Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

In-cell FPOP in combinatie met massaspectrometrie is een krachtige nieuwe techniek die wordt gebruikt om eiwiteiwitinteracties en eiwitstructurele veranderingen in levende cellen te bestuderen. Met in-cell FPOP hoeft u geen eiwitten van belang te isoleren, maar u ze eerder bestuderen in hun eigen omgevingen. Dit is vooral handig voor membraaneiwitten.

Met deze methode u veranderingen in structuur- en eiwiteiwerkingen bestuderen in een verscheidenheid aan ziekten, waaronder kanker en genetische aandoeningen, zodat u ze beter begrijpen en karakteriseren. Om te beginnen met de montage van het stroomsysteem, gebruik een decolleté steen om de gesmolten silica buizen te snijden aan de juiste maten. Plaats vervolgens zes kleine cilindrische magneten in een 500 microliter spuit en vul de spuit, een tweede 500 microliter spuit, en twee vijf milliliter spuiten met schede buffer.

Na het verwijderen van de lucht, plaats de spuiten op de spuitpomp en draai de spuit pomp stop, zodat de cel spuit heeft ongeveer 50 microliters links wanneer de motor kraampjes. Met behulp van een lure adapter, sluit een handmatige klep op elke spuit en monteer de silica slang zoals geïllustreerd, zorg ervoor dat de cel draad plus waterstofperoxide silica lijn door het kruis en steek het direct in de 450 ID silica lijn. Wanneer alle buizen zijn aangesloten, plaatst u het stroomsysteem naast een laser en gebruikt u een aansteker om de silicacoating op de 450 micrometer binnendiameterbuizen weg te branden om een venster te maken voor laserbestraling.

Plaats een magnetische roerder boven de celspuit met de zes magneten en zet de spuitpomp op 492,4 microliter per minuut voor een eindstroomsnelheid van 1083,3 microliter per minuut. Stroom buffer door het systeem drie keer om het systeem te spoelen, het controleren van elke verbinding voor eventuele lekken. Gebruik een bolle lens om de excimer laser richten op de silica buizen.

Om het bestralingsvenster te testen, plaatst u een klein stukje papier achter de silicabuis en schakelt u de laser in. Meet vervolgens het gebied dat is verbrand door de bestraling en gebruik het bestralingsvenster en de stroomsnelheid om de benodigde laserfrequentie te berekenen om een uitsluitingsfractie van nul te verkrijgen. Om de cellen voor de procedure te verzamelen, was de cellen van een 70 tot 90%confluent T175 kolfcultuur met een geschikte celkweek zoutoplossing.

Resuspend de cellen in 10 milliliter buffer voor het tellen en het verzamelen van de cellen door centrifugatie. Het is van cruciaal belang om de cellen te tellen om ervoor te zorgen dat ze voldoende zijn voor downstream-analyse, maar niet te veel om ze te laten aggregeren en verstoppen het stroomsysteem. Dan resuspend de cellen op een twee keer 10 tot de zesde cellen per milliliter van schede buffer concentratie en aliquot de cellen in een 500 microliter volume per monster.

Voor in-cell FPOP, vul de twee vijf milliliter spuiten met verse schede buffer, de 500 microliter spuit met de magneten met een aliquot van cellen, en de laatste 500 microliter spuit met vers voorbereide 200 millimolar waterstofperoxide. Zet de magnetische roerder en spike in 220 microliters van dimethylsulfoxide aan een aliquot van Quench. Na het zachte mengen plaatst u de Quench achter het stroomsysteem om de bestraalde monsters te verzamelen en de laser aan te zetten.

Schakel na zeven seconden het stroomsysteem in. Zodra het monster klaar is met stromen, schakelt u de laser uit en mengt u de Quench voorzichtig met het verzamelde monster. Vul vervolgens alle vier de spuiten met een verse buffer en spoel de buffer door het stroomsysteem.

Nadat het systeem het spoelen heeft voltooid, herhaalt u de procedure met een nieuw aliquot van cellen en oplossingen zonder bestraling als de geen lasercontrole om rekening te houden met achtergrondoxidatie in de cellen. Terwijl het volgende monster wordt uitgevoerd, centrifugeren het eerste monster en resuspend de pellet in 100 microliter van een geschikte cel lyse buffer. Breng het monster vervolgens over naar een microcentrifugebuis voor het bevriezen van de flitser in vloeibare stikstof.

Wanneer alle monsters klaar zijn met draaien, demonteren van de stroom systeem en gooi de gebruikte silica buizen. Maak vervolgens alle andere verbindingen schoon door sonicatie gedurende een uur in een 50% water 50% methanol oplossing. Na het isoleren en verteren van de eiwitten uit de cel lysaat volgens standaard protocollen, analyseren van de verteerd cel lysate volgens standaard tandem LCMS protocollen om de FPOP modificatie protium-breed te lokaliseren.

Laad de gegevens vervolgens in een geschikt softwareprogramma voor eiwitanalyse en analyseer de gegevens tegen een relevante eiwitdatabase en het relevante digestenzym. Zodra de bestanden klaar zijn met zoeken, bereken de omvang van FPOP oxidatie op het eiwit van belang. Fluorescentie beeldvorming van orthogonale YZ gestapelde beelden toont een duidelijke scheiding van de schede buffer van de cel oplossing als het stroomt langs de laser bestraling venster.

Driedimensionale gemiddelde warmtekaarten van de schedebuffer of celoplossing kunnen worden gegenereerd om de minimale vermenging van de twee oplossingen te illustreren. Het gebruik van het eencellige stroomsysteem verhoogt het aantal oxidatief gemodificeerde eiwitten met 13 keer. Om de wijziging van de eiwitten van belang in de intacte cellen te bevestigen, kan fluorescentiebeeldvorming worden uitgevoerd na behandeling met waterstofperoxide en bestraling.

Met behulp van tandemmassaspectrometrie kunnen deze wijzigingen verder worden gelokaliseerd op specifieke aminozuren op een eiwit. De verschuiving waargenomen in dit geëxtraheerde ionenchromatogram vertaalt zich in de verandering in hydrofoobiteit veroorzaakt door de geoxideerde methionine in het gemodificeerde peptide. Het vergelijken van in-cell gelabelde actin door in-vitro footprinting onthult vergelijkbare niveaus van oxidatie, wat aangeeft dat actin een vergelijkbare oplosmiddel toegankelijkheid heeft voor zowel in-cell als in-vitro studies.

Verder blijkt uit een vergelijking van de omvang van de snelle fotochemische oxidatie van het eiwit van belang wijzigingen in de toegankelijkheid van het oplosmiddel, de gelabelde residuen berekend op basis van twee actine kristalstructuren dat in-cel snelle fotochemische oxidatie van het eiwit van belang efficiënt de oplosmiddeltoegankelijkheid van het monomerische eiwit onderzoekt. Er zijn verschillende extra stappen die men kan nemen om de detectie van de lagere overvloedige FPOP wijzigingen te verhogen, met inbegrip van 2D chromatografie, subcellulaire fractionatie, en proteomics multiplexing technieken. Met het gebruik van in-cell FPOP kunnen we nu proteomyostructurale biologie uitvoeren om eiwitstructuren beter te verbinden met de cellulaire functie.

Als gevolg van 248 nanometer golflengte die nodig is voor FPOP, zorg ervoor dat u altijd dragen UV-beschermende bril en de juiste kleding om onbedoelde blootstelling aan gereflecteerde of verspreide straling te voorkomen.