Name: Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Leer de isolatie van zuivere fibroblasten en myofibroblasten uit muizenharten voor onderzoek naar wondherstel en fibrose. Deze methode biedt flexibiliteit en hoge zuiverheid voor functionele studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Dr. Ivo Kalajzic bedanken voor de αSMA-GFP muizen. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (NIH) onder Award Number R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering van de NIH onder Award Number R21EB019509 (P.P.Y.), en Scientist Development Grant van de American Heart Association onder Award Number 17SDG33630187 (S.S.). Flow cytometrie analyses werden uitgevoerd in het VUMC Flow Cytometry Shared Resource die wordt ondersteund door het Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) en het Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, geïdentificeerd door diverse set markers. De eiwitmarkers die zijn gebruikt om fibroblasten te identificeren zijn discoidin domeinreceptor 2 (DDR2), fibronectine, vimentin, collageen I en III, en Thy115,16,17,18,19,20. Overwegende dat vimentin is gebruikt om niet-gewonde rustige ...

Cardiale fibroblasten, cellen van mesenchymale oorsprong, spelen een belangrijke rol bij het behoud van de elektrische geleiding en mechanische krachten in het hart in aanvulling op het onderhoud van cardiale architectuur tijdens homeostase1. Na letsel worden deze cellen geactiveerd, uittevouwen en produceren extracellulaire matrix (ECM) eiwitten2. Veel preklinische studies hebben aangetoond fibroblasten als kritische cellulaire regulatoren die de structurele integriteit van een gewond hart3 te handhaven, evenals de belangrijkste effector cellen die verantwoordelijk zijn voor ongecontroleerde productie en afzetting van ECM eiwitten, wat resulteert in stijve littekenvorming en hartfalen4. Fibroblasten zijn een heterogene groep cellen, waardoor het een uitdaging is om hun herstellende functie te ontleden van pro-fibrotische onaangepaste eigenschappen. Onlangs is de functionele heterogeniteit van twee verschillende fibroblast subtypes na myocardiale letsel gedefinieerd, wat wijst op de mogelijkheid van het isoleren van verschillende fibroblast subtypes en het bestuderen van hun rol in wondgenezing5.
Het verkrijgen van een pure fibroblast bevolking is cruciaal in het aflijnen van hun functionele rol in reparatie en fibrose. Echter, de aanwezigheid van meerdere fibroblast markers die andere celtypes herkennen maken het een uitdaging om een wezenlijk zuivere fibroblast bevolking te isoleren6. Verschillende elegante studies hebben slimme manieren bedacht om cardiale fibroblasten te isoleren van niet-gewonde en gewonde myocard. De meest populaire en gevestigde methode voor het verrijken van fibroblasten is door selectieve hechting na enzymatische weefselvertering7.
Bovendien is met de fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) van fibroblasten op basis van celoppervlakteantigenen met succes beschreven8. In de studie, na enzymatische spijsvertering, werden de mesenchymale cellen gesorteerd als lineage-negatief (Lin: Ter119−CD45−CD31−) en gp38-positief (gp38+) van muisharten. Gp38+ve cellen werden bevestigd te zijn fibroblasten op basis van hun co-expressie van col1α1 en andere mesenchymale markers. Hoewel de meeste weefselvertering is voltooid na het ontleden van de ventrikel in een petrischaaltje, heeft een recente studie het gebruik van een direct naaldenzym perfusie van de linker ventrikel onderzocht om myocyten en niet-myocyten te isoleren, waaronder fibroblasten9. Fibroblasten werden vervolgens geïsoleerd door selectieve hechting in dit geval.
Dit protocol beschrijft de isolatie en verrijking van fibroblasten met behulp van drie methoden. De eerste is een reeds vastgestelde methode waarbij selectieve hechting van fibroblasten na enzymatische spijsvertering. De tweede methode wordt gebruikt om voornamelijk te isoleren letsel-geïnduceerde alpha gladde spier uitdrukken myofibroblasten. De derde methode omvat sequentiële, magnetische uitputting van een enzym-verteerd hartcel suspensie van hematopoietische en endotheelcellen. Na uitputting worden fibroblasten/myofibroblasten geïsoleerd op basis van de aanwezigheid van het antigeen MEFSK4 met behulp van magnetische kralen. Onlangs is MEFSK4 beschreven als een antigeen aanwezig op zowel rustige als geactiveerde fibroblasten, waardoor het een geschikte marker is voor fibroblastidentificatie en isolatie. Natuurlijk, alle methoden hier beschreven hebben unieke beperkingen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om de zuiverheid van de geïsoleerde celpopulatie te controleren door stroomanalyse, immunostaining en semi-kwantitatieve real-time PCR. Echter, deze methoden kunnen worden uitgebreid op, en extra markers kunnen worden toegevoegd om andere vervuilende populaties uit te sluiten voorafgaand aan het gebruik van de fibroblast en myofibroblast populaties voor cruciale experimenten uit te sluiten.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-schimmel (Amphotericin B-geoplost; Fungizone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serium Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrate Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collageenase blend (Liberase Blendzyme 3 TH)</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DI water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 met L-Glutamine en HEPES</td><td>Life technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (dPBS) zonder Ca2+ en Mg2+</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FC Blocker (Gepuurd anti-muis CD16/CD32)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Life technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10% geitenserum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) met Ca2+ en Mg2+</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit Buffer poeder</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>Mycoplasma profylactisch (Plasmocin)</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Red Blood Cell Lysis Buffer</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Slow-fade Montage Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natrium azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonaat</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Rat Collageen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD (voorraad: 1 mg/mL oplossing in DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>A1310</td><td>verdunning = 1:1000; RRID =</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>verdunning = 1:250; RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>verdunning = 1:250; RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&alpha;1</td><td>MD Bioproducts</td><td>203002</td><td>verdunning = 1:1000; RRID =</td></tr><tr><td>Ghost dye violet 510 (Formulering: 1 uL/test in DMSO)</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>verdunning = 1:1000; RRID =</td></tr><tr><td>Gepaald anti-muis Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>Gepaald anti-konijn-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>Gepaald anti-konijn-FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>Gepaald anti-rat Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>Gepaald anti-rat Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>verdunning = 1:100; RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>verdunning = 1:200; RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&alpha;-smoothe spier actine (&alpha;SMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>verdunning = 1:1000; RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>Fibroblast specifiek proteïne 1 (FSP1)</td><td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>verdunning = 1:100; RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45 Magnetic Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Magnetic Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-feeder cellen-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>verdunning = 1:100; RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>anti-APC Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>verdunning = 1:100; RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>verdunning = 1:100</td></tr><tr><td>anti-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>verdunning = 1:11; RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td>Andere materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 &micro;m Filter</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 Cel Cultuur Schaal</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro;m Cel Strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipet</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678

isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Hartfibrose in reactie op letsel is een fysiologische reactie op wondgenezing. Er zijn inspanningen geleverd om fibroblastsubtypes te bestuderen en te targeten die fibrose beperken. Echter, fibroblast onderzoek is belemmerd als gevolg van het ontbreken van universeel aanvaardbare fibroblast markers om rustige en geactiveerde fibroblasten te identificeren. Fibroblasten zijn een heterogene celpopulatie, waardoor ze moeilijk te isoleren en te karakteriseren. Het gepresenteerde protocol beschrijft drie verschillende methoden om fibroblasten en myofibroblasten te verrijken van niet-gewonde en gewonde muisharten. Met behulp van een standaard en betrouwbaar protocol om fibroblasten te isoleren zal de studie van hun rol in homeostase en fibrose modulatie mogelijk te maken.

Flow gating regeling demonstreren myofibroblast isolatie met behulp van αSMA-GFP reporter muizen Niet-gewonde harten vertoonden geen detecteerbare GFP+ cellen in αSMA-GFP reporter muismodel; daarom werden zij gebruikt om een poort voor het achtergrondsignaal van het GFP-kanaal na compensatie (figuur 2) vast te stellen. αSMA+ cellen werden gesorteerd op basis van de aanwezigheid van GFP-expressie van de gewonde linkerventrikel 10 dagen na MI. Een klei...

Het verkrijgen van een zuivere populatie van fibroblasten is cruciaal voor het bestuderen van hun rol in wondherstel en fibrose. Hier beschreven is een gedetailleerde methode om fibroblasten en myofibroblasten te isoleren van niet gewonde en gewonde muisharten, gevolgd door karakterisering van hun zuiverheid en functionaliteit door immunofluorescentie, RTPCR, fluorescentie-ondersteunde cel sorteren, en collageen gel contractie.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Dit protocol stelt ons in staat om zowel rustige als letsel-geïnduceerde geactiveerde fibroblast populaties met aanzienlijke zuiverheid te isoleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de flexibiliteit voor improvisatie. Voor stroom, evenals op kralen gebaseerde isolatie, kan men antilichamen tegen vervuilende cellen bevatten om ze uit te sluiten van de geïsoleerde doelcellen.Deze techniek wordt voornamelijk gebruikt voor cardiale fibroblast isolatie. Echter, het kan worden gebruikt om fibroblasten te isoleren van andere weefsels. Het aantonen van deze procedure zal Meiling Melzer, een undergraduate stagiair, en David Beier, een onderzoeksassistent van mijn laboratorium.Om een zes-put plaat voor het opslaan van zes harten tijdens dissectie voor te bereiden, deel twee milliliter koude KHB in elke put, en plaats de plaat op ijs. Spray het lichaam met 70% ethanol. Oriënteer het zodat de ventrale kant wordt geconfronteerd met de experimentator.Speld de aanhangsels vast om interferentie te voorkomen. Zonder piercing de lever, opengesneden de buikhuid en spier. Snijd verticaal in de richting van het borstbeen, zorgvuldig openen van de thorax zonder piercing het hart.Vervolgens blijven snijden door de ribbenkast om het hart bloot te stellen. Met behulp van tangen, voorzichtig til het hart uit de borst, het wegsnijden van een long of overtollig weefsel aan de buitenkant van het hart. Scheid de linker hartkamer.Voor elke dissectie, plaats de ventrikel in een aparte put van de zes-put plaat. Gebruik eerst tangen om de ventrikel in KHB herhaaldelijk te knijpen en te ageren om overtollig bloed te verwijderen. Breng de ventrikel over op een schone, steriele plaat van 10 centimeter.Vervolgens, met behulp van een single-edged blade, snel gehakt van de ventrikel in kleine stukjes. Voeg een milliliter collagenase spijsvertering cocktail, en blijven hakken. Wanneer de stukken klein genoeg zijn om met een micropipet van één milliliter over te brengen, breng ze over op een conische buis van 50 milliliter.Was de plaat twee keer met twee milliliter cocktail en breng de was op de buis. Incubeer de buis gedurende 30 minuten en roep de cellen zoals beschreven in het manuscript opnieuw op met behulp van een pipet van vijf milliliter. Na de eerste resuspensie, incubeer de cellen gedurende 15 minuten, en opnieuw te herhalen met behulp van een 10-milliliter pipet.Plaats vervolgens een 40-micrometer cel zeef op de top van een nieuwe, 50-milliliter conische buis, en prime de zeef door het nat te maken met een tot twee milliliter KHB. Voeg 25 milliliter KHB toe aan de spijsverteringssuspensie en resuspend. Filter de vering door de zeef en vervang de zeef indien nodig.Centrifuge het filtraat op 400 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in 1x RBC lyse buffer met behulp van vijf milliliter buffer per hart. Na het uitbroeden van de suspensie gedurende twee minuten bij kamertemperatuur, centrifugeren de schorsing op 400 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Verwijder de supernatant, en dan resuspend de pellet in een milliliter van KHB. Voeg vervolgens negen milliliter KHB toe aan de vering. Filtreer de suspensie door een geprimede celzeef van 40 micrometer in een nieuwe conische buis van 50 milliliter.Centrifugeren de conische buis op 400 keer g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Ten slotte, verwijder de supernatant, en resuspend de pellet in een milliliter van fibroblast media of PBS. Nadat het celnummer is vastgesteld, fibroblasten kunnen worden geïsoleerd van de schorsing door drie verschillende methoden beschreven in het manuscript.Om te beginnen isolatie door differentiële beplating, bereiden een zes-put plaat door het toevoegen van twee milliliter fibroblast media aan elke put. Draai de plaat om de put bodems te dekken. Als de muis hartcellen zijn opgehangen in PBS, centrifuge en resuspend ze in een milliliter van fibroblast media per hart.Voeg een milliliter celsuspensie, het equivalent van één hart, toe aan elke put. Draai de plaat om cellen gelijkmatig te verdelen. Voeg een extra een tot twee milliliter fibroblast media per put voor een totaal volume van maximaal vier milliliter per put.Incubeer op 37 graden Celsius gedurende vier uur. Omdat de fibroblasten selectief aan de putten zullen kleven, kunnen ze worden geïsoleerd door de media te verwijderen en weg te gooien. Was de resterende cellen met twee milliliter PBS en voeg vervolgens twee tot vier milliliter steriele fibroblastmedia per put toe.Incubeer op 37 graden tot confluent, het veranderen van de media om de twee tot vier dagen. Om te beginnen met de magnetische etikettering en scheiding van CD45-positieve hematopoietische cellen, centrifugeren een suspensie van muis hartcellen op 500 keer g gedurende vijf minuten. Verwijder de supernatant, en resuspend de cel pellet in een milliliter van evenwicht buffer.Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Na het centrifugeren van de cellen weer, resuspend de cel pellet in evenwicht buffer. Voeg CD45-positieve magnetische kralen, en meng goed.Incubeer gedurende ten minste 15 minuten bij vier graden Celsius. Was de cellen door het toevoegen van evenwicht buffer en centrifugeren op 500 keer g gedurende 10 minuten op vier graden Celsius. Verwijder de supernatant, en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.Hersuspend de pellet in evenwicht buffer. Geef de vering door een filter van 40 micrometer om te voorkomen dat celaggregaties de scheidingskolom verstoppen. Plaats vervolgens een scheidingskolom in het magnetisch veld van een geschikte scheidingsteken en maak de kolom in evenwicht met ten minste drie milliliter PBS.Giet de celsuspensie door de kolom en verzamel de flow-through, die de niet-gelabelde cellen bevat, in een conische buis van 15 milliliter. Was de kolom drie keer met drie milliliter evenwichtsbuffer en combineer de wasbeurten met de doorstroom. Verwijder de kolom uit de scheidingsteken en plaats de kolom op een conische buis van 15 milliliter.Om de gelabelde CD45-positieve cellen te ontwijken, pipet vijf milliliter evenwichtsbuffer in de kolom, en duik de kolom stevig. Centrifuge de buis van eluent en de buis van flow-through op 500 keer g. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.Om de isolatie te voltooien, volg de protocollen in het manuscript voor de CD31-positieve endotheelcellen en de MEFSK4-positieve fibroblasten, die vergelijkbaar zijn met het protocol voor de CD45-positieve cellen. Fluorescentie-geactiveerde celsortering werd uitgevoerd op enkele cellen geïsoleerd van alfa-SMA-GFP muisharten na een hartinfarct. Een representatieve gating regeling toont GFP-positieve cellen co-uitdrukken CD31, CD45, of AN2.In de gewonde muizenharten, een klein percentage van endotheelcellen en hematopoietische cellen uitgedrukt GFP. GFP-positive/CD31-negatieve/CD45-negatieve cellen drukten an2 echter niet uit, een pericyte-marker. GFP-positieve cellen uitgedrukt alfa-SMA, collageen een alfa een, periostin, en vimentine.Ongewonde fibroblasten geïsoleerd door selectieve hechting uitgedrukt vimentine, maar toonde geen expressie van alfa-SMA, periostin, of collageen een alfa een. Zowel niet-gewonden als geactiveerde fibroblasten uitgedrukten het MEFSK4-antigeen. Zowel ongewonde fibroblasten, geïsoleerd door selectieve hechting, als myofibroblasten, geïsoleerd en gesorteerd op alfa-SMA-GFP muizen, toonden een vermogen om collageen samen te trekken.Het is belangrijk om het weefsel grondig te gehakt voor incubatie. Vóór scheiding op basis van kraal is het belangrijk om de suspensie door een 40-micrometerfilter te laten gaan om celaggregataties te voorkomen. De cellen gezuiverd door deze methode kunnen verder worden gezuiverd met behulp van magnetische kralen geassocieerd met pericyten-specifieke antilichamen om een hoog niveau van zuiverheid te garanderen.Met de beschikbaarheid van nieuwe kraal-geconjugeerde antilichamen, evenals verslaggever transgene muizen, kan men gebruik maken van deze technieken te isoleren en te bestuderen verschillende cellulaire populaties, niet alleen fibroblasten.

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Volwassen hartspiercellen zijn primaire cellen die kunnen worden geïsoleerd uit dierlijke harten en gekweekt voor meerdere dagen. Binnen deze cultuur periode adenovirale gentransfer kan gebruikt worden om genetisch gecodeerd biosensoren (GEBS) of TL-fusie-eiwitten uit te drukken. Beide benaderingen laten cellulaire onderzoeken door middel van confocale microscopie.

Isolatie en genetische manipulatie van Adult hartspiercellen voor confocale Imaging

Hier beschrijven we de isolatie van volwassen muis cardiomyoctyes met behulp van een Langendorff perfusie-systeem. De resulterende cellen Ca2 +-tolerante, elektrisch rustende en kan gekweekt en getransfecteerd met adeno-of lentivirussen om genexpressie te manipuleren. Hun functionaliteit kan ook worden geanalyseerd met behulp van het MMSYS systeem en patch clamp technieken.

Isolatie, Cultuur en functionele karakterisering van volwassen muis Cardiomyoctyes

De belangrijkste aderente celtypen die zijn afgeleid van menselijk spierweefsel zijn myogene cellen en fibroblasten. Hier worden celpopulaties verrijkt met behulp van magnetisch geactiveerde celsortering op basis van het CD56-antigeen. Daaropvolgende immunolabeling met specifieke antilichamen en het gebruik van beeldanalysetechnieken maakt kwantificering van cytoplasmatische en nucleaire kenmerken in individuele cellen mogelijk.

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

We presenteren een protocol om primaire culturen van muis- en menselijke slokdarmstroomacellen met een myofibroblast-fenotype te genereren. De gekweekte cellen hebben een spindelvormige morfologie, drukken α-SMA en vimentin uit en missen epitheliale, hematopoëtische en endotheelcel-oppervlaktemarkers. Gekarakteriseerde stromacellen kunnen worden gebruikt in functionele studies van epitheel-stroma interacties.

Isolatie van Myofibroblasten van muis en mens slokdarm

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Verscheidene protocollen zijn ontwikkeld en beschreven voor de isolatie van verschillende hartcel typen uit een rat hart. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol beschreven dat de isolatie van hoge kwaliteit grote hartcellen (cardiomyocyten, endotheelcellen en fibroblasten) van een enkel preparaat mogelijk maakt, waardoor de experimentele kosten worden verminderd.

Gelijktijdige isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten, endothelcellen en fibroblasten uit een volwassen rat hart

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren en de teelt van volwassen ratten ventriculaire cardiomyocytes (ARVC). Geïsoleerde ARVC kan worden gebruikt voor de teelt van korte en lange termijn. De isolatie en de teelt van ARVC kunnen spelen een sleutelrol bij de ontwikkeling van nieuwe behandeling regimes voor hartziekten.

Isolatie en teelt van volwassen ratten Cardiomyocytes

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd, Langendorff gebaseerde procedure voor de isolatie van eencellige atriale cardiomyocytes van een rat model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie. Een handmatige regulering van de intraluminale druk van cardiale Holten is geïmplementeerd om de opbrengst van functioneel intact myocytes geschikt voor excitatie-contractie-koppeling studies.

Isolatie van atriale Cardiomyocytes van een Rat Model van metabole syndroom-gerelateerde hartfalen met bewaarde ejectie Fractie

We presenteren een protocol om primaire volwassen fibroblasten op een eenvoudige, snelle en betrouwbare manier te isoleren, die door beginners kunnen worden perforeerbaar (bijv. studenten). De procedure combineert enzymatische weefsel spijsvertering en mechanische opwinding met ultrasone golven om primaire fibroblasten te verkrijgen. Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan specifieke experimentele eisen (bijv. menselijk weefsel).

Ultrasoon-verhoogde primaire volwassen fibroblast-isolatie

Een methode wordt beschreven voor de gelijktijdige isolatie van myocyten en niet-myocyten van zowel de atria als ventrikels van een enkel volwassen muizenhart. Dit protocol resulteert in consistente opbrengsten van zeer levensvatbare cardiale myocyten en niet-myocyten en beschrijft optimale celspecifieke kweekomstandigheden voor fenotyping en in vitro analyse.

Gelijktijdige isolatie en cultuur van atriale myocyten, ventriculaire myocyten en niet-myocyten uit een volwassen muizenhart

Een verfijnde methode van weefselopruiming werd ontwikkeld en toegepast op het volwassen muizenhart. Deze methode is ontworpen om dicht, autofluorescent hartweefsel te zuiveren, met behoud van gelabelde fibroblastfluorescentie toegeschreven aan een genetische reporterstrategie.

Verfijnde op HELDERHEID gebaseerde weefselopruiming voor driedimensionale fibroblastorganisatie in gezonde en gewonde muizenharten

Leer de isolatie van zuivere fibroblasten en myofibroblasten uit muizenharten voor onderzoek naar wondherstel en fibrose. Deze methode biedt flexibiliteit en hoge zuiverheid voor functionele studies.

Isolatie en karakterisering van volwassen cardiale fibroblasten en myofibroblasten

Meer video's verkennen