Name: Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Leer een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyt-geconditioneerd medium voor co-cultuurexperimenten met neuronen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Rémi Ronzano bedanken voor zijn wijze advies in de handschriftredactie. Dit werk werd gefinancierd door ICM, INSERM, ARSEP foundation grant aan NSF en Bouvet-Labruyère prijs.

De zorg en het gebruik van ratten in dit experiment is in overeenstemming met het institutionele beleid en de richtlijnen (UPMC, INSERM en Richtlijn 86/609/EEG van de Raad van de Europese Gemeenschap). Het volgende protocol is ingesteld voor een standaard nest van 12 pups.
1. Bereiding van de kolven (~5 min)
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit de dag voor de dissectie in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Bestrijk de 150 cm2 kolven (T150) met filterdop (1 kolf voor 2 pups) met 5 mL polyethyleen (PEI, 100 mg/L, zie protocol in aanvullend dossier 1).</li>
	<li>Bewaar de kolven 's nachts op 4 °C.</li>
	<li>Spoel gecoate kolven 3 keer af met steriel gedestilleerd water op de dag van dedissectie.</li>
</ol>2. Voorbereiding van de media (~ 10 min)
OPMERKING: Voer de stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Bereid 500 mL kweekmedium voor, bestaande uit Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en penicilline-streptomycine (100 IU/mL).</li>
	<li>Bereid 20,6 mL van het enzymverteringmedium voor in een 50 mL-buis, bestaande uit 20 mL DMEM, 200 μL DNase (50 μg/mL), 200 μL papaïne (30 U/mL) en 200 μL L-cysteïne (0,24 mg/mL).</li>
	<li>Filter de media steriliseren met behulp van een 0,22 μm-filter.</li>
	<li>Houd de media in de laminaire stroomkap op kamertemperatuur (RT) tot dissectie.</li>
</ol>3. Voorbereiding op dissectie (~10 min)
OPMERKING: Voer de stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Bereid 100 mL fosfaatgebufferde zoutlijn voor zonder calcium en magnesium (PBS; 1x). Filtersteriliseren met behulp van een 0,22 μm filter.</li>
	<li>Bereid 50 mL ijskoude 1x PBS-oplossing voor, aangevuld met 750 μL glucose. Filtersteriliseren met behulp van een 0,22 μm filter.</li>
	<li>Vul een 100 mm petrischaal met 1x PBS voor reinigingsinstrumenten en drie 60 mm petrischaaltjes met ijskoude PBS-glucose voor weefseloogst. Zet de petrischaaltjes op ijs tot het ontleding.</li>
</ol>4. Dissectie
OPMERKING: Dissectie wordt uitgevoerd van mannelijke en vrouwelijke Wistar rat pups op postnatale dag (P) 2.
<ol><li>Om een steriele omgeving te bieden, zorg ervoor dat de bank schoon met 100% ethanol. Steriliseer alle chirurgische gereedschappen met 100% ethanol.</li>
	<li>Spuit voorzichtig de hals van de pup met 70% ethanol.</li>
	<li>Gebruik grote chirurgische schaar om het dier te onthoofden en plaats het hoofd in een 100 mm petrischaal met ijskoude PBS-glucose.</li>
	<li>Gebruik gebogen tangen om het hoofd van het dier op ooghoogte te houden. Gebruik kleine chirurgische schaar om een kleine incisie te maken aan de basis van de schedel en snijd de schedel na de middellijn van de hersenen.</li>
	<li>Gebruik tangen om de twee delen van de schedel voorzichtig van de middellijn af te pellen.</li>
	<li>Gebruik een kleine chirurgische lepel om de hersenen te verwijderen uit de hoofdholte. Doe de hersenen in een petrischaal van 60 mm met ijskoude PBS-glucose op ijs.</li>
	<li>Bekijken onder een steromicroscoop, gebruik fijne tangen om de cerebellum, de hersenstam en reukbollen te verwijderen uit hersenhelften.</li>
	<li>Gebruik fijne tangen om de twee hersenhelften te scheiden. Gebruik fijne tangen om de hersenvliezen af te pellen. Doe de cerebrale cortices in een 60 mm-petrischaaltje op ijs. OPMERKING: IJskoude PBS is cruciaal voor het correct verwijderen van hersenvliezen.</li>
</ol>5. Weefseldissociatie
OPMERKING: Voer de stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Gebruik een scherpe scalpel om de cerebrale cortices fijn te hakken. Breng het gehakte weefsel over in een buis van 50 mL die enzymverteringmedium bevat.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Gebruik een p1000 micropipet om het spijsverteringsmedium van het enzym voorzichtig te verwijderen en ervoor te zorgen dat het corticale weefsel aan de onderkant van de 50 mL-buis blijft.</li>
	<li>Gebruik een p1000 micropipetom om 1 mL DMEM-10% FCS toe te voegen en het weefsel voorzichtig te trituraleren.</li>
	<li>Gebruik een 70 μm filter en een zuiger van een 1 mL spuit om het corticale weefsel te filteren in een buis van 50 mL. LET OP: Men kan restweefsel op de binnenbuiswand meerdere malen spoelen met DMEM-10% FCS.</li>
	<li>Vul de 50 mL buis met DMEM-10%FCS. Centrifugeer bij 423 x g voor 5 min bij RT. Verwijder supernatant en breg de celpellet met 2 mL DMEM-10%FCS opnieuw op.</li>
	<li>Voorzichtig triturate celpellet met een p1000 micropipet en vervolgens met een p200 micropipette. Verdun de celvering met het juiste volume DMEM-10%FCS. LET OP: Twee hersenen = een T150 = 5 mL DMEM-10%FCS.</li>
	<li>Plaat 5 mL van de celvering op een T150 met een dichtheid van 1 x 105 cellen/cm2. Voeg 20 mL warme DMEM-10%FCS toe aan elke T150. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Vernieuw de helft van het kweekmedium na 6 dagen in vitro (DIV) met warme DMEM-10%FCS.</li>
</ol>6. Schudden voorbereiding
<ol><li>Voer schudden voorbereiding op de dag voor het schudden in een laminaire stroom kap onder steriele omstandigheden.</li>
	<li>Vernieuw de helft van het kweekmedium door vers warm kweekmedium in de kolf toe te voegen en uit te broeden bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
</ol>7. Schudden
<ol><li>Bestrijk drie 100 mm petrischaaltjes met PEI. Bewaar ze 's nachts op 4 °C.</li>
	<li>Bedek de kolven met paraffinefolie en doe de kolven in een plastic zak. Schud kolven met gliacellen 's nachts bij 250 tpm bij 37 °C. OPMERKING: Eerste schudden wordt uitgevoerd op 8 DIV en men kan uitvoeren tot drie verschillende schudden (zie figuur 1 voor timing).</li>
</ol>8. OL-lijncellen oogsten en cultuur
OPMERKING: Deze stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Op de dag na het schudden, bereid Bottenstein-Sato (BS) medium volgens tabel 1.</li>
	<li>Spoel gecoate petrischaaltjes 3 keer af met steriel gedestilleerd water.</li>
	<li>Oogst de supernatant van de kolven met voornamelijk OL-lineagecellen, maar ook enkele microgliale cellen en plaat het op niet-gecoate 100 mm petrischaaltjes. OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk microgliale cellen te verwijderen door middel van differentiële snelle hechting op het oppervlak van de schotel.</li>
	<li>Bebroed de petrischaaltjes gedurende 15 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Vul elke T150-kolf met 25 mL warm vers bereid kweekmedium en incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2 tot de tweede shake.</li>
	<li>Breng de supernatant van de petrischaaltjes over in nieuwe niet-gecoate 100 mm petrischaaltjes om hechting van resterende microgliale cellen mogelijk te maken.</li>
	<li>Bebroed de petrischaaltjes gedurende 15 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Verwijder de supernatant, die niet-aanhangende OL-lineagecellen bevat, en breng deze over in 50 mL-buizen (supernatant uit 2 petrischaaltjes voor een buis van 50 mL). Gooi petrischaaltjes verguld met microglia.</li>
	<li>Centrifugeer de supernatant gedurende 5 min bij 423 x g. Verwijder supernatant en breg de celpellet met 1 mL BS medium voorzichtig. Bundel alle pellets in een gemeenschappelijke 50 mL buis en pas het volume aan tot 10 mL met BS medium.</li>
	<li>Bepaal celdichtheid tellencellen onder een microscoop. OPMERKING: Er moet een celdichtheidtussen 3 x 10 5/mL en 5 x 105/mLworden verkregen.</li>
	<li>Voeg 20 mL BS toe als de celdichtheid hogeris dan of gelijk is aan 4 x 10 5/mL om een eindvolume van 30 mL te verkrijgen, of voeg slechts 10 mL BS toe als de celdichtheid minder dan 4 x 105/mLis om een eindvolume van 20 mL te verkrijgen.</li>
	<li>Plaat twee of drie voorgecoate 100 mm petrischaaltjes met 10 mL celvering. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Ruim het puin van de petrischaaltjes door alle BS medium 2 uur later te vernieuwen. OPMERKING: Onderzoek de cultuur onder de microscoop voor en na het opruimen om de celdichtheid en efficiëntie van het verwijderen van puin te verifiëren.</li>
	<li>Incubeer gedurende 2 dagen in BS-medium in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2. LET OP: Onderzoek de cultuur onder de microscoop. De samenvloeiing moet 70% tot 80% zijn.</li>
</ol>9. OCM-productie
OPMERKING: Voer deze stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Bereid NB-B27low medium volgens tabel 2.</li>
	<li>Vernieuw kweekmedium met 10 mL warm NB-B27low medium. Incubeer gedurende 2 dagen in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Oogst de OCM, d.w.z. supernatant met OL uitgescheiden factoren. Filtersteriliseren OCM met behulp van een 0,22 μm filter. LET OP: Bewaar OCM maximaal 2 maanden bij 4 °C.</li>
</ol>10. OCM-toevoeging
OPMERKING: Stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden. OCM kan worden toegevoegd aan gezuiverde hippocampal neuron culturen bereid volgens het volgende protocol14, en verkregen door toe te voegen, 24 uur na isolatie, de anti-mitotische middelen uridine en 5- fluorodeoxyuridine (5 μM) voor 36 uur.
<ol><li>Verwijder bij 3 DIV alle neuron kweekmedium met anti-mitotische middelen en voeg 500 μL verse warme OCM toe.</li>
	<li>Vernieuw de helft van het medium om de 3 dagen met vers gemaakte warme NB-B27. LET OP: Dergelijke culturen kunnen tot 21 DIV worden gehandhaafd.</li>
</ol>11. Toevoeging van OL aan gezuiverde hippocampal neuron cultuur
OPMERKING: Voer de volgende stappen uit in een laminaire stroomkap onder steriele omstandigheden. OLs kunnen worden toegevoegd aan gezuiverde hippocampal culturen verkregen op dezelfde manier als hierboven beschreven.
<ol><li>Bereid co-cultuur medium volgens tabel 3.</li>
	<li>Haal de OL-cultuur op 70% tot 80% samenvloeiing. Spoel af met 2 mL warme 1x PBS.</li>
	<li>Om de cellen los te maken, voegt u 2 mL van 0,25% trypsin toe aan een 100 mm petrischaal.</li>
	<li>Incubeer gedurende 5 min in een bevochtigde couveuse bij 37 °C onder 5% CO2.</li>
	<li>Voeg 2 mL DMEM-10% FCS toe om de enzymatische reactie te blokkeren. Oogst het supernatant met OL-lineagecellen.</li>
	<li>Centrifugeer bij RT 423 x g voor 5 min. Verwijder supernatant zorgvuldig en brep de celpellet opnieuw op in warm co-kweekmedium om een concentratie van 1,25 x 105 cellen/mL te verkrijgen.</li>
	<li>Voeg OL toe aan de cultuur van gezuiverde hippocampalneuronen door 200 μL neuron kweekmedium te verwijderen en 200 μL celvering per put (2,5 x 104 cellen/put) van een 24-putplaat toe te voegen.</li>
	<li>Ververs de helft van co-cultuur medium om de 2-3 dagen. LET OP: Co-culturen kunnen tot 24 DIV worden gehandhaafd.</li>
</ol>

<ol><li>Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+myelin%3A+a+success+story%5BTitle%5D)+AND+%22Novartis+Foundation+Symposium%22%5BJournal%5D)">The acquisition of myelin: a success story.</a> Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).</li>
<li>Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+versus+GABA+in+neuron-oligodendroglia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication.</a> Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).</li>
<li>Sherman, D. L., Brophy, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+axon+ensheathment+and+myelin+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).</li>
<li>Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+sodium+channel+clustering+and+its+influence+on+axonal+impulse+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+life+sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction.</a> Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).</li>
<li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+and+the+trophic+support+of+long+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelination and the trophic support of long axons.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).</li>
<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li>
<li>Birey, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+Stress-Induced+Loss+of+NG2+Glia+Triggers+Emergence+of+Depressive-like+Behaviors+through+Reduced+Secretion+of+FGF2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2.</a> Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).</li>
<li>Frühbeis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter-triggered+transfer+of+exosomes+mediates+oligodendrocyte-neuron+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication.</a> PLoS Biology. 11 (7), e1001604(2013).</li>
<li>Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocytes+regulate+presynaptic+properties+and+neurotransmission+through+BDNF+signaling+in+the+mouse+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Sakry, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+modulate+the+neuronal+network+by+activity-dependent+ectodomain+cleavage+of+glial+NG2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2.</a> PLoS Biology. 12 (11), e1001993(2014).</li>
<li>Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte+precursor+cells+synthesize+neuromodulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors.</a> PloS One. 10 (5), e0127222(2015).</li>
<li>Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelin+in+the+Central+Nervous+System%3A+Structure%2C+Function%2C+and+Pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology.</a> Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+conduction+velocity+linked+to+clustering+of+nodal+components+precedes+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).</li>
<li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Dean, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+differences+in+perinatal+rodent+oligodendrocyte+lineage+progression+and+its+correlation+with+human%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human.</a> Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).</li>
<li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligodendrocyte%2C+Astrocyte%2C+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development%2C+Damage%2C+and+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71(2016).</li>
<li>Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+allelic+series+at+the+PDGFalphaR+locus+indicates+unequal+contributions+of+distinct+signaling+pathways+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development.</a> Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).</li>
<li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+steps+of+oligodendrogenesis%3A+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).</li>
<li>Moyon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demyelination+Causes+Adult+CNS+Progenitors+to+Revert+to+an+Immature+State+and+Express+Immune+Cues+That+Support+Their+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration.</a> Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myelination+of+rodent+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Myelination of rodent hippocampal neurons in culture.</a> Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).</li>
<li>Thetiot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+mechanism+of+early+nodal+clustering+and+myelination+onset+in+GABAergic+neurons+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system.</a> bioRxiv. , 763573(2019).</li>
<li>Dubessy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+a+Contactin+multi-molecular+complex+secreted+by+oligodendrocytes+in+nodal+protein+clustering+in+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS.</a> Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).</li>
<li>Barateiro, A., Fernandes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+oligodendrocyte+lineage+progression%3A+in+vitro+models+of+proliferation%2C+differentiation+and+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).</li>
<li>Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Immunostaining+of+Myelinating+Organotypic+Cerebellar+Slice+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).</li>
<li>Mannioui, A., Zalc, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+Demyelination+and+Remyelination+in+a+Transgenic+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology+%28Clifton%2C+N.J.%29%22%5BJournal%5D)">Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).</li>
</ol>

Geen van de auteurs heeft concurrerende belangen of tegenstrijdige belangen.

Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor het verkrijgen van hoogverrijkte oligodendrogliale lijncelculturen uit gemengde gliaculturen, aangepast aan een eerder gepubliceerde methode16, en de daaropvolgende productie van OL-geconditioneerd medium. Deze schudtechniek is niet duur, kan drie keer worden herhaald en is optimaal om een hoge hoeveelheid gezuiverde OLs te verkrijgen, zoals cellen gekweekt in Bottenstein-Sato (BS) medium met PDGFα vermenigvuldigen. Gliacellen worden bereid met behulp...

Oligodendrocyten (OLs) zijn gliacellen van het centrale zenuwstelsel (CNS) die myeline wikkelen rond axonen genereren. OLs zijn afkomstig van oligodendrocyte precursorcellen (OPC's) die zich vermenigvuldigen binnen de ventriculaire zones van de embryonale CNS en vervolgens migreren en differentiëren tot volledig volwassen OLs (d.w.z. myelinevormende cellen)1. OPC's zijn overvloedig aanwezig tijdens de vroege ontwikkeling, maar ook blijven bestaan in de volwassen hersenen waar ze vertegenwoordigen de belangrijkste proliferative cel bevolking2. Een enkele OL ensheathes meerdere axonen in niet-prikkelbare secties (dat wil zeggen, internodes), en de rand van elke myeline lus hecht aan de axon vormen van het paranodale domein dat cruciaal is voor de isolerende eigenschappen van myeline1,3. Tussen de paranodes zijn kleine ongeelde gaten genaamd de knooppunten van Ranvier. Deze knooppunten zijn rijk aan voltage-gated natriumkanalen (Nav), waardoor de regeneratie en snelle verspreiding van actiemogelijkheden door middel van saltatory geleiding4. Deze nauwe interactie maakt ook axonale energieondersteuning mogelijk door middel van neuronale opname van lactaat van OLs5,6.
De rijping van oligodendrogliale lineagecellen en het myelinatieproces worden strak gereguleerd door hun interacties met neuronen7. Inderdaad, OLs en OPC's, ook wel NG2-cellen, uitdrukken een scala aan receptoren voor neurotransmitters, en kan input ontvangen van excitatory en remmende neuronen, waardoor ze neuronale activiteit die hun proliferatie en / of differentiatie kan leiden tot myeliniserende cellen2voelen. Op zijn beurt scheiden OPC's/OLs microvesicles en eiwitten af in de extracellulaire ruimte die alleen al neuromodulatieve en neuroprotectieve functies8,9,10,11,12bemiddelt. De moleculaire mechanismen die de verschillende vormen van interacties tussen oligodererogliale lineagecellen en neuronen regelen, moeten echter nog volledig worden ontcijferd.
Bovendien worden ols in verschillende CNS-pathologische omstandigheden voornamelijk beïnvloed, waardoor hun interactie met neuronen wordt verstoord. Bijvoorbeeld, bij Multiple Sclerose (MS), neurologische disfunctie wordt veroorzaakt door focale demyelinatie in de CNS, secundair aan OLs verlies dat kan leiden tot axonale schade en aanverwante invaliditeitaccumulatie. Remyelinatie kan plaatsvinden, zij het onvoldoende in de meeste gevallen13. Vooruitgang in het afgelopen decennium, als gevolg van de ontwikkeling van immunotherapieën, hebben het terugvalpercentage verminderd, maar het bevorderen van remyelinatie blijft tot op heden een onvervulde behoefte. Als zodanig is een beter begrip van ols-rol, functies en invloeden van bijzonder belang voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën voor een breed spectrum van CNS-aandoeningen.
Hier beschrijven we de methoden van OLs zuivering en cultuur. Dit maakt nauwkeurig onderzoek mogelijk van intrinsieke mechanismen die hun ontwikkeling en biologie reguleren. Bovendien maken dergelijke hoogverrijkte OLs-culturen de productie mogelijk van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM), dat kan worden toegevoegd aan gezuiverde neuronculturen om inzicht te krijgen in de impact van OLs-geafscheideerde factoren op neuronale fysiologie en connectiviteit. Verder beschrijven we hoe we een in vitro co-cultuursysteem implementeren waarbij gezuiverde oligodendrocyten en neuronen worden gecombineerd, waardoor de mechanismen die (her)myelinatie reguleren, kunnen worden aangepakt.

<table><tbody><tr><td>5-fluorodeoxyuridine</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose oplossing</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Deoxyribonuclease I)</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 100%</td><td>Sigma</td><td>32221-M</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>VWR Chemicals</td><td>83801.360</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>L-cysteïne</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline zonder calcium en magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleeniminee (PEI)</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td></td></tr><tr><td>Tetraboraat decahydraat</td><td>Sigma</td><td>B9876</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>Bottenstein-Sato (BS) media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrine humaan</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>T4 (L-Thyroxine)</td><td>Sigma</td><td>T1775</td><td></td></tr><tr><td>Co-cultuur media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>apo-Transferrine humaan</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>BSA (Bovine Serum Albumine)</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>Ceruloplasmine</td><td>Sigma</td><td>239799</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>31966021</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortison</td><td>Sigma</td><td>H4001</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-cysteïne</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>ThermoFisher</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human CNTF</td><td>Sigma</td><td>450-13</td><td></td></tr><tr><td>Natriumseleniet</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumzout)</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin B12</td><td>Sigma</td><td>V6629</td><td></td></tr><tr><td>Gereedschap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 µm filter</td><td>Sartorius</td><td>514-7010</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuit</td><td>Terumo</td><td>1611127</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petrischaal</td><td>Dutscher</td><td>193100</td><td></td></tr><tr><td>15 mL buis</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1867</td><td></td></tr><tr><td>50 mL buis</td><td>Corning Life Science</td><td>734-1869</td><td></td></tr><tr><td>60 mm petrischaal</td><td>Dutscher</td><td>067003</td><td></td></tr><tr><td>70 µm filter</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Binoculair microscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Fijn pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Grote chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>Swann-Morton</td><td>233-5528</td><td></td></tr><tr><td>Schakelaar</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische schaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleine chirurgische lepel</td><td>Bar Naor Ltd</td><td>BN2706</td><td></td></tr><tr><td>T150 cm2 fles met filterdop</td><td>Dutscher</td><td>190151</td><td></td></tr><tr><td>Dier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 Wistar-rat</td><td>Janvier</td><td>RjHAn:WI</td><td></td></tr></tbody></table>

generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

Generation of Oligodendrocytes and Oligodendrocyte-Conditioned Medium for Co-Culture Experiments

In het centrale zenuwstelsel staan oligodendrocyten bekend om hun rol in axonmyelinatie, die de voortplanting van actiemogelijkheden versnelt door middel van zoutotoergedrag. Bovendien, een toenemend aantal rapporten suggereren dat oligodendrocyten interageren met neuronen buiten myelinatie, met name door de afscheiding van oplosbare factoren. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarmee zuivering van oligodendrogliale afstammingscellen uit gliacelculturen ook astrocyten en microgliale cellen bevat. De methode is gebaseerd op 's nachts schudden bij 37 °C, waardoor selectieve onthechting van de bovenliggende oligodendrogliale cellen en microgliacellen, en de eliminatie van microglia door differentiële hechting. Vervolgens beschrijven we de cultuur van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerd medium (OCM). We bieden ook de kinetiek van OCM behandeling of oligodendrocyten naast gezuiverde hippocampal neuronen in co-cultuur experimenten, het bestuderen van oligodendrocyte-neuron interacties.

In dit protocol worden OL-lijncellen gezuiverd uit gliaculturen door astrocyten en microglia af te schudden. Zuiverheid en fenotypische onderzoek van OL-culturen kunnen worden beoordeeld door immunostaining met gliamarkers15. Analyse van de expressie van verschillende markers wees uit dat OL-culturen meestal pre-OLs waren met 90% ± 4% van De O4+ cellen, 85% ± 7% NG2+ cellen en 4,7% ± 2,1% plp+ cellen, terwijl 7,2% ± 2,5% van de cell...

Hierin tonen we een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyte-geconditioneerde medium dat kan worden gebruikt voor co-cultuur experimenten.

Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

In the central nervous system, oligodendrocytes are well-known for their role in axon myelination, that accelerates the propagation of action potentials ...

We beschrijven een efficiënte methode van oligodendroglial lijncellen zuivering en cultuur. Dit maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen aan te pakken die oligodendrocyten differentiatie en hun interacties met neuronen tijdens het myelineproces controleren. Deze schudtechniek is niet duur en is optimaal om een grote hoeveelheid oligodendrocyten te verkrijgen.Dergelijke culturen maken de productie van oligodendrocyten-geconditioneerde medium en co-culturen van oligodendrocyten met neuronen mogelijk. Multiple sclerose is een ziekte die wordt veroorzaakt door focale de-myelinatie in het centrale zenuwstelsel, secundair aan oligodendrocyten verlies. Oligodendrocyten cultuur bieden een instrument voor een beter begrip hoe re-myelinatie te bevorderen.Alleen oligodendroglial celcultuur zou inzicht kunnen geven in intrinsieke mechanismen die ontwikkelingen en biologie van oligodendrocyten reguleren. Co-culturen met neuronen maken het mogelijk om inzicht te krijgen in hun effecten op de neuronale fysiologie. Gebruik om te beginnen gebogen tangen om het hoofd van het dier op ooghoogte te houden.Gebruik kleine chirurgische schaar om een kleine incisie aan de basis van de schedel te maken en snijd de schedel na de hersenen middellijn. Gebruik tangen om voorzichtig afpellen van de twee delen van de schedel van de middellijn. Gebruik een kleine chirurgische lepel om de hersenen te verwijderen uit het hoofd holte.Zet de hersenen in een 60-millimeter petrischaal met ijskoude PBS glucose op ijs. Bekijken onder een stereo microscoop, gebruik fijne tangen om het cerebellum, de hersenstam, en de reuklampen te verwijderen uit de hersenhelften. Gebruik fijne tangen om de twee hersenhelften te scheiden.Gebruik fijne tangen af te pellen van de hersenvliezen. Zet de cerebrale cortices in een petrischaaltje van 60 millimeter op ijs. In een laminaire flow hood, gebruik een scherpe scalpel om fijn hakken de cerebrale cortices.Breng het gehaktweefsel over in een buis van 50 milliliter met enzymverteringsmedium. Incubeer gedurende 30 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Gebruik daarna een pipet om het enzymverteringsmedium voorzichtig te verwijderen en er tegelijkertijd voor te zorgen dat het corticale weefsel aan de onderkant van de buis blijft.Gebruik een P1000 micropipet om een milliliter DMEM 10%foetale kalfsserum toe te voegen en het weefsel voorzichtig te tritureren. Gebruik een 70-micron filter en de zuiger van een 1-milliliter spuit om het corticale weefsel te filteren in een 50-milliliter buis. Spoel het resterende weefsel op de binnenbandwand van de 50-milliliter buis meerdere malen met DMEM 10%foetale kalfsserum.Vul de buis van 50 milliliter met DMEM 10%foetaal kalfsserum. Centrifuge op 423 keer g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend de cel pellet met twee milliliter DMEM 10%foetale kalf serum.Triturate voorzichtig de celpellet met de P1000 micropipet en vervolgens met de P200 micropipet. Verdun de celsuspensie met het juiste volume van DMEM 10%foetaal kalfsserum. Plaat vijf milliliter van de celsuspensie op een T-150 kolf bij een dichtheid van één keer 10 tot de vijfde cellen per vierkante centimeter.Voeg 20 milliliter warme DMEM 10% foetale kalfsserum toe aan elke T-150 kolf. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Na het schudden van het monster 's nachts bij 250 rpm en 37 graden Celsius, oogst de supernatant in de kolf met voornamelijk oligodendrocyte lijncellen, maar ook, sommige microgliale cellen, en plaat op niet-gecoate 100-millimeter Petri gerechten.Incubeer de petrischaaltjes gedurende 15 minuten in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius en 5% kooldioxide. Dit maakt het verwijderen van microgliale cellen door differentiële snelle hechting op het oppervlak van de schotel. Vul ondertussen elke T-150-kolf met 25 milliliter warm, vers bereid kweekmedium en incubbate in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5% kooldioxide tot het tweede schudden.Breng vervolgens de supernatant van de petrischaaltjes over in nieuwe niet-gecoate petrischaaltjes van 100 millimeter om hechting van resterende microgliale cellen mogelijk te maken. De petrischaaltjes 15 minuten in een bevochtigde couveuse van 37 Graden Celsius onder 5% kooldioxide incubeer maken. Verwijder de supernatant van elke twee petrischaaltjes, die niet-aanhangende oligodendrocyte afstammingcellen bevatten, en breng het over in een buis van 50 milliliter.Gooi de petrischaaltjes verguld met microglia. Centrifugeren de buizen gedurende vijf minuten op 423 keer g. Verwijder voorzichtig de supernatant en resuspend de cel pellet met een milliliter van Bottenstein-Sato medium.Pool alle pellets in een gemeenschappelijke buis van 50 milliliter en pas het volume aan op 20 of 30 milliliter, afhankelijk van de celdichtheid met bottenstein-Sato medium. Plaat twee of drie voorgecoate petrischaaltjes van 100 millimeter met 10 milliliter van de celsuspensie. Incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide.Twee uur later, duidelijk het puin van de petrischaaltjes door het verfrissen van alle Bottenstein-Sato medium. Twee dagen incubeer in het medium in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%kooldioxide. Na twee dagen, onderzoek de cultuur onder een microscoop.In een laminaire stroomkap, onder steriele omstandigheden, vernieuw het kweekmedium met 10 milliliter warm MPB-27 laag medium. Twee dagen incubeer in een bevochtigde couveuse bij 37 graden Celsius onder 5%koolstofdioxide. Om de OCM te oogsten, verzamel je de supernatant met oligodendrocyten uitgescheiden factoren.Filter steriliseer de OCM met een filter van 0,22 micron. In dit protocol werden oligodendrocyten lijncellen gezuiverd uit gliaculturen door astrocyten en microglia af te schudden. Analyse van de expressie van verschillende markers gaf aan dat oligodendrocyten culturen waren meestal pre-oligodendrocyten met 90 plus of min 4%van O4 positieve cellen, 85 plus of min 7%NG2 positieve cellen, en 4,7 plus of min 2,1% van PLP positieve cellen, terwijl 7,2 plus of min 2,5% van de cellen waren GFAP positieve astrocyten.OCM geproduceerd uit dergelijke culturen werden toegevoegd op drie dagen in vitro aan gezuiverde hippocampal neuron culturen. Deze behandeling bevordert de clustering van notale eiwitten. Myelinatie van hippocampal neuronen werden bestudeerd door toevoeging van oligodendroctyes op 14 dagen in vitro.Van 20 tot 24 dagen in vitro, immuno kleuring van myeline markers, zoals myeline basiseiwit, toegestaan visualisatie van de myeline segmenten en knooppunten van Ranvier. Core PBS is belangrijk voor het verwijderen van hersenvliezen. De stevige clearing is van cruciaal belang voor oligodendroctyes levensvatbaarheid en het realiseren van de sterke punten van de stroom toegepast met de pipet.Oligodendrocyte-geconditioneerd medium kan worden toegevoegd aan neuronale culturen om inzicht te krijgen in de impact van oligodendroctyes uitgescheiden factoren op de neuronale fysiologie. Co-culturen van oligodendroctyes met neuronen kunnen ook worden uitgevoerd om het myelinatieproces te bestuderen.

generation-oligodendrocytes-oligodendrocyte-conditioned-medium-for-co

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel beschrijft methoden voor het afleiden van verrijkte populaties van muizen oligodendrocyt voorloper cellen (OPC's) in het primair cultuur, die een onderscheid te rijpen oligodendrocyten (OLS) te produceren. Daarnaast is dit rapport beschrijft technieken te produceren voor muriene myelinating co-culturen door zaaien muis OPC's op een bedje van neurieten muis dorsale wortel ganglion neuronen (DRGNs).

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Primaire, menselijke foetale hersenen-afgeleide, multipotentiële progenitorcellen...

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

This video demonstrates a detailed protocol for isolating the lateral ventricle walls from the adult mouse brain and performing enzymatic tissue dissociation to obtain single cells. These cells are then subjected to specific culture conditions that selectively enhance the proliferation of neural stem cells and promote their differentiation into co-cultures of oligodendrocytes and astrocytes.

Obtaining a Mixed Oligodendrocyte and Astrocyte Culture From Adult Mouse Neural Stem Cells

This video demonstrates the establishment of a co-culture of human induced neurons (iNs) and induced oligodendrocyte precursor cells (iOPCs). iNs are mixed with iOPCs in a co-culture and then incubated to support the maturation of both iNs into neurons and iOPCs into oligodendrocytes. Neurons form synaptic connections with other neurons and oligodendrocytes, while oligodendrocytes develop myelin sheaths around the neurons' axons.

A Co-culture Method to Model Neuron-Oligodendrocyte Interactions

The video demonstrates a protocol for differentiating oligodendrocyte precursor cells (OPCs) into oligodendrocytes and inducing myelination in a co-culture with dorsal root ganglion (DRG) neurons. The OPCs are transduced with lentiviral vectors encoding a signaling protein that regulates myelination. The transduced OPCs are co-cultured with DRG neurons to assess the differentiation into oligodendrocytes and the signaling protein-induced myelination.

An In Vitro Transduction-Induced Myelination Assay for Oligodendrocyte Precursor Cells

This video demonstrates the production of oligodendrocyte-conditioned medium (OCM) from oligodendrocyte lineage cells by stressing them to enhance their molecular release into the medium. This medium, which is rich in growth factors, cytokines, and other bioactive molecules, can be added to neuron cultures to gain insight into the impact of oligodendrocytes-secreted factors on neuronal physiology and connectivity.

A Method for Generating Oligodendrocyte-Conditioned Medium

This video demonstrates a technique for isolating and culturing oligodendrocyte precursor cells (OPCs) from the mouse pup brain cortex.

Isolating and Culturing Oligodendrocyte Precursor Cells from Mouse Pup Brain Cortex

Globoïde cellen zijn een typerend pathologisch kenmerk van de ziekte van Krabbe, een leukodystrofie waarvoor momenteel geen effectieve langetermijntherapie bestaat. We hebben een celkweekmodel ontwikkeld om de intrinsieke biologie en het pathogene potentieel van geactiveerde microglia en hun transformatie in globoïde cellen te bestuderen.

Een In Vitro Model voor de studie van cellulaire Pathofysiologie in globoid Cell Leukodystrophy

Hier presenteren we protocollen die een flexibele en strategische basis bieden voor het op een virale manier manipuleren van oligodendrocytenvoorlopercellen om eiwitten van belang overexpressie te laten vertonen met als doel hun rol in oligodendrocyten specifiek te onderzoeken via het in vitro model van centrale zenuwstelsel myelinisatie.

Productie en gebruik van Lentivirus om selectief transduce Primaire Oligodendrocyte Precursor Cellen voor In Vitro Myelination Testen

De neuron-gliale interacties bij neurodegeneratie worden niet goed begrepen als gevolg van ontoereikende hulpmiddelen en methoden. Hier beschrijven we geoptimaliseerde protocollen om geïnduceerde neuronen, oligodendrocytenvoorlopercellen en oligodendrocyten te verkrijgen uit menselijke pluripotente stamcellen en geven we voorbeelden van de waarden van deze methoden bij het begrijpen van celtypespecifieke bijdragen bij de ziekte van Alzheimer.

Generatie van menselijke neuronen en oligodendrocyten uit pluripotente stamcellen voor het modelleren van neuron-oligodendrocyteninteracties

We beschrijven de productie van gemengde culturen van astrocyten en oligodendrocytenvoorlopercellen afgeleid van foetale of volwassen neurale stamcellen die differentiëren in volwassen oligodendrocyten, en in vitro modellering van schadelijke stimuli. De koppeling met een celgebaseerde high-content screeningtechniek bouwt een betrouwbaar en robuust screeningsysteem voor geneesmiddelen op.

High-Content Screening Differentiatie en Rijpingsanalyse van foetale en volwassen neurale stamcel-afgeleide oligodendrocyten precursor celculturen

Leer een efficiënte methode voor de zuivering van oligodendrocyten en de productie van oligodendrocyt-geconditioneerd medium voor co-cultuurexperimenten met neuronen.

Generatie oligodendrocyten en oligodendrocyte-geconditioneerde medium voor co-cultuurexperimenten

Meer video's verkennen