Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

We beschrijven een efficiënte methode van oligodendroglial lijncellen zuivering en cultuur. Dit maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen aan te pakken die oligodendrocyten differentiatie en hun interacties met neuronen tijdens het myelineproces controleren. Deze schudtechniek is niet duur en is optimaal om een grote hoeveelheid oligodendrocyten te verkrijgen.

Dergelijke culturen maken de productie van oligodendrocyten-geconditioneerde medium en co-culturen van oligodendrocyten met neuronen mogelijk. Multiple sclerose is een ziekte die wordt veroorzaakt door focale de-myelinatie in het centrale zenuwstelsel, secundair aan oligodendrocyten verlies. Oligodendrocyten cultuur bieden een instrument voor een beter begrip hoe re-myelinatie te bevorderen.

Alleen oligodendroglial celcultuur zou inzicht kunnen geven in intrinsieke mechanismen die ontwikkelingen en biologie van oligodendrocyten reguleren. Co-culturen met neuronen maken het mogelijk om inzicht te krijgen in hun effecten op de neuronale fysiologie. Gebruik om te beginnen gebogen tangen om het hoofd van het dier op ooghoogte te houden.

Gebruik kleine chirurgische schaar om een kleine incisie aan de basis van de schedel te maken en snijd de schedel na de hersenen middellijn. Gebruik tangen om voorzichtig afpellen van de twee delen van de schedel van de middellijn. Gebruik een kleine chirurgische lepel om de hersenen te verwijderen uit het hoofd holte.

Zet de hersenen in een 60-millimeter petrischaal met ijskoude PBS glucose op ijs. Bekijken onder een stereo microscoop, gebruik fijne tangen om het cerebellum, de hersenstam, en de reuklampen te verwijderen uit de hersenhelften. Gebruik fijne tangen om de twee hersenhelften te scheiden.

Gebruik fijne tangen af te pellen van de hersenvliezen. Zet de cerebrale cortices in een petrischaaltje van 60 millimeter op ijs. In een laminaire flow hood, gebruik een scherpe scalpel om fijn hakken de cerebrale cortices.

Breng het gehaktweefsel over in een buis van 50 milliliter met enzymverteringsmedium. Incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Gebruik daarna een pipet om het enzymverteringsmedium voorzichtig te verwijderen en er tegelijkertijd voor te zorgen dat het corticale weefsel aan de onderkant van de buis blijft.

Gebruik een P1000 micropipet om een milliliter DMEM 10%foetale kalfsserum toe te voegen en het weefsel voorzichtig te tritureren. Gebruik een 70-micron filter en de zuiger van een 1-milliliter spuit om het corticale weefsel te filteren in een 50-milliliter buis. Spoel het resterende weefsel op de binnenbandwand van de 50-milliliter buis meerdere malen met DMEM 10%foetale kalfsserum.

Vul de buis van 50 milliliter met DMEM 10%foetaal kalfsserum. Centrifuge op 423 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend de cel pellet met twee milliliter DMEM 10%foetale kalf serum.

Triturate voorzichtig de celpellet met de P1000 micropipet en vervolgens met de P200 micropipet. Verdun de celsuspensie met het juiste volume van DMEM 10%foetaal kalfsserum. Plaat vijf milliliter van de celsuspensie op een T-150 kolf bij een dichtheid van één keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter.

Voeg 20 milliliter warme DMEM 10% foetale kalfsserum toe aan elke T-150 kolf. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Na het schudden van het monster 's nachts bij 250 rpm en 37 graden Celsius, oogst de supernatant in de kolf met voornamelijk oligodendrocyte lijncellen, maar ook, sommige microgliale cellen, en plaat op niet-gecoate 100-millimeter Petri gerechten.

Incubeer de petrischaaltjes gedurende 15 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Dit maakt het verwijderen van microgliale cellen door differentiële snelle hechting op het oppervlak van de schotel. Vul ondertussen elke T-150-kolf met 25 milliliter warm, vers bereid kweekmedium en incubbate in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5% kooldioxide tot het tweede schudden.

Breng vervolgens de supernatant van de petrischaaltjes over in nieuwe niet-gecoate petrischaaltjes van 100 millimeter om hechting van resterende microgliale cellen mogelijk te maken. De petrischaaltjes 15 minuten in een bevochtigde couveuse van 37 Graden Celsius onder 5% kooldioxide incubeer maken. Verwijder de supernatant van elke twee petrischaaltjes, die niet-aanhangende oligodendrocyte afstammingcellen bevatten, en breng het over in een buis van 50 milliliter.

Gooi de petrischaaltjes verguld met microglia. Centrifugeren de buizen gedurende vijf minuten op 423 keer g. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend de cel pellet met een milliliter van Bottenstein-Sato medium.

Pool alle pellets in een gemeenschappelijke buis van 50 milliliter en pas het volume aan op 20 of 30 milliliter, afhankelijk van de celdichtheid met bottenstein-Sato medium. Plaat twee of drie voorgecoate petrischaaltjes van 100 millimeter met 10 milliliter van de celsuspensie. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide.

Twee uur later, duidelijk het puin van de petrischaaltjes door het verfrissen van alle Bottenstein-Sato medium. Twee dagen incubeer in het medium in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Na twee dagen, onderzoek de cultuur onder een microscoop.

In een laminaire stroomkap, onder steriele omstandigheden, vernieuw het kweekmedium met 10 milliliter warm MPB-27 laag medium. Twee dagen incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%koolstofdioxide. Om de OCM te oogsten, verzamel je de supernatant met oligodendrocyten uitgescheiden factoren.

Filter steriliseer de OCM met een filter van 0,22 micron. In dit protocol werden oligodendrocyten lijncellen gezuiverd uit gliaculturen door astrocyten en microglia af te schudden. Analyse van de expressie van verschillende markers gaf aan dat oligodendrocyten culturen waren meestal pre-oligodendrocyten met 90 plus of min 4%van O4 positieve cellen, 85 plus of min 7%NG2 positieve cellen, en 4,7 plus of min 2,1% van PLP positieve cellen, terwijl 7,2 plus of min 2,5% van de cellen waren GFAP positieve astrocyten.

OCM geproduceerd uit dergelijke culturen werden toegevoegd op drie dagen in vitro aan gezuiverde hippocampal neuron culturen. Deze behandeling bevordert de clustering van notale eiwitten. Myelinatie van hippocampal neuronen werden bestudeerd door toevoeging van oligodendroctyes op 14 dagen in vitro.

Van 20 tot 24 dagen in vitro, immuno kleuring van myeline markers, zoals myeline basiseiwit, toegestaan visualisatie van de myeline segmenten en knooppunten van Ranvier. Core PBS is belangrijk voor het verwijderen van hersenvliezen. De stevige clearing is van cruciaal belang voor oligodendroctyes levensvatbaarheid en het realiseren van de sterke punten van de stroom toegepast met de pipet.

Oligodendrocyte-geconditioneerd medium kan worden toegevoegd aan neuronale culturen om inzicht te krijgen in de impact van oligodendroctyes uitgescheiden factoren op de neuronale fysiologie. Co-culturen van oligodendroctyes met neuronen kunnen ook worden uitgevoerd om het myelinatieproces te bestuderen.