovery Biology: Maakt nauwkeurige identificatie van virale stammen en het volgen van mutaties mogelijk voor mechanistische risicoreductie van therapeutische targets.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve genoomgegevens die geschikt zijn voor het evalueren van de effecten van antivirale verbindingen op virale evolutie.
- Analytics: Genereert foutcijfermetrieken en indel-frequenties die de drempelwaarden voor datakwaliteit bepalen voor go/no-go-beslissingen.
- Translationeel Onderzoek: Ondersteunt de continuïteit van uitbraakdetectie tot preklinische validatie door het leveren van traceerbare gegevens over virale afstammingen.
- Enterprise Hergebruik: Vestigt een draagbare sequentiecapaciteit die toepasbaar is op meerdere virusfamilies en geografische surveillancenetwerken.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar virale evolutie door middel van consensussequencing met foutcorrectie.
- Operationele waarde: Maakt standaardisatie tussen laboratoria mogelijk via een gedefinieerde read-dekking (30x) en softwareprotocollen voor een consistente nauwkeurigheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen bij de ontwikkeling van antivirale middelen door betrouwbare genomische achtergrondinformatie over circulerende stammen te verschaffen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van targets op basis van genetisch gevalideerde virale epidemiologie.
Overwegingen bij de implementatie
- Basiskennis van Unix is vereist voor de installatie van software en het uitvoeren van opdrachten via de command-line.
- Afhankelijk van MinION/MinIT-hardware en toegang tot referentiestammenpanels voor alignment.
- Bioinformatische ondersteuning tussen teams is noodzakelijk voor de standaardisatie van de workflow en versiebeheer van de software.
- Er moet rekening worden gehouden met frequente software-updates die de foutprofielen en consensusresultaten kunnen beïnvloeden.
- De effectiviteit is afhankelijk van het handhaven van een minimale read-dekking (30x) om indels te onderdrukken en een nauwkeurigheid te bereiken die gelijkwaardig is aan die van Illumina.
